REVISIÓN

Regulación de la mineralización ósea por factores inorgánicos y peptídicos

Regulation of Bone Mineralization by inorganic and peptide factors

 

Negri A.L.

Cátedra de posgrado en osteología, Instituto de Investigaciones Metabólicas. Universidad del Salvador, Buenos Aires

Correspondencia: Prof Armando Luis Negri, MD, FACP. Instituto de Investigaciones Metabólicas. Libertad 836, 1 piso, CABA 1012, Argentina. TE: (5411) 50319700. FAX: (5411) 50319703. negri@casasco.com.ar

Recibido: 31-05-2011
Aceptado: 19-07-2011

 

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RESUMEN

La mineralización ortotópica comienza con la producción de las vesículas de matriz, por brotación polarizada de la superficie de condrocitos, osteoblastos y odontoblastos. Esta transcurre en dos etapas. La primera es la formación de cristales de hidroxiapatita dentro de las vesículas de matriz, seguido por la propagación de la hidroxiapatita a través de la membrana de la vesícula dentro de la matriz extracelular. En la regulación de la mineralización ortotópica, aparte de las células tejido específicas, intervienen un gran número de enzimas, factores inorgánicos y peptídicos, que tienen complejas interacciones. Para que la mineralización normal continúe se necesita un ajustado balance entre los niveles de fosfato inorgánico (Pi) y de pirofosfato inorgánico (PPi) extracelular. El PPi antagoniza la habilidad del Pi para cristalizar con el calcio y formar hidroxiapatita y por lo tanto suprime su propagación. Se han identificado tres moléculas reguladoras centrales de los niveles extracelulares de PPi: la fosfatasa alcalina tejido-no específica (TNAP), que hidroliza el PPi, la nucleótido pirofosfato fosfodiesterasa 1 (NPP1), que genera PPi de nucleósidos trifosfato y la proteína transmembrana de múltiples-pasos ANK, que media la transferencia intracelular al extracelular de PPi. A su vez existen dos proteínas SIBLING llamadas DMP1 y MEPE reguladoras de la mineralización. La expresión de DMP1 por el osteocito se induce en forma marcada en respuesta a la carga mecánica incrementando la mineralización ósea. La proteína MEPE contiene un motivo peptídico proteasa resistente llamado ASARM, que se cree es un candidato a ser un inhibidor de la mineralización (minhibina). La osteropontina es otro inhibidor de la mineralización en su forma fosforilada y su secreción está marcadamente reducida en los ratones "knockout" para NPP1. Los datos actuales parecen sostener la hipótesis que estas moléculas podrían ser las transductoras del "strain" óseo y participar en la regulación de la mineralización del espacio osteocítico perilacunar.

El autor declara no poseer conflictos de interés.

Palabras clave: Mineralización; Regulación; Pirofosfato; MEPE; Osteocito

ABSTRACT

Orthotopic mineralization begins with the production of matrix vesicles that are produced by polarized budding of the surface of condrocytes, osteoblasts and odontoblasts. It occurs in two steps: The first one is the formation of hydroxiapatite crystals within the matrix vesicles, followed by the propagation of the hydroxiapatite crystals through the membrane vesicle into the extra cellular matrix. In the regulation of orthotopic mineralization, apart from tissue-specific cells, a great number of enzymes, inorganic and peptide factors participate, that have complex interactions among them. Inorganic pyrophosphate (PPi) antagonizes the ability of phosphate (Pi) to crystallize with calcium and to form hydroxiapatite, thus suppressing its propagation. For the normal mineralization to continue, an adjusted balance of the extra cellular Pi and PPi levels is needed. Three molecules have been identified that have a central role in the regulation of extra cellular PPi levels: tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), which hydrolyzes PPi, the nucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 (NPP1), which generates PPi from triphosphate nucleosides, and the multiple-steps transmembrane protein ANK which transfers PPi from the intracellular to the extracellular compartment. There are, in turn, two SIBLING proteins called DMP1 and MEPE that regulate mineralization. The expression of DMP1 by the osteocyte is dramatically induced in response to mechanical loading increasing bone mineralization. MEPE protein contains a protease resistant motif called ASARM, which is believed to be the candidate for the mineralization inhibitor (minhibin). Osteopontin is another mineralization inhibitor in its phosphorilated form and its secretion is markedly reduced in knockout mice for NPP1. Present data seem to support the hypothesis that these molecules could be the translators of bone strain and participate in the regulation of mineralization of the perilacunar osteocytic space.

No financial conflicts of interest exist.

Key words: Mineralization; Regulation; Pyrophosphate; MEPE; Osteocyte

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INTRODUCCIÓN

La biomineralización es el proceso por el cual los minerales son depositados en el interior o por fuera de una variedad de organismos⁽¹⁾. En los tejidos de los vertebrados el mineral se deposita en una forma de fosfato de calcio, la hidroxiapatita. La mineralización fisiológica ocurre en los tejidos duros, como el hueso, siendo este proceso altamente regulado por células tejido específicas⁽²⁾. En contraste, la calcificación heterotópica o calcificación de tejidos blandos puede ocurrir en el cartílago articular, en tejidos cardiovasculares como los vasos y en el riñón⁽³⁾, etc. En la regulación de la mineralización ortotópica, aparte de las células tejido específicas, intervienen un gran número de enzimas, factores inorgánicos y peptídicos, que tienen complejas interacciones y que son el motivo de esta revisión.

Las Vesículas de matriz en el proceso de mineralización ósea

Las vesículas de matriz son elementos vesiculares de 50 a 200 nm de diámetro revestidos de membrana que se producen por brotación polarizada de la superficie de condrocitos, osteoblastos y odontoblastos⁽²⁾. Las señales necesarias para la liberación de estas vesículas de matriz no se conocen con precisión, a pesar de que se presume que las concentraciones de calcio intracelular y fosfato extracelular podrían ser importantes.
La composición lipídica de las vesículas de matriz difiere de las de la membrana de las células de donde se originan. Estas vesículas de matriz son ricas en varios fosfolípidos, especialmente fosfatidilserina, un lípido con alta afinidad por el calcio⁽⁴⁾. Las vesículas de matriz son también ricas en anexinas A2 (II), A5 (V), y A6 (VI) y en Ca ATasa, calbindina D9K, anhidrasa carbónica, colágeno X, fosfatasa alcalina, pirofosfatasa fosfodiesterasa 1 (NPP1), el cotransportador Na/Pi III y PHOSPHO1^(2,3,5) (Gráfico1).

Gráfico 1. Vesícula de Matriz. Pi: fósforo; PPi Pirofosfato; TNAP: Fosfatasa alcalina tejido inespecifica: NPP1; nucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa 1; PCho: fosfatidilcolina; PEA: fosfatidil-etanolamina.

Etapas de la Mineralización

La mineralización ocurre en dos etapas⁽²⁾. La primera comienza con la formación de cristales de hidroxiapatita dentro de las vesículas de matriz, seguido por la propagación de la hidroxiapatita a través de la membrana de la vesícula dentro de la matriz extracelular.
Primera etapa: Los fosfolípidos ligadores de calcio como la fosfatidilserina, las proteínas ligadoras de calcio como la calbindina D9K y la sialoproteína ósea promueven la acumulación de calcio dentro de las vesículas de matriz^(2,6). Las anexinas en las vesículas de matriz forman canales de calcio que incorporan calcio dentro de las vesículas^(5,7). El fosfato inorgánico (Pi) es provisto por el cotrasportador Na/Pi tipo III que se encuentra tanto en la membrana de las células originadoras de vesículas como en las mismas vesículas de matriz^(8,9). La fosfatasa citosólica PHOSPHO1 también produce fosfatos hidrolizando fosfocolina y fosfoetanolamina que derivan de los fosfolípidos de membrana por la fosfolipasa C^(10-11). Cuando la acumulación de calcio y fósforo excede el punto de solubilidad para el fosfato de calcio (CaPO₄) éste se deposita en la forma de hidroxiapatita en las vesículas.
Segunda etapa: El cristal de hidroxiapatita generado en la primera etapa penetra la pared de membrana de la vesícula de matriz y se elonga dentro del espacio extracelular de la matriz. El fluido extracelular contiene suficiente calcio y fósforo inorgánico para soportar la formación continua de nuevos cristales de hidroxiapatita. Ésta se propaga en acúmulos alrededor de las vesículas de matriz rellenando el espacio entre las fibrillas de colágeno presentes en la matriz^(12,13). La propagación de los cristales de hidroxiapatita depende críticamente de la relación entre Pi y el pirofosfato inorgánico (PPi), ya que este último inhibe la formación de la hidroxiapatita.

Reguladores de la biomineralización
Reguladores inorgánicos: Relación
Fosfato /Pirofosfato

La exposición de los cristales de hidroxiapatita al medio extracelular permite que continúe el crecimiento y proliferación de los cristales^(13-15). El PPi antagoniza la habilidad del Pi para cristalizar con el calcio y formar hidroxiapatita y por lo tanto suprimir la propagación del cristal de hidroxiapatita. Para que la mineralización normal continúe se necesita un ajustado balance entre los niveles de Pi y de PPi extracelular. (Gráfico 2)

Gráfico 2. Interacción entre las vesículas de matriz y los osteoblastos. Pi: fósforo; PPi Pirofosfato; TNAP: Fosfatasa alcalina tejido inespecífica: NPP1; nucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa; OPN: osteopontina; MEPE: fosfoglicoproteína de Matriz Extracelular.

Se han identificado tres moléculas que son reguladores centrales de los niveles extracelulares de PPi y Pi: la fosfatasa alcalina tejido-no específica (TNAP), que hidroliza el PPi^(16-20), la nucleótido pirofosfato fosfodiesterasa 1 (NPP1), que genera PPi de nucleósidos trifosfato^(21-23), y la proteína transmembrana de múltiples-pasos ANK, que media la transferencia de intracelular a extracelular del PPi^(24,25). Tanto la TNAP como la NPP1 están localizadas en las vesículas de matriz pero no la ANK.
La TNAP es un importante promotor de mineralización porque cataliza la hidrólisis del PPi disminuyendo por lo tanto, las concentraciones de este inhibidor de la calcificación, mientras que concomitantemente incrementa los niveles de Pi. En los ratones en los cuales se ha inactivado el gen de la TNAP (Akp2−/−) se producen alteraciones que se parecen a la forma más severa de hipofosatasia, una enfermedad caracterizada por raquitismo, osteomalacia, fracturas óseas espontáneas e incremento en los niveles de PPi^(26,27). Las preparaciones esqueléticas de ratones Akp2−/− muestran pobre mineralización en los huesos parietales, escápulas, vértebras y costillas^(28-30). La NPP1 funciona como una inhibidora fisiológica de la calcificación, por lo menos en parte, al generar PPi^(21-23,31). A los niños con deficiencia severa de NPP1 se los ha asociado recientemente al síndrome de calcificación arterial y periarticular espontánea infantil^(32,33). Los ratones "knockout" para NPP1 (Enpp1−/−) también conocidos como "tiptoe walking (ttw/ttw) mice", desarrollan en forma espontánea anquilosis progresiva intervertebral, hiperostosis periférica articular y calcificación del cartílago articular^(34-37). A pesar de la manera diferente por la cual la NPP1 y la ANK proveen PPi a la matriz ósea, un fenotipo similar se asocia con una mutación de truncado del dominio citosólico C-terminal del ANK, que ocurre naturalmente y que aparece atenuar la canalización extracelular del PPi en el ratón mutante ank/ank^{(24, 25,38)}. Por lo tanto, los ratones deficientes en NPP1 (Enpp1−/−), o con trastornos en la función de canalización del PPi del ANK (ank/ank), tienen disminuciones en los niveles de PPi extracelular y están hipermineralizados. Los ratones deficientes en TNAP, NPP1 y ANK tienen todos niveles alterados de PPi y por lo tanto estos ratones son herramientas muy valiosas para comprender con más profundidad la función del PPi en el proceso de mineralización ósea.
En la comprensión del proceso de biomineralización es muy importante no solo cómo los osteoblastos y los condrocitos elaboran y disponen del PPi, sino también que efectos tiene el PPi sobre las células formadoras de hueso, en particular la expresión génica en los osteoblastos. El entrecruzamiento de ratones "knockout" para fosfatasa alcalina (Akp2−/−) y NPP1 (Enpp1−/−) se produce un rescate de los niveles de PPi con respecto los animales con una sola deficiencia, resultando en una corrección del defecto de mineralización⁽²⁰⁾. Dada la similitud de función de NPP1 y ANK y también la similitud en el fenotipo de los ratones deficientes, el entrecruzamiento de ratones Akp2−/− con ratones ank/ank produce una normalización parcial del fenotipo de mineralización y de los niveles de PPi. Al examinar los ratones Enpp1−/− y ank/ank se observa que los ratones Enpp1−/− tienen un fenotipo más severamente hipermineralizado que los ratones ank/ank, ya que la NPP1 pero no la ANK se localiza en la vesículas de matriz, sugiriendo que la falla de la deficiencia de ANK para corregir la hipomineralización del ratón Akp2−/− refleja la falta de actividad ANK, en el compartimiento de la vesícula de matriz.

Reguladores peptídicos de la mineralización: La hipótesis de los péptidos ASARM

El ratón Hyp presenta una enfermedad similar al raquitismo hipofosfatémico ligado al X (XLH) de los humanos. Tanto el ratón Hyp como el XLH son causados por mutaciones del gen PHEX (del inglés Phosphate regulating gene with homologuies to endopeptidases on the chromosome X) que codifica la enzima Phex, un miembro de la familia de la enzima convertidora de endotelina, que son endopeptidasas localizadas en la parte externa de la membrana celular⁽³⁹⁾. Tanto los ratones Hyp como los pacientes con XLH presentan un defecto de mineralización ósea. Se ha hipotetizado que los ratones Hyp producen un factor secretado desconocido llamado Minibina, que inhibiría la mineralización de la matriz extracelular. La Minibina sería teóricamente un substrato de la enzima Phex, que se presume se acumularía en el hueso de los ratones Hyp y en los humanos con la enfermedad XLH⁽⁴⁰⁾. Existe otra enfermedad que tiene un fenotipo similar al de la XLH que es el raquitismo autosómico recesivo (ARHR). Esta enfermedad al igual que el XLH presenta raquitismo/osteomalacia, hipofosfatemia y regulación anormal del calcitriol, esto debido a niveles elevados de una fosfatonina ósea el FGF23. El ARHR es causado por mutaciones inactivadoras de la proteína extracelular de matriz llamada DMP1 (Dentin Matriz Protein 1), que pertenece a las llamadas proteínas SIBLING (del Ingles Small integrin-binding ligand N-linked glicoprotein)⁽⁴¹⁾. Ambas enfermedades (XLH y ARHR) tienen elevado el FGF23 de origen osteocítico, lo que sugiere la presencia de una vía paracrina/endocrina que coordinaría el proceso de mineralización óseo con la reabsorción renal de fósforo.
Existe otra proteína SIBLING llamada MEPE (del Inglés Matrix Extracellular phosphoglycoprotein) también llamado MGP (Matrix Gla Protein). MEPE contiene un motivo peptídico proteasa resistente llamado ASARM (del inglés Acidic serine-aspartate-rich-motief) que se cree es un candidato para la elusiva minhibina⁽⁴²⁾. La idea de que MEPE es una fuente de minhibina surge de observaciones en que la inactivación del Phex en el ratón Hyp se asocia con un incremento en la proteólisis del MEPE y la liberación de péptidos ASARM que acumulados en la matriz extracelular inhiben el proceso de mineralización⁽⁴³⁾. Además, estos péptidos ASARM parecerían ser degradados por la ectopeptidasa Phex, lo cual contribuiría más a su acumulación en la ausencia de Phex⁽⁴⁴⁾. Otros estudios demuestran que anticuerpos anti-ASARM o péptidos solubles derivados del Phex secuestran ASARM y corrigen la mineralización defectuosa de los osteoblastos derivados de Hyp y células del estroma medular óseo "in vitro"⁽⁴⁵⁾. La relevancia de MEPE con respecto al hueso se sustenta por el mapeo de un loci de densidad mineral ósea en humanos al 4q21.1, una región donde se encuentra localizado el gen del MEPE en humanos⁽⁴⁶⁾ y un pequeño incremento de la densidad ósea con la edad en el ratón null para MEPE⁽⁴⁷⁾. Finalmente la sobreexpresión de MEPE en ratones, bajo el control del promotor col1a1, lleva a un incremento de MEPE y niveles de ASARM en hueso asociándose a mineralización defectuosa.
Recientemente, se ha demostrado la importancia de la modificación postranslacional para la actividad sitoespecífica de la actividad de MEPE y sus péptidos ASARM. La proteína intacta fosforilada fue un efectivo promotor de mineralización, mientras que el péptido ASARM fue un efectivo inhibidor. Cuando se defosforilaron ambos la proteína intacta como el péptido ASARM no tuvieron efecto sobre la mineralización⁽⁴⁸⁾.

Regulación de los factores peptídicos por pirofosfato y fósforo

La osteopontina (OPN) es otra proteína inhibidora de la mineralización que esta incrementada en los ratones Akp2−/−, y disminuida en los ratones ank/ank. Los niveles de PPi y OPN se normalizan en los ratones doble knockout [Akp2−/−; Enpp1−/−] y [Akp2−/−; ank/ank], tanto a nivel del ARNm como a nivel del suero⁽⁴⁹⁾. Los osteoblastos del ratón Wild-type tratados con PPi muestran un incremento en OPN, y una disminución en la expresión Enpp1 y Ank. Por lo tanto TNAP, NPP1, y ANK en forma coordinada regulan los niveles PPi y OPN. La hipomineralización observada en los ratones Akp2−/− surge de los efectos inhibitorios combinados de PPi y OPN. En contraste, las deficiencias de NPP1 o ANK causan una disminución en los pools de PPi y OPN que llevan a hipermineralización. No se conoce la forma en que el PPi regula el gen de osteopontina y se desconoce si existen receptores celulares para PPi.
La expresión de varios genes que codifican proteínas reguladoras de la mineralización específicos de células óseas, como la DMP1, la osteopontina y la matrix-gla-proteína, son estimulados por el fósforo a nivel trascripcional, mientras que la expresión de TNAP es suprimida^(50-52). La captación celular de fósforo por trasportadores especializados parece ser un requerimiento indispensable, ya que la adición del ácido fosfonofórmico (forscarnet), un inhibidor del cotrasportador sodio/fosfato, bloquea estos efectos del fósforo^(52-54). Los efectos posteriores que resultan en la supresión de TNAP puede requerir de señalización la proteína morfogenética ósea, como se ha visto en las células de estroma medular óseo ST-2 de ratones⁽⁵⁵⁾. En contraste, en células ATDC5, la señalización del fosfato depende de la vía p42/p44- MAPK (mitogen activated protein kinase) / ERK (extracellular signal-regulated kinase)⁽⁵⁶⁾. En forma similar la inducción de osteopontina y matrix-gla-proteína requieren de la activación de la vía p42/p44-MAPK/ERK y puede ser bloqueada por el UO126, un inhibidor específico de MAPK/ERK kinasa^(57,58).
Regulación de la mineralización en el espacio lacuno canalicular osteocítico
Las proteínas SIBLINGs, DMP1, MEPE y osteopontina como mencionáramos anteriormente, han mostrado jugar un rol importante en la regulación de la mineralización ósea. DMP1 y MEPE se encuentran expresadas por los osteoblastos (en etapas tardías) y osteocitos que están localizados en los canalículos y paredes de las lagunas osteocíticas. En contraste con la DMP1, la MEPE parece ser un regulador negativo de la mineralización ya que el ratón nulo para MEPE, tiene un incremento en la densidad mineral ósea(59). Los péptidos ASARM, productos del clivaje de la MEPE pueden bloquear en forma directa la mineralización tanto "in vitro"⁽⁶⁰⁾ como "in vivo"⁽⁶¹⁾. Los datos actuales parecen sostener la hipótesis que estas moléculas podrían ser las transductoras del "strain" óseo y participar en la regulación de la mineralización del espacio perilacunar. El modelo propuesto sería el siguiente: los fragmentos ASARM derivados del MEPE reducirían el contenido mineral local en la zona perilacunar mientras que la DMP1 haría lo opuesto, sería un regulador positivo de la mineralización en el mismo sitio^(62-64).
El ratón null para Dmp1 provee un buen modelo para entender cómo estos genes y sus productos están asociados al proceso de mineralización. DMP1 es una proteína acídica rica en serinas, que tiene numerosos sitios potenciales de fosforilación que promueven la formación de mineral en las superficies perilacunares^(65,66). La proteína completa de DMP1 es susceptible de clivaje proteolítico resultando en la generación de fragmentos específios N-terminales y C-terminales. A pesar de ello, las funciones biológicas de la molécula intacta versus los fragmentos todavía no es clara. Si bien está establecido en estos ratones que DMP1 no es esencial para la mineralización, en el desarrollo temprano⁽⁷⁾, los ratones muestran notables defectos en la morfología osteocítica, el remodelado óseo y la mineralización durante el desarrollo posnatal cuando el esqueleto soporta carga mecánica^(63-65,66). Estos estudios han confirmado que la pérdida del DMP1 resulta en profundos cambios tanto la estructura del osteocito, como en la mineralización ósea total^(67-71) y están en acuerdo con estudios previos en animales adultos del tipo silvestre, donde la expresión de DMP1 por el osteocito se induce en forma marcada, en respuesta a la carga mecánica inducida por la remodelación ósea^(72,73). Tomados en conjunto, los datos emergentes sugieren que las proteínas SIBLINGs controlan el grado de mineralización en la interfase de las superficies óseas que revisten el espacio lacuno-canalicular. Una hipótesis posterior sugiere que el grado de mineralización dicta la flexibilidad del osteocito, alterando a la inducción mecánica y como transmite señales que regulan la remodelación activa de la superficie ósea.
La esclerostina es una proteína reguladora de la formación ósea que está expresada "in vivo" en los osteocitos sumergidos en el mineral óseo. Recientemente, se evaluó la hipótesis de que la esclerostina podía regular la conducta de las células activamente comprometidas en la mineralización del hueso maduro, los preosteocitos⁽⁷⁴⁾. Cultivos primarios de osteoblastos humanos que fueron expuestos a esclerostina recombinante humana (rhSCL) por 35 días, mostraron una inhibición dosis- y tiempo-dependiente de la mineralización "in vitro", siendo los cultivos mas tardíos los más respondedores en términos de mineralización y expresión génica. El tratamiento de los cultivos avanzados con rhSCL aumentó en forma marcada la expresión del marcador preosteocítco E11 y disminuyó la expresión de los marcadores maduros, DMP1 y SOST. En forma concomitante, la expresión de MEPE se incrementó por la administración de rhSCL tanto a nivel del mRNA como de la proteína, mientras que el PHEX disminuyó, implicando una regulación a través del eje MEPE-ASARM. Estos autores confirmaron que la mineralización por osteoblastos humanos es exquisitamente sensible a péptidos ASARM trifosforilados. La inmunomarcación reveló que la rhSCL incrementó los niveles endógenos de MEPE-ASARM. La neutralización mediada por anticuerpos de los MEPE-ASARM endógenos antagonizaron en forma notable el efecto de la rhSCL sobre la mineralización, como hizo el péptido sintético PHEX, SPR4. Finalmente, encontraron que la expresión elevada del ARNm del Sost en los huesos largos de ratones HYP, sugieren que la esclerostina puede conducir los niveles incrementados de péptidos MEPE-ASARM y producir los defectos de mineralización que se observan en este genotipo. Por lo tanto estos resultados sugieren que la esclerostina actuaría a través del eje PHEX/MEPE a nivel de la etapa preosteocito y sería un regulador principal de la mineralización ósea fisiológica, consistente con su localización "in vivo" y su rol establecido en la inhibición de la formación ósea.

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