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Acta toxicológica argentina

versión On-line ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. v.16 n.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ago./dic. 2008

 

Evaluación de la toxicidad aguda oral e irritación sobre mucosa bucal de la solución CM-95 tratada magnéticamente

Díaz Bestard, Jorge1; Martínez Manrique, Clara Esther2; Alfonso Castillo, Alfredo1; Pardo Terga, Ana Maria3; Esmérido Betancourt, Juan1; Salas Martínez, Hilario1; Puente Zapata, Edgar; Sedeño Soularit, Narvis1

1. Centro de Toxicología y Biomedicina. Departamento Toxicometría. Autopista Nacional Km. 1 1/2 Apdo. Postal 4033. CP 90 400. Santiago de Cuba. CUBA. Teléfonos: (53) 22-644095; 641000; 643864. Fax: (53) 22-687188.
2. Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado. Departamento de Bioelectromagnetismo. Universidad de Oriente. Avenida de Las Américas S/N. Santiago de Cuba. Cuba
3. Facultad de Ciencias Naturales. Departamento de Biología. Universidad de Oriente. Patricio Lubumba S/N. Carretera de Cuabitas. Santiago de Cuba. Cuba
E-mail: jorge@toxi.scu.sld.cu, jorge790615@yahoo.com, jorge@medired.scu.sld.cu

Resumen: La Solución CM-95 tratada magnéticamente es un producto en desarrollo que mostró propiedades inmunoestimulantes en ensayos preclínicos, característica que la hacen adecuada como candidata a inmunopotenciador. En este trabajo se evaluaron los posibles efectos tóxicos preclínicos de la Solución CM-95 tratada magnéticamente, por el método de las Clases de Toxicidad Aguda y el de irritación de la mucosa oral, adaptando las normas OECD 423 y la ISO 10993-10, respectivamente. En el método de las Clases de Toxicidad Aguda se utilizó el ensayo límite, en ratas Sprague Dawley hembras, en el cual la dosis estuvo relacionada con el nivel de inducción magnética, en este caso 0,16 T, aplicado a la Solución CM-95; y el volumen a administrar de la misma, calculado sobre la base de 2 ml de la solución por 100 g de peso corporal. La determinación de la irritación de la mucosa oral se llevó a cabo en hámster Sirios Dorados hembras mediante un ensayo a dosis repetidas durante 7 días de tratamiento en la bolsa gular derecha, con pellet de algodón impregnado con 0,5 ml de la solución tratada magnéticamente con la misma inducción. No se encontró mortalidad ni evidencias de signos tóxicos para el ensayo de toxicidad aguda, y se obtuvo un índice de irritación sobre mucosa oral de 0, por lo que la sustancia estudiada se enmarcó como "No clasificada" y "No irritante" según la metodología empleada. Estos resultados complementarán otros estudios toxicológicos para avalar la seguridad de esta Solución para su uso futuro como fármaco por vía oral.

Palabras claves: Toxicidad aguda; CTA; Inmunopotenciador; Solución CM-95 tratada magnéticamente.

Abstract: Oral acute toxicity and irritation on buccal mucosa evaluation of the cm-95 solution magnetically treated. CM-95 solution magnetically treated is a product which showed immunologic properties in preliminary tests, characteristic that makes it adequate as inmunopotentiator candidate. In this study the possible preclinical toxic effects of CM-95 Solution magnetically treated were evaluated, by the Acute Toxicity Class method and oral mucosa irritation test, adapting guideline OECD 423 and ISO 10993-10. In Acute Toxicity Class method was used the Limit Test, in Sprague Dawley females rats, where the dose was related to the magnetic induction level, in this case 0.16 T, applied to CM-95 Solution; and the administration volume of aqueous solution was calculated on base 2 ml per 100 g body weight. Determination of oral mucosa irritation was carried out in female golden Syrian hamsters by means of a repeated doses test during 7 days of treatment in right gular bag, with a cotton pellet impregnated with 0.5 ml of CM-95 Solution magnetically treated with the same induction. Neither mortality nor evidences of toxic signs were observed for the test of acute toxicity, and an irritation index of 0 was obtained on oral mucosa irritation test, reason why the studied substance was framed as "not classified" and "non irritating" according to the applied methodology. These results will complement other toxicological studies to guarantee the safety of this Solution for its future use as a drug by oral route.

Key words: Acute toxicity; ACT; Immunopotentiator; CM-95 Solution magnetically treated.

INTRODUCCIÓN

Una sustancia inmunopotenciadora es aquella capaz de activar la respuesta inmune, lo cual permite su aplicación para la inmunoterapia de enfermedades congénitas o adquiridas que producen la depresión del sistema inmune. Entre éstas se incluyen, el SIDA, el cáncer o aquéllas producidas por medicamentos para el tratamiento de diversas patologías (1,2). No obstante, para el uso de estas sustancias como fármacos, es importante conocer su seguridad, ya que a pesar de su buena efectividad, en la mayoría de los casos los inmunopotenciadores en proceso de evaluación o ya como fármacos, muestran signos de toxicidad que limitan sus usos en humanos y animales (1).
La Solución CM-95 tratada magnéticamente (TM) es un fármaco en desarrollo que exhibe propiedades como activador del metabolismo celular. En este efecto se involucra la activación del sistema inmune a diferentes niveles, características que la hacen adecuada para su uso como fármaco inmunopotenciador (3). Sin embargo, han sido pobres los estudios toxicológicos para evaluar los efectos tóxicos de sistemas acuosos tratados magnéticamente como posibles fármacos. Los estudios toxicológicos de sistemas que reciben el campo magnético, han estado dirigidos fundamentalmente hacia los estudios epidemiológicos ocupacionales o residenciales sometidos a líneas de alta tensión u otras fuentes de energía electromagnética que pueden provocar daños al organismo vivo (3-5).
Aunque para los estudios de toxicidad en sistemas acuosos tratados magnéticamente no existe un consenso en las regulaciones internacionales, estos ensayos se adaptaron a las regulaciones de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD) (6,7).
Los objetivos de este trabajo se centraron en la evaluación de los posibles efectos tóxicos preclínicos de la Solución CM-95 TM, por el método de las Clases de Toxicidad Aguda y el de irritación de la mucosa oral, debido a la gran importancia que reviste la obtención de un novedoso candidato inmunopotenciador, la escasez de información sobre sistemas acuosos tratados magnéticamente y la necesidad de evaluar su posible inocuidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Formulación
La Solución CM-95 es una sal inorgánica formada por los iones cloruro y sodio a una concentración entre 0,1-2 % en agua destilada (3). A la misma se le realizó un tratamiento magnético con una inducción magnética de 0,16 T (la mayor en el rango escogido para el tratamiento magnético de la solución) y a una velocidad de flujo entre 0,2-0,4 mt/s. Este tratamiento se realizó en un equipo a imanes permanentes, validado en el Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado (CNEA), de Santiago de Cuba, Cuba, según las Normas de la Lake Shore de E.E U.U.

Biomodelos experimentales
Para el ensayo de toxicidad aguda oral por el método de las Clases, se emplearon ratas Sprague Dawley, hembras nulíparas y no grávidas, de 8 semanas de edad y un peso corporal de 155-160 g, procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorios (CENPALAB, Habana); y a las cuales se les retiró el alimento a las 12 hs antes de la administración del producto para obtener condiciones de ayuno en los animales de experimentación. En el estudio de irritabilidad de la mucosa oral se emplearon hámster Dorados Sirios hembras nulíparas y no grávidas, de 3-4 semanas de edad con peso entre 50-60 g, suministrados por el CENPALAB.
Todos los animales se recibieron y pasaron a cuarentena por siete días antes de la administración, donde fueron examinados clínicamente por un especialista que certificó su estado de salud. Se pesaron e identificaron individualmente por perforación y muescas en las orejas (8) y se distribuyeron según tabla de aleatorización (9) en cajas de Makrolon modelo 1000, en condiciones convencionales. La instalación se mantuvo a temperatura controlada de 22 ± 3 °C, humedad relativa de 60 ± 10 %, y ciclo luz-oscuridad de 12/12 horas. La alimentación consistió en dieta standard para ratas y ratones CMO-1000 procedente del CENPALAB, y agua potable ad-libitum. Todos los ensayos fueron realizados de acuerdo a las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) (10).

Ensayo de toxicidad aguda oral
La metodología y el diseño experimental se llevaron a cabo siguiendo las orientaciones descritas por la norma 423 de la OECD para la aplicación del método de las Clases de Toxicidad Aguda (CTA) (6), y según lo previsto en los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) códigos del 421 005 al 422 002, del Centro de Toxicología y Biomedicina (TOXIMED), perteneciente al Instituto Superior de Ciencias Médicas (ISCM) de Santiago de Cuba.

Grupo experimental, dosificación y frecuencia de administración
Se empleó un grupo experimental (GTM) compuesto de 3 ratas hembras. La noche anterior (12 horas antes) a la administración única, los animales fueron puestos en ayuno. El día de la administración las ratas se pesaron (día 0), este peso se utilizó para determinar el volumen de la Solución CM-95 TM de la sustancia de ensayo a administrar.
A todas las ratas del grupo experimental se les administró el producto por vía oral a través de una sonda gástrica No. 10 (Vigón, Francia) en el día 0 del estudio. El nivel de dosis estuvo relacionado con la intensidad del tratamiento magnético a la Solución CM-95, para la cual se empleó 0,16 T (máxima inducción magnética permisible para la obtención del candidato a inmunopotenciador según la tecnología aplicada), a partir de la cual hay más probabilidad de causar daño o muerte a una parte o la totalidad de los animales y que por tanto se relaciona con el nivel de dosis inicial más elevado que establece la norma (Dosis Límite: 5000 mg/kg de peso corporal). El volumen de la solución a administrar se calculó sobre la base de 2 ml de la solución/ 100 g de peso corporal.

Determinación del peso corporal, duración del ensayo y observaciones
Los animales se pesaron en una balanza digital marca Sartorius, con capacidad de 6000 g y sensibilidad de 0,1 g, los días 0, 7 y 14; en las condiciones ambientales descritas anteriormente. Durante la fase experimental se realizaron observaciones clínicas diarias, a fin de registrar cualquier variación en el comportamiento o signo de toxicidad. Estas evaluaciones clínicas incluyeron cambios en la piel y pelaje, coloración y apariencia de las membranas mucosas y ojos, sistema respiratorio, nervioso central y periférico, y actividad somatomotora, así como muerte y tiempo de ocurrencia de la misma. Concluidas las observaciones clínicas, a los 14 días, los animales fueron sacrificados por narcosis con el anestésico Calipsol (ketamina inyectable), por vía intraperitoneal en dosis de 50 mg/kg de peso corporal. Posteriormente se realizó el estudio anatomopatológico macroscópico donde se observaron los siguientes órganos: corazón, pulmón, hígado, estómago, bazo, riñón y ovarios.

Ensayo de irritación de la mucosa oral
El ensayo se llevó a cabo teniendo en cuenta la guía metodológica: Organización Internacional de Normalización (ISO 10993- 10, 1992).

Grupo experimental, dosificación y frecuencia de administración
Se formaron 2 grupos experimentales de 3 animales cada uno, un grupo tratado con la sustancia de prueba (GTM) y un grupo control (GC). Al GTM se le administró, mediante pellet de algodón, la sustancia de ensayo (Solución CM-95 TM) con un nivel de inducción magnética de 0,16 T; al GC se le aplicó un pellet de algodón con agua destilada. La administración se realizó en la bolsa gular derecha de cada animal, 5 minutos cada día durante los 7 días que duró el ensayo. Luego que se introdujo el pellet de algodón en la bolsa gular derecha, se colocó alrededor del cuello del animal un collar de 3,4 cm de ancho con el objetivo de evitar la expulsión del mismo y garantizar la respiración y los movimientos normales del animal.

Pesada, duración del ensayo y observaciones
Los animales se pesaron en una balanza digital marca Sartorius, con capacidad de 6000 g y sensibilidad de 0,1 g, en las condiciones ambientales descritas anteriormente. Transcurridos los 5 minutos de exposición al pellet en la bolsa gular derecha se les retiró éste y el collar a cada animal, y se lavó la misma con solución de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9 % para poder determinar macroscópicamente cualquier anomalía en la mucosa oral. Se registraron los resultados para cada animal diariamente.
La apariencia de la mucosa de la bolsa gular de cada animal se describió determinando el grado de irritación para eritema según la Tabla 1 (11).

Tabla 1. Categorización de las sustancias de acuerdo al grado de reacción eritematosa.

Transcurridas 24 horas después de terminado el ensayo (7 días) se examinaron los buches macroscópicamente y se sacrificaron los animales por dislocación cervical. Las bolsas fueron extraídas y fijadas en formaldehído al 10 % procesada rutinariamente para posteriormente realizar el examen histológico. La evaluación histopatológica se realizó teniendo en cuenta los parámetros establecidos por la norma ISO/ DIS 10993-10 y se determinó el índice de irritación. La sustancia de prueba se clasificó de acuerdo a la escala que se presenta en la Tabla 2 (11).

Tabla 2. Clasificación de las sustancias de acuerdo al potencial irritante determinado en las evaluaciones histológicas.

Procesamiento estadístico
Se utilizó el peso corporal y los hallazgos histopatológicos como variables para el tratamiento estadístico. Como medida de resumen para variables cuantitativas se determinaron medidas de tendencia central y dispersión (medias y desviaciones estándar). Para el análisis del peso corporal se verificó los supuestos de normalidad (pruebas de Kolmorov-Smirnov y Shapiro-Wilk) y homogeneidad de varianzas (prueba de Levene) en cada tiempo de evaluación (12). Para determinar diferencias significativas de peso corporal se realizó ANOVA de medidas repetidas, tomando un nivel de significación de p<0,05. La comparación de los componentes principales se realizó con ajuste de Bonferroni.
El procesamiento de los datos se realizó utilizando el programa SPSS 11.5 sobre Windows.

RESULTADOS

Ensayo de toxicidad aguda oral

Signos clínicos
En las observaciones clínicas realizadas a los animales administrados con la Solución CM-95 TM, no se evidenciaron signos clínicos que pudieran asociarse a efectos tóxicos sistémicos. No se reportaron cambios en el pelaje, la coloración y apariencia de los ojos. La actividad somatomotora y el comportamiento de las ratas fue el normal para la especie.
No se registraron muertes.

Comportamiento del peso corporal
El peso corporal como indicador de toxicidad, no arrojo evidencia de toxicidad. En la Tabla 3 puede observarse que se mantuvo un incremento de peso corporal con la aplicación de la dosis límite, durante el período de observación.

Tabla 3. Comportamiento del peso corporal (media ± error standard) en ratas Sprague Dawley hembras durante el ensayo de toxicidad aguda oral por el método de las Clases de Toxicidad Aguda (CTA) de la solución CM-95 TM.

Estudio anatomopatológico
Durante la observación macroscópica no se encontraron alteraciones de valor diagnóstico en ninguno de los órganos inspeccionados durante la necropsia. Los estudios histológicos no mostraron alteraciones en la citoarquitectura de los tejidos estudiados que pudieran ser atribuibles a procesos de tipo tóxicos.
Como no hubo signos clínicos que evidenciaran toxicidad ni muerte en los animales, solo fue necesario un paso con tres ratas. La dosis límite para este estudio se relacionó con el máximo nivel de inducción magnética permisible para la obtención del candidato a inmunopotenciador según la tecnología aplicada. Si se tiene en cuenta que esta adaptación se correspondió con la Dosis Límite: 5000 mg/kg de peso corporal, de acuerdo con las regulaciones establecidas por la OECD (6), lo cual se corresponde con una DL50> 2000 mg/ kg (Tabla 4). Por lo que, es improcedente pasar a los niveles inferiores de inducción magnética en virtud de los resultados mostrados para la dosis de la sustancia en estudio. Así, se enmarcó a esta sustancia como "no clasificada", atendiendo a la escala referida en la Tabla 4 (13), donde este valor se encuentra en el rango máximo.

Tabla 4. Escala de clasificación de las Clases de Toxicidad Aguda (CTA).

Ensayo de irritación de mucosa oral
Las observaciones macroscópicas de mucosa oral no reflejaron presencia de eritema. No hubo signos clínicos que evidenciaran toxicidad, ni muerte, y el comportamiento en general de los animales fue el normal para la especie.
El comportamiento del peso corporal aparece reflejado en la Tabla 5, donde se puede apreciar que se mantuvo un incremento constante de peso corporal, sin que existieran diferencias significativas entre cada tiempo de evaluación (p>0,05) para cada grupo.
En el estudio macroscópico e histopatológico de la mucosa de la bolsa gular derecha de los animales tratados no se observaron alteraciones de valor diagnóstico. El índice de irritación obtenido para el grupo tratado con la Solución CM-95 TM fue de 0, igual que para el grupo control, clasificándose la sustancia ensayada como "no irritante" en el modelo animal, nivel de dosis utilizado y bajo las condiciones experimentales observadas.

Tabla 5. Comportamiento del peso corporal (media ± error standard) durante el ensayo de irritación de mucosa oral.

DISCUSIÓN

Si bien la norma OECD 423, expresa las dosis basadas en cambios de la concentración de la sustancia ensayada; en este estudio se emplea una solución que mantiene su concentración y lo que establece la dosis es la inducción magnética aplicada. Este parámetro en el producto evaluado propicia que se obtengan las propiedades inmunoestimulantes reportadas. Siendo así, se homologó el parámetro de concentración tradicionalmente utilizado con la inducción magnética. En la literatura científica se reportan estudios toxicológicos en los cuales se evalúan los efectos toxicológicos del campo magnético. De igual forma que para este estudio se tienen en cuenta las intensidades de campo magnético aplicadas, como parte de la dosis (14-17). Teniendo en cuenta la Tabla 4, se escogió la máxima inducción magnética permisible (0,16 T), por la tecnología empleada y validada en el CNEA, que además de sus efectos como dosis superior a la efectiva, tiene más probabilidad de causar daño o muerte a una parte o a la totalidad de los animales.
Un indicador importante en la toxicidad de cualquier sustancia lo constituyen las manifestaciones clínicas, ya que es posible determinar daños asociados a lesiones en sistemas de órganos, que traen por resultado cambios en sus funciones. Además, se plantea que toda sustancia tóxica produce alteraciones anatomofisiológicas que se manifiestan en modificaciones en el cuadro clínico general, y éstas dependen de la severidad y extensión de la lesión, así como de los sistemas de órganos involucrados, duración de la exposición, cantidad total de la sustancia en sangre, edad y salud general del animal (18).
Las observaciones clínicas muestran ausencia de toxicidad para esta solución tratada magnéticamente; pues no se observaron alteraciones etológicas ni morfológicas en ninguno de los ensayos realizados.
Los datos referentes al peso corporal poseen una gran sensibilidad para detectar alteraciones debidas a productos químicos de baja toxicidad. El peso corporal es uno de los indicadores que mayor información ofrece en los estudios toxicológicos (19).
Los resultados muestran incremento del peso en los animales utilizados en los estudios preclínicos ensayados, lo cual constituye un índice indirecto de la no toxicidad de la Solución CM-95 TM, durante todo el tiempo que duraron los mismos, teniendo en cuenta que la disminución del peso corporal es un indicador de alteraciones en la salud general del animal.
El índice de irritación sobre mucosa oral obtenido para la Solución CM-95 TM se encuentra cercano al del grupo control (0), siendo este un excelente índice para productos considerados aptos para el empleo en humanos (11).

CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos en estos estudios, se puede afirmar que en los modelos animales empleados, nivel de dosis utilizado y bajo las condiciones experimentales observadas, la solución CM-95 TM, se enmarca como "no clasificada" y "no irritante" para los ensayos de toxicidad aguda oral e irritación sobre mucosa bucal respectivamente.

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