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Acta toxicológica argentina

versión On-line ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. v.15 n.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ago./dic. 2007

 

Metabolitos del efavirenz como probable causa de falsos-positivos en test inmunológico para benzodiacepinas en orina.

Quiroga, Patricia N.; Mirson, Daniel J.E.; Ridolfi, Adriana S.; Fuentes, Silvia; De Cristófano, María de los Angeles; Navoni, Julio; Villaamil Lepori, Edda C.*

Cátedra de Toxicología y Química Legal. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Junín 956- 7mo piso (1113) Buenos Aires. Argentina. Te/Fax: 54-11-4964-8283/8284
*Correspondencia E-mail: evillaam@ffyb.uba.ar

Resumen: En el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) una de las drogas antirretrovirales usadas es el efavirenz (EFV). Existe una asociación entre el consumo de drogas de abuso y la probabilidad de adquirir el SIDA, razón por la cual se solicita su investigación en orina.
Como método de screening para detectar el consumo de estas drogas se utilizan habitualmente los ensayos inmunológicos. Una característica especial de estos métodos son las reacciones cruzadas que pueden presentarse con sustancias estructuralmente relacionadas dando origen a resultados falsos positivos.
Al analizar 18 muestras de orina de pacientes con SIDA, se observó un 78% de resultados falsos positivos para benzodiacepinas (BZD) cuando fueron analizados mediante el ensayo inmunológico Triage® (Ascend Multi Immune Assay). El estudio confirmatorio por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) reveló la ausencia de BZD en todos los casos y el 100% de los resultados falsos positivos observados correspondieron a las muestras de los pacientes tratados con EFV.
Con el propósito de dilucidar el origen de esta reacción cruzada fueron aislados el EFV y sus metabolitos de las muestras de orina, mediante extracción en fase sólida (SPE) y cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC), e identificados por cromatografía gaseosa- espectrometría de masa (GC-MS y GC-MS/MS/MS).
Los resultados obtenidos en este estudio indicarían que los metabolitos del EFV (8-OH-EFV y/o 7-OH-EFV) y no el EFV podrían ser los responsables de la reacción cruzada observada en el ensayo inmunológico.

Palabras claves: Efavirenz; Falsos positivos; Benzodiacepinas; Triage®; SIDA.

Abstract: False-positive immunoassay results for urine benzodiacepines probably caused by efavirenz metabolites. Efavirenz (EFV) is an antiretroviral drug used in the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) treatment. Immunoassay techniques have been widely used for abuse drug screening test. The presence of structurally related substances in urine samples can interfere by cross reactions causing false positive results. High percentage of false positive results (78%) for benzodiazepines (BDZ) had been established for 18 urine samples assayed by immunoassay test Triage® (Ascend Multi Immune Assay). Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) evaluation was negative for BDZ for all cases. One hundred percent (100%) of the positive results came from patients treated with EFV.
With the aim to determine the cause of this cross- reaction, EFV and its metabolites were isolated by solid phase extraction (SPE) and high performance thin-layer chromatography (HPTLC) and then, identified by gas chromatography mass spectrometry (GC-MS and GC-MS/MS/MS). GC-MS/MS/MS analysis showed that EFV metabolites (8-OH-EFV and/or 7-OH-EFV) could probably be responsible for the cross reaction observed in the immunologic assays.

Key Words: Efavirenz; False positive; Benzodiacepine; Triage®; AIDS.

INTRODUCCIÓN

La relación entre el abuso de drogas y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) constituye un complejo problema sanitario en el mundo. Uno de los factores más importantes en la propagación de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), causante del SIDA, es el cambio del comportamiento asociado al consumo de drogas de abuso (1-7).
El tratamiento de pacientes con SIDA consiste en terapias antirretrovirales que tienen por objeto reducir la carga viral tanto como sea posible (8,9). Entre las distintas clases de antirretrovirales se encuentra el Efavirenz (EFV), un potente inhibidor no nucleosídico de la HIV-1 transcriptasa reversa (10-12). Este compuesto es metabolizado por el organismo y excretado en la orina en sus formas libres y conjugadas. El glucurónido del 8-hidroxiefavirenz (8-OH-EFV) es el principal metabolito excretado, siguiéndole en importancia los glucurónidos del 7-hidroxi-efavirenz (7-OH-EFV) y del EFV (13).
Dado que el abuso de drogas facilita la propagación de la infección por HIV, aumenta el riesgo de contraer o transmitir otras enfermedades y complica la aceptación del tratamiento por parte de los pacientes, la prevención integral del VIH/ SIDA contempla tratamientos para el abuso de drogas, que con frecuencia requieren de la investigación de estas drogas en orina (14).
Las pruebas de detección más utilizadas como método de screening de estas drogas, son los ensayos inmunológicos (15). Son procedimientos sensibles, simples, con tiempos cortos de procesamiento, aplicables sobre diferentes matrices y de especificidad aceptable (16-21), aún cuando tienen la desventaja de presentar reacciones cruzadas con sustancias que pueden estar estructuralmente relacionadas y que no pertenecen al grupo de interés (22-25). Por este motivo es necesario y recomendable confirmar los resultados positivos obtenidos por los métodos de screening por cromatografía gaseosa- espectrometría de masa (GC-MS).
En el trabajo cotidiano en el Centro de Asesoramiento Toxicológico Analítico (CENATOXA), se observó un alto porcentaje de resultados positivos para benzodiacepinas al analizar muestras de orina de pacientes con SIDA tratados con antirretrovirales. Esta observación se obtuvo cuando fue utilizado el método inmunológico Triage® (Ascendent Multi Immunoassay test) como método de screening capaz de detectar cocaína, anfetaminas, benzodiacepinas, barbitúricos, tetrahidrocannabinol (THC), opiáceos y fenciclidina.
La historia clínica de todos los pacientes estudiados reveló que 14 eran tratados con EFV, 4 con Nevirapina (NVP) y ninguno tenía indicado benzodiacepinas (BZD).
Del total de muestras de orina analizadas, 14 arrojaron resultados positivos para BZD correspondiendo al 100% del grupo tratado con EFV. Este hallazgo, y los antecedentes existentes en la bibliografía sobre la interferencia del EFV en la investigación del tetrahidrocannabinol (THC) y del estradiol por test inmunológicos (26-28), permitieron plantear la hipótesis sobre una posible interacción del EFV, y/o sus metabolitos, con el anticuerpo usado en este ensayo para las BZD, lo que podría explicar la causa de la reacción cruzada observada.
El presente trabajo está dirigido a dilucidar si la presencia de EFV y /o sus metabolitos en orina son capaces de dar falsos positivos para BZD cuando son investigadas por Triage®.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos y estándares
Metanol, fosfato dibásico de sodio, fosfato monobásico de sodio, ácido acético glacial, n-hexano, acetato de etilo, cloroformo y acetona fueron todos de calidad puro para análisis y provistos por Merck Química Argentina (Buenos Aires, Argentina). El kit inmunológico Triage® para la detección simultánea de siete grupos de drogas en orina (cocaína, anfetaminas, benzodiacepinas, barbitúricos, THC, opiáceos y fenciclidina) fue provisto por Biosite® Diagnostics (San Diego, CA). Las placas de HPTLC, Silica gel 60 F254 10 x 10 cm fueron provistas por Merck Química Argentina (Buenos Aires, Argentina). La ß-glucuronidasa de Escherichia coli fue provista por Roche Diagnostics Corporation (Buenos Aires, Argentina). Las columnas de fase reversa e intercambio iónico para extracción en fase sólida (SPE) fueron Clean Screen® (DAU 303, 300 mg/ 3ml, Worldwide Monitoring® USA). El agente derivatizante NMethyl- N-TMS-Trifluoroacetamide (MSTFA) fue provisto por Pierce (USA). La solución estándar de Efavirenz (0,3 mg/ml en metanol) se preparó a partir de una cápsula comercial de Stocrin® (Bristol - Myers Squibb Co., Princeton, NJ).

Preparación de las muestras
Todas las muestras de orina (n=18) correspondieron a pacientes tratados con drogas antirretrovirales que concurrieron al CENATOXA por solicitárseles la investigación de drogas de abuso.

Extracción en fase sólida (SPE)
Extracción de benzodiacepinas: la extracción de las muestras con resultados positivos por screening inmunológico se realizó usando el protocolo para benzodiacepinas en orina del manual de aplicaciones SPE (United Chemical Technologies Inc.) (29), con la siguiente modificación en el paso de hidrólisis: 10ml de orina fueron ajustados a pH=6 con buffer fosfato 100 mM y se hidrolizaron con 50 μl de‚ ß-glucuronidasa a 48ºC durante 1 hora. Los extractos secos obtenidos mediante el protocolo anteriormente indicado, fueron derivatizados con 70 μl de MSTFA a 70ºC durante 20 minutos para su posterior investigación por GC-MS. Se investigaron solamente las benzodiacepinas comercializadas en la Argentina (Tabla 1) (30).

Tabla 1. Benzodiacepinas que se comercializan en Argentina

Extracción del Efavirenz y sus metabolitos: la extracción se realizó a partir de orina blanco cargada con EFV así como de las muestras de orina con resultados positivos para BZD por el screening inmunológico, aplicando el protocolo para drogas terapéuticas y de abuso en orina del manual de aplicaciones SPE (United Chemical Technologies Inc.) (31), con la modificación antes señalada.

Cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC)
Los metabolitos del EFV fueron aislados por cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC) a partir de los extractos ácido y neutro obtenidos por SPE. Los extractos secos se reconstituyeron en 100 μl de metanol y se sembraron en banda en las placas de HPTLC. El sistema de solventes utilizado como fase móvil fue cloroformo- acetona (90:10). Las bandas fueron visualizadas con luz ultravioleta de onda corta (UV 254 nm), aisladas y los componentes extraídos con metanol.
La identificación de los compuestos presentes en las diferentes fracciones obtenidas se realizó por GC-MS.

Screening inmunológico Triage®
Este ensayo se realizó de acuerdo al protocolo provisto por los fabricantes, en las muestras de orina de los pacientes, en la orina blanco cargada con EFV y en la orina blanco cargada con alícuotas de las fracciones separadas por HPTLC.

Cromatografía gaseosa espectrometría de masa (GC-MS)
GC-MS para BZDs y EFV
Se utilizó un espectrómetro de masa Hewlett Packard cuadrupolar (QMS) (HP, Palo Alto, CA) modelo 5972A equipado con un cromatógrafo gaseoso 5890 (GC) y una columna capilar HP- 5MS (5%-fenil-metilpolisiloxano, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm, J&W Scientific, Folsom, CA).
El programa de temperatura para EFV fue: 90- 240ºC a 15ºC/min; 240ºC (4 min); 240-300ºC a 30ºC/min; 300ºC (7 min). Para las BZD el programa de temperatura fue: 60-300ºC a 10ºC/min; 300ºC (5 min). En ambos casos el inyector fue utilizado en modo split, relación de split, 1:10 y el volumen de inyección fue 2μl. La temperatura del inyector fue 265ºC; la temperatura de la interfase fue 290ºC; el gas carrier fue helio (0,7 ml/min), y se trabajó en modo scan, m/z 50 a 550.

GC-MS/MS/MS para EFV y sus metabolitos
Se utilizó un espectrómetro de masa Finnigan Polaris con trampa de iones (ITMS) acoplado a un cromatógrafo gaseoso Trace GC Thermoquest (San José, CA), con capacidad MS-MS. Para el análisis por ITMS se utilizó una columna capilar HP-1MS (metil- siloxano, 25 m x 0,2 mm x 0,33 μm, J&W Scientific, Folsom, CA). El programa de temperatura fue el mismo que se indicó en el párrafo anterior para el EFV por GC-MS. Como gas carrier se empleó helio (1,5 ml/min). La temperatura del inyector fue 265ºC y la de la línea de transferencia, 250 ºC. El inyector fue utilizado en modo split, relación de split, 1:10 y el volumen de inyección fue 2μl.
El EFV se investigó por GC-MS/MS/MS seleccionando el ión molecular m/z 315 el cual fue aislado utilizando un voltaje de excitación de 1,0 V y la energía máxima de excitación de q= 0,30 .
Posteriormente se aisló el ión m/z 246 utilizando un voltaje de excitación de 1,0 V y energía máxima de excitación q= 0,225 y finalmente se realizó el análisis en modo scan de m/z 61 a m/z 250.
Para este procedimiento se tuvo en cuenta el espectro de masas del EFV (ión molecular m/z 315, ión base m/z 246 producido por pérdida del fragmento CF3) (Figura 1).

Figura 1.
Espectro de masa de EFV por GC-MS

El programa Isoform Ver 1.02 de la librería NIST (por sus siglas en inglés National Institute of Standards and Technology) fue utilizado para la identificación de los metabolitos del EFV (7-OHEFV y 8-OH-EFV). El ión molecular y el patrón isotópico fueron calculados en base a la fórmula empírica. Teniendo en cuenta el patrón de fragmentación del EFV y sus similitudes estructurales (los metabolitos sólo difieren en la posición de un hidroxilo) se hallaron dos moléculas con el mismo ión molecular (m/z 314+17=331) e igual ión base m/z 262 (331-69).
Los metabolitos 7-OH-EFV y 8-OH-EFV fueron analizados aplicando el siguiente método por GCMS/ MS/MS: el ión molecular m/z 331 se aisló usando un voltaje de excitación de 1,0 V y la energía de excitación máxima fue de q= 0,30. Se aisló el ión m/z 262 usando un voltaje de 1,0 V y la Energía Máxima de Excitación fue q=0,225. Se realizó análisis en modo scan desde m/z 65 a 266.

RESULTADOS

El 78% de las orinas analizadas por Triage® arrojaron resultados positivos para BZD. Por GC-MS no se confirmó la presencia de BZD en ninguna de estas muestras, correspondiendo el 100% de éstas a orinas de pacientes tratados con EFV (Tabla 2).

Tabla 2. Resultados por inmunoanálisis y por GC-MS para benzodiacepinas en orina de pacientes tratados con Efavirenz (EFV) y Nevirapina (NVP).

Por HPTLC se aislaron 2 fracciones de Rf 0,31 y 0,61. El análisis por GC/MS de ambas fracciones permitió identificar en la banda de Rf 0,61 la presencia de dos sustancias con peso molecular igual a cada uno de los metabolitos 7-OH y 8-OHEFV. Como estos metabolitos difieren sólo en la posición de un hidroxilo, era esperable que la separación por HPTLC no fuera posible. Por GCMS se caracterizaron en dicha fracción dos sustancias con tiempos de retención de 11,83 y 11,98 minutos (Figura 2). Por GC-MS/MS/MS se estimó con alta probabilidad la presencia de estos metabolitos del EFV, de ión molecular (m/z 314+17=331) e ión base m/z 262 (m/z 331-69) (Figura 3).

Figura 2.
Cromatograma de la fracción obtenida por HPTLC de Rf= 0,61 (Metabolitos del EFV con Rt = 11,83 y 11,98 minutos)

Figura 3.
Espectro de masa por GC-MS/MS/MS de las sustancias con Rt = 11,83 y 11,98 minutos que corresponderían a los metabolitos 7 y 8 OH-EFV

El análisis inmunológico de la orina blanco adicionada con la fracción obtenida por HPTLC de Rf 0,61 dio positivo para BZD, mientras que la orina blanco a la que se le agregó EFV resultó negativa para este grupo de sustancias.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos en este trabajo indicarían que los metabolitos de EFV, 8-OH-EFV y/o 7- OH-EFV serían los responsables de la reacción cruzada observada en el ensayo inmunológico Triage® para benzodiacepinas. Este hallazgo difiere con la caracterización de la interferencia producida por EFV en diferentes ensayos inmunológicos para el tetrahidrocannabinol realizada por Steven Rossi et al. (26), la cual postula solo al 8-OH EFV glucurónido como responsable de la reacción cruzada.
Si bien para lograr una completa identificación de esta reacción cruzada sería necesario realizar estudios con testigos de estos metabolitos libres y conjugados, este trabajo tiene valor por ser la primera constatación de esta interferencia en un método de screening comúnmente utilizado para investigar drogas de abuso que incluye a las BZD, un grupo de fármacos ampliamente utilizados en nuestro medio.

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