TRABAJO ORIGINAL

Receptor de estrógenos: variantes genéticas del ESR1 y parámetros bioquímicos de riesgo cardiovascular

Estrogen Receptor: Polymorphisms of ESR1 and Biochemical Markers of Cardiovascular Risk

 

Rauschemberger MB¹², Polini NN¹, Sola MO³, Bonacorsi SM³, Massheimer VL^1,2

¹ Cátedra de Bioquímica Clínica II, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur. San Juan 670, B8000ICN, Bahía Blanca, Buenos Aires, Argentina.
²CONICET.
³Servicio de Medicina Nuclear, Hospital Interzonal Dr. José Penna, Bahía Blanca, Buenos Aires, Argentina

San Juan 670, B8000ICN Bahía Blanca, Pcia. de Buenos Aires, República Argentina, Tel: 0291-4595101 Int. 2417 - e-mail: massheim@uns.edu.ar

Correspondencia: Virginia Massheimer, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur.

Recibido: 17-01-2012
Aceptado: 05-03-2012

 

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RESUMEN

El estudio de la asociación entre marcadores genéticos y signos clínicos y/o bioquímicos de determinadas patologías, se ha propuesto para evaluar la posible utilidad clínica de emplear las determinaciones genéticas como predictores de riesgo. La enfermedad cardiovascular es una de las principales causas de muerte en mujeres posmenopáusicas en el mundo occidental, hecho atribuido al descenso de los niveles de estrógenos circulantes. El objetivo de este trabajo fue investigar la existencia de asociaciones entre los polimorfismos del gen del receptor de estrógenos ESR1 (PvuII y XbaI) y los marcadores bioquímicos de riesgo cardiovascular en una población local de mujeres sanas fértiles y posmenopáusicas. Se clasificó a ambas poblaciones en subgrupos según el marcador genético 1(P/p), 2(p/p), 3(P/P), A(X/x), B(x/x), C(X/X), donde P/X indica ausencia de corte y p/x indica presencia de corte para PvuII y XbaI respectivamente. En una muestra de sangre periférica, se determinaron parámetros bioquímicos de perfil lipídico, hemostasia e inflamación y se compararon fértiles vs. posmenopáusicas agrupadas según el genotipo. Las mujeres posmenopáusicas con genotipo A presentaron un aumento significativo en los niveles de colesterol total; C-LDL y triglicéridos respecto a las fértiles. En el subgrupo 1 se detectaron cambios solo en CT y C-LDL. En el haplotipo 1A de posmenopáusicas solo se evidenció aumento en colesterol total. Los parámetros de la hemostasia y de inflamación no mostraron cambios significativos entre fértiles y posmenopáusicas en función del marcador genético presente. Los resultados sugieren que, el genotipo A identifica a la población de mujeres posmenopáusicas con un perfil lipídico más desfavorable respecto a las fértiles del mismo subtipo.

Los autores declaran no poseer conflictos de interés.

Palabras clave: Polimorfismos; Menopausia; Enfermedad cardiovascular; Perfil lipídico; Receptor estrógenos

ABSTRACT

In the last few years, the study of the association between genetic markers and clinical or biochemical signs of certain diseases, has been proposed to assess whether genetic determinations would be useful as risk predictors. Cardiovascular disease is a major cause of death in postmenopausal women in the Western world, fact attributed to the decline in circulating estrogen levels. The aim of the present study was to investigate the existence of associations between polymorphisms of the estrogen receptor ESR1 (PvuII and XbaI) and biochemical markers of cardiovascular risk, in a local population healthy childbearing potential and postme-nopausal women. Both populations were classified into subgroups according to the presence of specific genetic markers as follows: 1 (P / p), 2 (p / p), 3 (P / P), A (X / x), B (x / x), C (X / X), where P/ X = no cut site, and p / x = presence of cut site to restriction enzymes PvuII and XbaI respectively. In a peripheral blood sample biochemical markers of lipid profile, hemostasis and inflammation were determined, and comparisons were performed between fertile and postmenopausal women, grouped according to each genotype. Postmeno-pausal women with genotype A showed a significant increase in total cholesterol, LDL-C and triglycerides when compared women of childbearing potential with genotype A. In the subgroup 1, statistical changes in CT, C-LDL were detected. When haplotype analysis was performed, only one biochemical marker exhibited changes. In postmenopausal women positive to 1A haplotype, total cholesterol was slightly increased as compared to 1A haplotype women of childbearing potential. Hemostasis and inflammation markers did not show significant changes between women of childbearing potential and postmenopausal women grouped according to the polymorphism present. The results suggest that genotype A identifies the population of postmenopausal women population with a less favourable lipid profile compared to women of childbearing potential subtype.

No financial conflicts of interest exist.

Key words: Polymorphisms; Menopause; Vascular disease; Estrogen receptor; Lipid profile

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INTRODUCCIÓN

La enfermedad cardiovascular es una de las principales causas de muerte en mujeres posmenopáusicas del mundo occidental, hecho atribuido al descenso de los niveles de estrógenos circulantes ⁽¹⁾. Es una enfermedad inflamatoria que se asocia con alteraciones del perfil lipidico, del metabolismo de hidratos de carbono, de la hemostasia, y la presencia en circulación de marcadores de inflamación vascular^(2-4).

En las mujeres posmenopáusicas, los niveles de colesterol total y el colesterol transportado por la lipoproteina de baja densidad (C-LDL) están aumentados comparado con los hallados en las mujeres premenopáusicas. En cambio el transportado por la lipoproteina de alta densidad (C-HDL) tiende a mantener su nivel circulante o disminuir levemente^(5,6). En relación a los triglicéridos se han observado aumentos de alrededor del 16 %, lo que podría estar vinculado con el incremento en los depósitos de grasa abdominal y la resistencia a la insulina⁽⁷⁾.

El proceso de la hemostasia abarca la coagulación y fibrinólisis de la sangre, ambas etapas se alteran en la menopausia. La trombina es la principal enzima que se genera al final de la coagulación, activa a los factores XI, XIII, plaquetas y a los cofactores V y VIII transformando el fibrinógeno en fibrina. Durante la menopausia, las mujeres tratadas con terapia hormonal de reemplazo (THR) combinada, experimentan una disminución en el tiempo de protrombina (TP), aumento del Factor VII, sin cambios en el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) y tiempo de trombina (TT). El fibrinógeno es una proteina clave del sistema de la coagulación. Interviene en la hemostasia primaria a través de su unión a la glicoproteina IIb/IIIa plaquetaria y en la fase final de la coagulación sanguinea en la que se transforma en fibrina soluble. Los estudios sobre el fibrinógeno han tenido un creciente interés, por considerarse que los niveles elevados se asocian con riesgo cardiovascular, aumento de la incidencia de cardiopatías isquémicas y de accidentes cerebrovasculares⁽⁸⁾.

La proteína C reactiva es un marcador validado de inflamación endotelial y ha sido propuesto como un factor injuriante perteneciente al gran número de proteínas de fase aguda. El estudio Women Health Study, demostró que en mujeres, la PCR es mejor predictor de enfermedad cardiovascular que el colesterol de LDL^(9,10).

Debido al rol central que se atribuye al hipoestrogenismo en la aparición de disfunciones posmenopáusicas, en la actualidad se propone la posible existencia de asociaciones entre las variantes moleculares de los receptores de estrógenos (RE) y los trastornos posmenopáusicos. Existen dos variantes del receptor de estrógenos, las formas moleculares a y b (ERa y ERb). El ERa es codificado por el gen ESR1 localizado en el cromosoma 6q25 y compuesto por 8 exones y 7 intrones con un tamaño total de 140 kilobases. El ERa se expresa en numerosas células del organismo, y en particular en el sistema vascular en células endoteliales, células musculares lisas y cardiomiocitos⁽¹¹⁾. En las últimas décadas, numerosos polimorfismos del gen ESR1 se han relacionado con riesgo de contraer patologías prevalentes en la menopausia como mamarias, óseas y cardiovasculares^(12-16). La mayoría de las variantes polimórficas descriptas se localizan en el intrón 1, siendo los más estudiados los polimorfismos de restricción PvuII y XbaI. Corresponden a variantes de nucleótido simple ubicadas en la región cercana al inicio del exón 2. El estudio de asociaciones entre marcadores genéticos y clínicos es un área de incipiente progreso en la comunidad científica internacional. A nivel nacional y local la información sobre la relación entre variantes genéticas del receptor de esteroides sexuales y enfermedad cardiovascular es escasa.

En nuestro laboratorio hemos desarrollado una línea de investigación que demostró que a nivel vascular la activación del receptor de estrógenos (RE) por E₂ y E₁ participa en la regulación de procesos celulares y moleculares vinculados a la homeostasis vascular, específicamente modulando la producción de compuestos vasoactivos, el crecimiento, proliferación y apoptosis celular, la migración y la adhesión de monocitos y plaquetas a la superficie vascular^(17-20).

El objetivo de este trabajo fue investigar, en una población local de mujeres sanas fértiles y posmenopáusicas, la existencia de asociaciones entre los polimorfismos del gen ESR1 (PvulI y Xbal) y los marcadores bioquímicos de enfermedad cardiovascular.

MATERIALES Y MÉTODOS Población

La población estuvo formada por 70 mujeres sin antecedentes previos de enfermedad (39 fértiles y 31 posmenopáusicas), las cuales asistieron al Servicio de Medicina Nuclear del Hospital Interzonal Dr. José Penna de la ciudad de Bahía Blanca. El estudio fue aprobado por los Comité de Ética y Docencia Investigación Clínica de la mencionada entidad hospitalaria. Cada participante recibió información oral y escrita en relación al proyecto, comprendió el motivo de su participación, completó una encuesta y firmó el consentimiento informado.

Criterios de inclusión

Fértiles: Mujeres con ciclos menstruales regulares y edad promedio comprendida entre 21 y 45 años.

Posmenopáusicas: Mujeres que han dejado de menstruar por causas naturales y por un período mayor o igual a 1 año. Edad promedio mayor o igual a 48 años (FSH>40 mUI/mL, E₂ <20 pg/mL).

Criterios de exclusión

Embarazo

Menopausia precoz (mujeres menores de 40 años, con amenorrea de 3 a 6 meses con valores plasmáticos de FSH > 40 mUI/L)

Infarto de miocardio reciente

Relación de cosanguineidad entre participantes Diagnóstico y/o tratamiento médico para enfermedades crónicas.

Toma de muestra

Todas las mujeres concurrieron a la entrevista con un ayuno no inferior a las 12 horas. En el caso de mujeres fértiles se registró la fecha de la última menstruación y la muestra se extrajo dentro de los primeros cinco días del ciclo.

Se procedió a extraer las muestras de sangre entera de la vena antecubital. El espécimen de sangre se dividió en tres alícuotas: a) la primera en tubos secos con bolillas aceleradoras de la coagulación, destinada a las determinaciones hormonales (Estradiol, FSH); colesterol total, LDL, HDL, triglicéridos y PCR ultrasensible; b) la segunda en tubos estériles con EDTA como anticoagulante fue destinada a los estudios genéticos; c) la tercera en tubos con citrato de sodio como anticoagulante destinada a las determinaciones de los parámetros de la hemostasia (TP APTT, TT y Fibrinógeno).

Determinaciones bioquímicas

Estradiol y FSH: se determinaron empleando inmunoensayos (Siemmens)

Colesterol total (CT), HDL- Colesterol (CT-HDL), LDL- Colesterol (CT-LDL): se utilizaron equipos comerciales diagnósticos Wiener lLb Group.

Triglicéridos (TG): se utilizó equipo comercial diagnóstico Biosystem.

Tiempo de Protrombina (TP), Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT); Tiempo de Trombina (TT): se midieron por métodos coagulométricos empleando equipos comerciales diagnósticos de Roche Lab. Las mediciones se realizaron en un coagulómetro semiautomático STA 2 de Stago (Francia).

Fibrinógeno plasmático funcional: Se emplearon equipos comerciales Fibri Prest® de Diagnóstica Stago.

Proteína C reactiva ultrasensible (PCRu): Método inmunoturbidimétrico con partículas de latex recubiertas con anticuerpos anti-PCR, utilizando equipo comercial diagnóstico de Wiener Lab Group.

Obtención de ADN: Se hemolizaron los eritrocitos empleando Buffer de lisis de glóbulos rojos y se lavaron los leucocitos (Tris/ HCl pH 7,6 10 mM , Sacarosa 0,32M, MgCl2 5 mM, Tritón X-100 1 %). Se digirió el pellet con proteinasa K (Tris/HCl pH 8 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, proteinasa K 1 mg/mL). Posteriormente, se procedió a realizar extracción con fenolcloroformo-alcohol isoamílico y precipitación con etanol.

Cuantificación del ADN: se realizó por espectrofotometría obteniendo la relación de las absorbancias 260:280 y por electroforesis en geles de agarosa con bromuro de etidio.

PCR y polimorfismos de restricción (RFLPs): Se amplificaron 100 ng de ADN en un volumen final de 50 mL, empleando 20 pmol de cada primer, 200 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2 y 0,25 U de Taq DNA polymerase (Promega, Madison, USA) bajo las siguientes condiciones: I) 94 °C; 5 min; II) 30 ciclos a 94 °C (30 s), 61 °C (40 s), y 72 °C (1 min 30 seg); III) 72 °C, 2 min. El producto de amplificación se sometió a cortes con las enzimas de restricción (PvuII y XbaI), a 37 °C durante 3 horas. Los fragmentos de restricción se analizaron empleando geles de agarosa al 2 %.

Procesamiento estadístico de la información Se empleó ANOVA, la prueba t de Student para los parámetros con varianzas semejantes y el test U- Mann-Whitney para varianzas diferentes. Se utilizó el software SSPS versión 10.0 para Windows. Nivel de significación p<0,05^(21,22).

Los niveles séricos de E₂ y FSH obtenidos en cada grupo poblacional, fueron concordantes con los criterios de selección establecidos.

Se determinaron los parámetros bioquímicos descriptos en metodología en cada una de las poblaciones estudiadas. La tabla II muestra que el grupo MPM presentó aumentos significativos en los niveles de CT, C-LDL y TG respecto a las MF (12, 23 y 44 % respectivamente; p<0,02). Los parámetros restantes (CT-HDL, glucemia, TP, APTT, TT y Fbg) no presentaron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos. La PCRu mostró una distribución diferente en ambas poblaciones (Tabla II).

Mediante la técnica PCR-RFLP se estudiaron las variantes polimórficas PvuII y XbaI del ESR1. La figura 1 muestra un esquema de la localización de los polimorfismos estudiados ubicados en el intrón 1 del gen ESR1. Los genotipos se clasificaron según presencia o ausencia de corte para la respectiva enzima de restricción. Para PvuII se clasificaron como 1(P/p), 2(p/p), 3(P/P), donde P= ausencia de corte p= presencia de corte. Para XbaI la clasificación fue: A(X/x), B(x/x), C(X/X), siendo X=ausencia de corte y x=presencia de corte. Del estudio genético realizado se obtuvieron las siguientes frecuencias de distribución

Figura 1. Localización de los polimorfismos PvulI y Xbal en el intrón 1 del gen ESR1. Esquema del cromosoma 6 y la localización del gen ESR1 en el brazo q. Se indica la posición de las variantes polimórficas analizadas ubicadas en el intrón 1.

RESULTADOS

La Tabla I muestra las características de la población objeto del estudio. Como puede observarse, no se detectaron diferencias estadísticamente significativas en peso, altura e índice de masa corporal (IMC) entre las poblaciones de mujeres fértiles (MF) y mujeres posmenopáusicas (MPM). genotípicas en la población analizada: genotipos 1 = 78 %; 2 = 15 %, 3 = 7 %, A=85 %, B = 10 %, C=5 % (Figura 2).

TABLA I. Características de la población. Se muestran los valores medios de edad, peso altura e IMC de la población estudiada. Las determinaciones de FSH y estradiol se realizaron como se describen en Materiales y métodos.

TABLA II. Valores del perfil lipídico, hemostasia y marcador de inflamación hallados. La población general se dividió en fértiles (F) y posmenopáusicas (PM) y en cada uno de los subgrupos se determinaron los parámetros bioquímicos como se describe en Materiales y métodos. * p<0,02.

 

Figura 2. Frecuencia de variantes polimórficas PvulI yXbal del ESR1 en la población total estudiada. Los genotipos se analizaron como se indica en Materiales y métodos (P, X= ausencia de corte; p,x= presencia de corte).

Las MF y MPM se agruparon en subpoblaciones según el genotipo que presentaron. Se compararon los resultados obtenidos en las determinaciones de los parámetros bioquímicos, entre MF vs. MPM pertenecientes a cada subgrupo. Como puede observarse en la Tabla III, para el genotipo 1 (MF₁ vs. MPM₁) se detectó un aumento significativo en los niveles de CT y C-LDL (16 y 24 % respectivamente) en las posmenopáusicas respecto a las fértiles (p<0,02).

TABLA III. Comparación de parámetros bioquímicos en subpoblaciones con genotipo 1. El análisis de los genotipos y las determinaciones bioquímicas se realizaron como se describen en Materiales y métodos. *p<0,02.

En los subgrupos con genotipo A del marcador XbaI se observó que las MPM_A presentan incrementos semejantes en CT y CT-LDL a los descripto para MPM₁, pero además exhiben un aumento en los niveles de TG (43 %, p<0,02) en subpoblación MPM_A respecto de MF_A (Tabla IV).

 

TABLA IV. Comparación de parámetros bioquímicos en subpoblaciones con genotipo A. Los estudios de genotipo y las determinaciones bioquímicas se realizaron como se describen en Materiales y métodos. * p<0,02.

Al analizar el haplotipo 1A, se determinó que a diferencia de lo observado en los genotipos A o 1, las MPM_1A muestran solo aumentos significativos en los niveles de CT respecto a las MF_1A (Tabla V).

TABLA V. Comparación de parámetros bioquímicos en subpoblaciones con haplotipo 1A. Se agrupó a la población en función de la presencia de los genotipos 1 y A y se la clasificó en subgrupos F(1A) y PM (1A). Las determinaciones bioquímicas se realizaron como se describen en Materiales y métodos. *p<0,02.

Dado que la frecuencia de distribución de los otros genotipos es muy baja, el número de participantes en los otros subgrupos fue muy pequeño, lo cual no permitió realizar comparaciones entre los genotipos 2 y 3; B y C. No obstante, como puede observarse en la Tabla VI, si se analizan en conjunto todos los haplotipos diferentes a 1A (1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C), las MPM diferentes a 1A muestran un aumento significativo del 78 % (p<0,02) en los niveles de TG.

TABLA VI. Comparación de parámetros bioquímicos en subpoblaciones con haplotipos diferentes a 1A. Se seleccionaron las participantes cuyos genotipos eran 2,3, B y C, se agruparon en F y PM y se compararon los valores de los parámetros bioquímicos de las dos subpoblaciones. Las determinaciones bioquímicas y genéticas se realizaron como se describen en Materiales y métodos. *p<0,02.

Los parámetros de la hemostasia (TP, APTT, TT, Fbg) e inflamación (PCRu) analizados no evidenciaron cambios significativos en ninguna de las comparaciones realizadas.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos del presente trabajo muestran que, en base al marcador genético presente, el genotipo A identifica a la población de MPM con un perfil lipídico más desfavorable respecto a las fértiles del mismo subtipo.

Al analizar la proporción de los polimorfismos genéticos del ESR1 de nuestra población observamos que los genotipos heterocigotas (P/p y X/x) son mayoritarios respecto a los homocigotas (P/P; p/p; X/X; x/x), característica que coincide con lo descripto en la literatura internacional⁽²³⁾. No obstante, las frecuencias genotípicas observada son diferentes a lo reportado a nivel mundial, hecho que podría ser atribuible a las diferencias genéticas y étnicas entre las diversas poblaciones⁽²⁴⁾.

En cambio, la variación en los parámetros bioquímicos observada al comparar la totalidad de las mujeres fértiles vs. todas las menopáusicas mostraron aumentos significativos en marcadores de perfil lipídico en las MPM, lo cual coincide con la literatura internacional^(5-7).

Hasta el presente, la información reportada en la bibliografía en relación a la asociación entre variantes genéticas del ESR1 y el riesgo cardiovascular en mujeres posmenopáusicas, es contradictoria. Schuit y col. observaron un mayor riesgo de infarto de miocardio en MPM que presentaban el sitio de restricción para XbaI o PvuII⁽²⁵⁾. Por su parte, Nordstrom y col. reportaron que la presencia del alelo p aumenta el riesgo de esclerosis de válvula áortica⁽²⁶⁾. La variante XX, se asoció con aumento de riesgo de dicha patología coronaria en mujeres con hipercolesterolemia familiar⁽²⁷⁾. En cambio varios estudios mostraron una falta de asociación del polimorfismo del ER-alfa y el riesgo cardiovascular^(28-30).

En nuestra población al analizar las MF vs. MPM de igual genotipo, solo se detectaron cambios significativos en los marcadores lipídicos, mientras que los parámetros bioquímicos de la hemostasia y de inflamación se mantuvieron constantes. De los genotipos y haplotipos mayoritarios (1; A y 1A), las MPM A son las que exhiben mayores modificaciones, con significativos aumentos en los niveles de CT; C-LDL y TG. En las 1 no se detectan los cambios en TG, mientras que MPM con haplotipo 1A solo evidenciaron un 16 % de aumento en CT, manteniendo constante el resto de los parámetros. Estos datos sugieren que en la cohorte estudiada, el genotipo A representaría un grupo poblacional con perfil lipídico más desfavorable, y por consiguiente un mayor riesgo potencial de enfermedad cardiovascular.

Un estudio de la Clínica Mayo (EE.UU.) describió asociaciones entre variantes polimórficas del ESR1 y los niveles plasmáticos de ApoA-1, ApoB, y C-HDL en función de la edad y del sexo⁽³¹⁾. En base a los niveles circulantes de apolipoproteínas, HDL, y el índice de masa corporal, se reportó que individuos que poseen mutaciones homocigotas de tipo xx identificadas con Xbal en el ESR1, tienen un menor riesgo de enfermedad coronaria⁽²³⁾. En nuestro estudio, las mujeres homocigotas, representadas por todos los haplotipos no 1A, solo exhiben aumento en triglicéridos séricos, sin modificaciones en los otros parámetros. En futuras investigaciones incluiremos el análisis del perfil metabólico de estas pacientes, ya que el aumento en triglicéridos podría estar relacionado con alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono. Cabe mencionar que una limitación importante de nuestro estudio es el tamaño de la muestra, que debido al perfil de distribución de los marcadores genéticos en nuestra población, los grupos homocigotas son los minoritarios.

Si bien el mecanismo molecular por el cual las variantes polimórficas del receptor de estrógenos inducen cambios en parámetros lípidos no está establecido aún, una hipótesis posible es que podrían dar origen a transcriptos de ARNm con modificaciones estructurales (splicing) que originen isoformas de receptor con acciones biológicas diferentes. Particularmente, el intrón 1 de un gen al igual que el promotor, usualmente contiene un gran número de secuencias regulatorias en comparación con otros intrones. Estudios realizados empleando bases de datos genéticos evidenciaron que, en el caso del polimorfismo PvuII, el alelo C forma parte del sitio de unión para la familia myb de factores transcripcionales involucrados en la regulación de la síntesis de ERa⁽³²⁾.

En conclusión, si bien preliminares, ya que se requiere ampliar el número de participantes en el estudio, nuestros resultados sugieren que el análisis de los polimorfismos del gen ESR1 podría tener una potencial utilidad clínica para pesquisar grupos de riesgo de enfermedad cardiovascular en mujeres posmenopáusicas.

Agradecimientos: La realización de este trabajo ha sido sustentado por subsidios de la SGCyT, Universidad Nacional del Sur, Argentina (PGI 24/B159); Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIP 5790, PIP 0350, CONICET, Argentina).

Agradecemos la colaboración de la Bioquímica María Laura González.

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