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Acta toxicológica argentina

versión On-line ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. v.16 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./jul. 2008

 

Inmunomarcación de neuronas dopaminérgicas en cortes flotantes de hipotálamo de rata: preservación alternativa del tejido nervioso antes del corte

Cholich, Valeria1; García, Graciela1,2; Martínez, Alejandra2; Evangelista de Duffard, Ana María.1

1. Laboratorio de Toxicología Experimental (LATOEX).
2. Área Morfología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario (UNR), Suipacha 531/570, (S2002 LRK) Rosario, Santa Fe, República Argentina - Tel: 0341-4804592. Fax: 0341-4804598.
E-mail: vcholich@fbioyf.unr.edu.ar

Resumen: Se realizó un estudio inmunohistoquímico de la enzima tirosina hidroxilasa (marcador de neuronas dopaminérgicas) en el hipotálamo de ratas Wistar machos adultas en cortes flotantes de muestras fijadas por perfusión. Debido a que el número de cerebros que se procesaron fue superior al número que pueden ser cortados inmediatamente, el material debió almacenarse congelando los cerebros enteros a -80ºC. Pero por un desperfecto técnico del equipo de refrigeración, las muestras debieron trasladarse a -20ºC resultando en el deterioro de las mismas. Ante este inconveniente, los sucesivos cerebros fueron almacenados en sacarosa al 30% p/v en buffer fosfato salino (PBS) con 0,01% de azida sódica y mantenidos a 4ºC durante tiempos variables (de semanas a meses) hasta ser congelados con gas clorofluorado y cortados. Estos cerebros no mostraron alteración en la estructura morfológica del tejido. Esta metodología de preservación aquí descrita sería una alternativa de elección válida para aquellos laboratorios que no cuenten con un equipo de refrigeración de -80ºC.

Palabras clave: Inmunohistoquímica; Tirosina hidroxilasa; Cortes flotantes; Criopreservación.

Abstract: Immunohistochemical Studies Of Dopaminergic Neurons On Free Floating Sections: Alternative Cryopreservation Method Of Nervous Tissue Before Cutting. In central nervous system histological studies, free-floating sections of perfusion-fixed samples are frequently used. Samples storage may be performed freezing either the entire brain at -80ºC or sections at -20ºC. When studying hypothalamic tyrosine hydroxylase enzyme (dopaminergic neurons marker) by immunohistochemistry in adult male Wistar rats, entire brains were stored at -80ºC. Due to an abrupt freezer technical failure, samples should be thawed to -20ºC with the resulting samples damage. To avoid this situation, subsequent brains were stored in 30% sucrose in saline phosphate buffer (PBS) with 0.01% sodium azide and kept at 4ºC for different periods (weeks to months) until they were frozen with chlorofluorade gas and cut. These brains showed no morphological alterations of tissue structure. This preservation method appeared to be an alternative valid option to laboratories with no -80ºC freezing equipment.

Key words: Immunohistochemistry; Tyrosine hydroxylase; Free floating sections; Cryopreservation.

INTRODUCCIÓN

Las neuronas dopaminérgicas pueden ser afectadas por neurotoxinas, neurotóxicos, psicoestimulantes o drogas de abuso. El estudio histológico de estas neuronas puede realizarse a través de una inmunomarcación con un anticuerpo contra la enzima tirosina hidroxilasa (TH), limitante de la síntesis del neurotransmisor dopamina. En estudios histológicos del sistema nervioso central (SNC) es muy frecuente la utilización de cortes flotantes de muestras fijadas por perfusión. Los cortes flotantes permiten seleccionar áreas cerebrales u órganos (corteza, hipocampo, hipotálamo, cerebelo) donde específicamente se encuentran ciertos neurotransmisores, sus enzimas de síntesis y sus receptores, o se buscan marcadores de injurias. Otra ventaja de trabajar con cortes flotantes es que, para la realización de una tinción inmunohistoquímica, presentan dos superficies de incubación. La obtención de estos cortes se puede realizar con un vibrátomo para lo cual la muestra se mantiene a 4ºC o con un crióstato donde es necesario congelarla. En este último caso, el material fijado requiere de crioprotección para ser cortado y/o almacenado. Generalmente se utiliza sacarosa entre el 10 y el 30 % p/v en solución de buffer (1). El medio ideal para la congelación rápida es el isopentano enfriado hasta su punto de congelación (-160ºC) (2). Debido a la dificultad de conseguir isopentano porque no se comercializa en nuestra ciudad, en nuestro laboratorio utilizamos gas clorofluorado (enfriante instantáneo detector térmico de fallas de electroquímica Delta). El almacenamiento del material puede realizarse congelando el cerebro entero a -80ºC o congelando los cortes flotantes a -20ºC crioprotegidos con sacarosa al 30% p/v en buffer fosfato salino (PBS) con 0,01% de azida sódica (3,4). Con frecuencia, el número de cerebros que se utilizan para un estudio experimental es superior al número que pueden ser cortados inmediatamente, por esta razón se impone el almacenamiento de los cerebros enteros a -80ºC.
En oportunidad de poner a punto la técnica de marcación inmunohistoquímica de TH en cortes flotantes del hipotálamo de ratas Wistar adultas, los cerebros enteros fueron almacenados a -80ºC, pero por un desperfecto técnico del equipo de refrigeración las muestras debieron trasladarse a -20ºC resultando en el deterioro de las mismas. El objetivo de este trabajo fue, por lo tanto, encontrar una forma alternativa de almacenamiento para el corte diferido de muestras de tejido nervioso.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron ratas Wistar machos adultas obtenidas del Bioterio Central de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR. Los animales fueron alojados en jaulas con libre acceso al agua y a la comida (alimento Cargill - rata/ratón laboratorio, Bs. As., Arg.) y mantenidos a una temperatura controlada de 22-24 °C y un ciclo de luz-oscuridad de 12 hs en el bioterio del Laboratorio de Toxicología Experimental (LATOEX). El cuidado y tratamiento de los animales se realizó según el "Reglamento para el manejo y uso de animales de laboratorio" de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la UNR.
A los 90 días de edad, las ratas fueron anestesiadas con 70 mg/kg de tiopental sódico (vía intraperitoneal) y fijadas por perfusión transcardíaca (5) con una solución de paraformaldehído al 4% en buffer fosfato 0,1 M (pH 7,4). Previamente a la fijación, se realizó un lavado del sistema circulatorio con solución salina (0,9 % p/v NaCl), con 10 μl de NaNO2 0,4 M y 50 UI de heparina. Una vez extraídos, los cerebros fueron mantenidos en la solución fijadora por 2-4 hs y luego sumergidos en sacarosa al 30% p/v toda la noche o hasta que bajaran al fondo del frasco. Luego fueron congelados con gas clorofluorado (enfriante instantáneo detector térmico de fallas) y cortados inmediatamente (grupo 1).
Otros cerebros fueron congelados con gas clorofluorado y guardados enteros en un freezer a -80ºC. Este equipo sufrió una falla técnica y las muestras debieron ser trasladadas a un equipo de -20ºC (grupo 2). Ante este inconveniente, otros cerebros fueron colocados en la solución fijadora por 2-4 hs y luego sumergidos en sacarosa al 30% p/v en buffer fosfato salino (PBS) con 0,01% de azida sódica y mantenidos a 4ºC durante tiempos variables, abarcando períodos desde 1 semana a 6 meses, hasta ser congelados con gas clorofluorado y cortados (grupo 3). Con un crióstato se realizaron cortes coronales seriados del hipotálamo de cada cerebro de 40 μm de espesor, tomando como referencia desde la lámina 18 hasta la 35 del atlas de Paxinos y Watson (6), que incluyen los núcleos dopaminérgicos arcuato (Arc) y periventricular (PeV). Los cortes fueron recolectados y mantenidos a -20ºC crioprotegidos con sacarosa al 30% p/v en PBS con 0,01% de azida sódica hasta su uso posterior. Para evaluar la buena conservación de la estructura morfológica, se separaron cortes de cada uno de los grupos y se colorearon con el método de hematoxilina-eosina (7).
Los cortes de hipotálamo fueron procesados según la técnica de peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) de Sternberger (8). Los cortes flotantes fueron lavados con PBS, colocados en metanol con H2O2 al 0,3% por 30 min. e incubados en suero normal de oveja (NGS) al 3% en PBS con un 0,3% de Tritón X-100 (PBSX) por 30 min. Se incubó con el anticuerpo primario, anti-TH monoclonal, en una dilución 1:500 durante 72 hs a -4ºC en PBSX con un 1% de NGS. La actividad peroxidasa fue puesta de manifiesto con 3,3´diaminobenzidina (DAB)/sulfato de níquel y amonio en buffer acetato (0,1 M; pH 6) a temperatura ambiente. Luego del revelado, los cortes fueron montados en portaobjetos gelatinizados, deshidratados y cubiertos con cubreobjetos para su observación al microscopio. Los cortes de hipotálamo del grupo 3 fueron procesados de la misma manera pero previamente se realizó un procedimiento de recuperación antigénica calentándolos en un baño termostatizado a 80ºC en buffer citrato 10 mM (pH 8,5) durante 30 min.

RESULTADOS

Como se observa en las microfotografías, los cerebros que fueron congelados con gas clorofluorado y cortados inmediatamente mantuvieron intacta su morfología (Fig. 1). Los cerebros que fueron congelados con gas clorofluorado y guardados enteros en un freezer a -80ºC y luego trasladados a un equipo de -20ºC sufrieron un notable deterioro de la estructura morfológica no justificándose la marcación inmunohistoquímica (Fig. 2). Los cerebros que fueron mantenidos en sacarosa a 4ºC durante 6 meses hasta ser congelados con gas clorofluorado y posteriormente cortados conservaron una morfología normal. Además, estos cortes toleraron la incubación de 30 minutos a 80ºC de la recuperación antigénica sin sufrir modificaciones (Fig. 3). En estos cortes se observan muy bien las neuronas de los núcleos estudiados, a diferencia de los cortes del grupo 1 donde no se distinguen claramente las neuronas del núcleo arcuato.


Figura 1: Hipotálamo de rata del grupo 1. Coloración inmunohistoquímica para TH. A: aumento inicial 40x; B: aumento inicial 100x; C: aumento inicial 200x. Todas las fotos corresponden al mismo corte.


Figura 2: Hipotálamo de rata del grupo 2. Coloración con hematoxilina eosina. A: aumento inicial 40x; B: aumento inicial 100x; C: aumento inicial 200x. Todas las fotos corresponden al mismo corte. Obsérvese el notable deterioro de la morfología.


Figura 3: Hipotálamo de rata del grupo 3. Coloración inmunohistoquímica para TH. A: aumento inicial 40x; B: aumento inicial 100x; C: aumento inicial 200x. Todas las fotos corresponden al mismo corte. Nótese el incremento de la inmunotinción debido al procedimiento de recuperación antigénica y la muy buena preservación de la morfología. Tiempo de conservación a 4ºC: 6 meses.

DISCUSIÓN

El tiempo de almacenamiento de los cerebros enteros sumergidos en sacarosa al 30% p/v en PBS con 0,01% de azida sódica y mantenidos a 4ºC puede variar desde semanas a varios meses sin mostrar alteración en la estructura morfológica del tejido. Nuestra experiencia abarca sólo un periodo de 6 meses de almacenamiento.
Según la bibliografía, para realizar cortes con crióstato se requiere del almacenamiento de los cerebros enteros a -80ºC, lo cual condiciona al laboratorio a adquirir un equipo de refrigeración de muy alto costo. Por lo tanto, esta nueva metodología de preservación aquí descrita tiene la ventaja de ser sencilla, práctica y económica en comparación con el método antes mencionado, además resulta muy conveniente en el caso de tener que transportar el material a grandes distancias para realizar cortes en otros laboratorios, independizándose del uso de hielo seco o nitrógeno líquido. Todas estas ventajas hacen de esta forma de preservación una alternativa válida para aquellos laboratorios que no cuenten con un equipo de refrigeración de -80ºC.

BIBLIOGRAFÍA CITADA

1. Côté, S.L.; Ribeiro-Da-Silva, A. and Cuello, A.C. (1993). Current protocols for light microscopy immunocytochemistry (Chapter 4). En: Immunohisto-chemistry II. Edited by A.C. Cuello. John Wiley & Sons Ltd. England. 147-168.        [ Links ]

2. Rodríguez, M.D.; Sáez, F.; Alfaro, P. y De Federico, M.J. (1993). Micrótomos y técnicas de corte de los tejidos. En: Raimundo García del Moral R. Laboratorio de Anatomía Patológica. Mc Graw-Hil-Interamericana Eds. España. 108.        [ Links ]

3. Ferrer, I. (2004). Bancos de tejidos neurológicos. Revista Española de Patología. 37 (1) 57-64.        [ Links ]

4. Brusco, A. (1994). Algunas sugerencias para la realización de las técnicas inmunocitoquímicas. Curso Intracongreso: Localización inmunoenzimática de moléculas celulares. Congreso Argentino de Ciencias Morfológicas. Río Cuarto. Córdoba.        [ Links ]

5. Imboden, H. and Felix, D. (1995). Immunohistochemistry in brain tissue. Methods in Neurosciences. Academic Press, Inc. 24 236-260.        [ Links ]

6. Paxinos, G. and Watson, C. (1998). The rat brain in stereotactic coordinates, 4th ed. Academic Press, San Diego, CA.        [ Links ]

7. Aguilar, D.; Bustos, M. y Caracuel, M.D. (1993). Coloraciones histopatológicas rutinarias de mayor interés. En: Raimundo García del Moral R. Laboratorio de Anatomía Patológica. Mc Graw-Hil-Interamericana Eds. España. 156.        [ Links ]

8. Sternberger, L.A.; Hardy, P.H.; Cuculis, J.J. and Mayer, H.G. (1970). The unlabeled antibody enzime method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes. J. Histochem.Cytochem. 28 315-333.        [ Links ]