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Acta toxicológica argentina

versión On-line ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. v.17 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./jul. 2009

 

Alteraciones del desarrollo embrionario, poliaminas y estrés oxidativo inducidos por plaguicidas organofosforados en Rhinella Arenarum

Lascano, Cecilia Inés; Sotomayor, Verónica; Ferrari, Ana; Venturino, Andrés*

LIBIQUIMA, Instituto Multidisciplinario de Investigación y Desarrollo de la Patagonia Norte (IDEPA) - CONICET - Universidad Nacional del Comahue - Buenos Aires 1400. Neuquén (8300), Argentina.
*Autor a quien dirigir la correspondencia: aventu1@yahoo.com.ar

Resumen: Los plaguicidas organofosforados (OP) son masivamente aplicados en el Alto Valle de Río Negro y Neuquén, afectando al ecosistema. Utilizamos un modelo embrionario de anfibios (Rhinella arenarum) para estudiar mecanismos por los cuales OP como metilazinfos (MA) y clorpirifos (CP) podrían provocar teratogénesis. Los embriones fueron desarrollados en diferentes concentraciones de MA o CP hasta opérculo completo (OC), analizando: malformaciones, histología, glutatión reducido (GSH) y enzimas antioxidantes, poliaminas, actividad de ornitina-decarboxilasa (ODC) y proteínaquinasa- C (PKC).
Ambos OP provocaron un incremento tiempo/concentración-dependiente de malformaciones, llegando a 100% de teratogénesis en estadios avanzados y a las mayores concentraciones, incluyendo: exogastrulación, curvaturas de aleta caudal, acortamiento axial, edema, y atrofia branquial. Se evidenció una condición de estrés oxidativo creciente: las enzimas GSH-dependientes (S-transferasa (GST), peroxidasa y reductasa) fueron inducidas tempranamente a bajas concentraciones, pero inhibidas en el estadio de OC a altas concentraciones, junto con una caída significativa de GSH (62%) para MA. MA incrementó significativamente (18X) la actividad de ODC en OC, aumentando los niveles de putrescina (60%) pero disminuyendo espermidina (56%) y espermina (100%); CP disminuyó en estadios tempranos la actividad de ODC y niveles de poliaminas.
La disminución de poliaminas podría deberse al incremento de degradación por poliamino-oxidasa, contribuyendo al estrés oxidativo inducido por OP. Esto causaría la disminución de GSH, y la activación de PKC en OC (55%), que participaría en el control positivo de GST y ODC. Finalmente, el estrés oxidativo y la disminución en los niveles de poliaminas podrían ser causantes de alteraciones del desarrollo embrionario.

Palabras clave: Teratogénesis; Anfibios; Plaguicidas; Biomarcadores

Abstract: Alterations in embryonic development, polyamines and oxidative stress induced by organophosphates in Rhinella arenarum. Organophosphate (OP) pesticides are widely applied in the region of Alto Valle de Río Negro y Neuquén, affecting the ecosystem. We use an amphibian embryonic model (Rhinella arenarum) in order to assess the mechanisms by which the OP pesticides azinphos methyl (AM) and chlorpyrifos (CP) could cause teratogenesis. The embryos were developed in different concentrations of AM or CP until they reached the stage of complete operculum (CO). We analyzed malformations, histology, reduced gluthatione content (GSH) and activity of antioxidant enzymes, polyamine content, ornithine decarboxilase (ODC) and protein kinase C (PKC) activities.
Both OP pesticides caused a time- and dose-dependent increase in the number of malformations, reaching 100% teratogenesis in late embryonic development at the highest OP concentrations used. Malformations assessed include exogastrulation, caudal fin curvature, axial shortening, edema, and gill atrophy. Increasing evidence of oxidative stress was observed: GSH dependent enzymes (S- transferase, GST; peroxidase and reductase) were early induced in embryos exposed to low concentrations of the OP pesticides, but their activities were inhibited in the stage of CO at high concentrations of OP. These changes were accompanied by a significant decrease in GSH content (62%) in embryos exposed to AM. Besides, AM significantly increased (18X) ODC activity in the stage of CO, along with putrescine levels (60% of increase) but spermidine and spermine levels were significantly decreased (56% and 100%, respectively). The OP pesticide CP caused and early decrease in ODC activity and polyamine levels.
The decrease in polyamine levels could be due to an increase in their degradation by polyamine oxidase, contributing to the oxidative stress induced by OP. This, in turn, would cause the decline in GSH levels and the activation of PKC in the embryonic stage of CO (55%), which is involved in the positive feedback of GST and ODC. Finally, the oxidative stress and the decrease in PA levels could be the cause of the observed embryonic alterations.

Keywords: Teratogenesis; Amphibians; Pesticides; Biomarkers

INTRODUCCIÓN

El sapo común Rhinella arenarum (anteriormente Bufo arenarum, Hensel) es una especie ampliamente distribuida en Argentina. Al igual que otros anuros, se encuentra ubicado estratégicamente en la cadena trófica y es sensible a la contaminación ambiental durante su desarrollo embrionario y larval, periodos en los que su hábitat es acuático (1). R. arenarum se encuentra amenazado en zonas de intensa actividad frutícola como consecuencia de la contaminación acuática por aplicación masiva de plaguicidas organofosforados (OP) (2). Particularmente, metilazinfos (MA) es el principal OP aplicado en el Alto Valle de Río Negro y Neuquén, tanto en la frecuencia de aplicación (cada 15 días en el período productivo; 0,7 kg por hectárea) como en la cantidad empleada, alcanzando un total de 600 toneladas de MA pulverizadas sobre 200.000 ha por año (3). Por otra parte, 22,5 toneladas del OP clorpirifos (CP) son aplicadas anualmente a razón de 0,72 kg por ha. MA y otros OP han sido detectados en aguas subterráneas y superficiales del valle (2,4). Por lo tanto, por efecto de la deriva y el escurrimiento, dichos plaguicidas podrían afectar la fauna acuática que habita los cuerpos de agua de la región como estadios larvales de R. arenarum (5).
Las especies reactivas del oxígeno (EROs) son producidas constantemente en animales aeróbicos durante su metabolismo normal y participan en el control fisiológico de diversas funciones celulares. La exposición a contaminantes ambientales como plaguicidas y otros químicos pueden aumentar la producción de EROs y afectar el estado redox normal de la célula (6). El sistema antioxidante comprende un grupo de enzimas y compuestos antioxidantes de bajo peso molecular como vitamina E, ácido ascórbico, GSH y otros tioles no proteicos (7). Entre las enzimas, la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT) constituyen la primera línea de defensa antioxidante. Además, las enzimas dependientes de GSH participan en la detoxificación y los procesos antioxidantes. Entre ellas se encuentran las GSH peroxidasas dependientes o no de Se (GPox), la GSH-reductasa (GR) y las GSH-transferasas (GST). Además de su papel como co-sustrato de las enzimas dependientes de GSH, este tripéptido actúa como barredor de EROs contribuyendo al control del estado redox celular (8). GSH se encuentra en altas concentraciones dentro de la mayoría de las células y participa de diversas reacciones metabólicas (9). Se ha informado que una disminución del 20-30% en los niveles de GSH podría afectar la respuesta antioxidante y conducir al daño oxidativo y muerte celular (10,11). Las defensas antioxidantes son esenciales durante el desarrollo embrionario (12-14), ya que el aumento de EROs podría alterar el desarrollo normal y conducir a la aparición de malformaciones (15,16). En embriones de la rana africana, Xenopus laevis, las enzimas dependientes de GSH aumentan su actividad en respuesta a la exposición al aire y a la luz luego de la eclosión de los embriones, momento a partir del cual el riesgo de exposición a contaminantes ambientales también se incrementa (13). Diversas líneas demuestran que contaminantes agroquímicos podrían actuar como pro-oxidantes, generando EROs y afectando la actividad de las enzimas del sistema antioxidante (17-21). Además de su acción anticolinesterásica, los plaguicidas OP son capaces de inducir estrés oxidativo y/o alterar la respuesta antioxidante de diferentes especies acuáticas (21-23). La detoxificación de MA y otros OP conduce al consumo de glutatión reducido (GSH) debido a la actividad de glutatión- S-transferasas (GST) (11), enzimas que resultan inducidas por compuestos electrofílicos. La actividad de proteína quinasa C (PKC) se incrementa por estos compuestos, fosforilando y activando al factor Nrf2, el cual incrementa la transcripción de GST (24,25). Por lo tanto, el estudio de las defensas antioxidantes de Rhinella arenarum es importante a fin de comprender los efectos subletales que surgen de la exposición a plaguicidas y que contribuyen al declinamiento de las poblaciones de anfibios.
Por otra parte, entre los factores involucrados en el desarrollo normal y patológico, se ha demostrado la importancia fundamental de las poliaminas (PAs) (26-28). Los niveles alterados de PAs han sido relacionados con el cáncer y la respuesta a toxicidad (29,30). La degradación oxidativa de PAs por poliamino oxidasa (PAO) y diamino oxidasa (DAO) genera metabolitos tales como H2O2 y acroleína, involucrados en el estrés oxidativo (31,32). A su vez, los niveles de PAs son regulados en el primer paso biosintético a través de la actividad de la enzima clave ornitina decarboxilasa (ODC), que se encuentra a su vez altamente regulada por diversos factores de crecimiento a nivel transcripcional, traduccional, postraduccional y degradación dirigida por antizima (28,33,34). Las PAs intracelulares participan prácticamente en todos los niveles de regulación.
Se ha descripto la interacción tóxica entre el insecticida OP malatión y PAs exógenas en el sapo común Rhinella (Bufo) arenarum (35), hallando efectos sobre los niveles endógenos de éstas, la actividad de esterasas y estrés oxidativo (10,36). Sin embargo, no han sido aún dilucidados los mecanismos de acción de OP sobre la síntesis y degradación de PAs. Es importante además evaluar el impacto de OP sobre la regulación de ODC, ya que los xenobióticos desencadenan la regulación de diversos genes en respuesta al estrés (24,25,37), incluido el gen de ODC (38,39). Por lo tanto, el propósito del presente trabajo fue evaluar el impacto de los insecticidas organofosforados en embriones de Rhinella arenarum analizando alteraciones en el desarrollo embrionario y diversos factores que afectan el mismo, como: el metabolismo de PAs, el sistema antioxidante y PKC.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención y exposición de embriones de Rhinella arenarum
La ovulación de hembras de R. arenarum se indujo por inyección de 2500 UI de gonadotrofina coriónica humana. Los ovocitos obtenidos se fertilizaron in vitro con homogenado de testículo. Los embriones fueron expuestos de manera continua a los plaguicidas OP desde fertilización, sin retirar su cubierta gelatinosa, hasta el último estadio embrionario de opérculo completo (OC) en recipientes de vidrio. Se mantuvo una relación de 1 embrión/mL medio Ringer de anfibios para los controles o medio Ringer más plaguicida para los expuestos. Se realizaron soluciones estándar de ambos plaguicidas en acetona. La concentración final del solvente en la solución de ensayo no fue mayor a 0,3%. Las concentraciones de metilazinfos (MA) ensayadas fueron 0,5 mg/L, 2 mg/L y 9 mg/L (CL50 96 h: 15,57 mg/L) (40), y las de clorpirifos (CP) fueron 2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L y 16 mg/L (CE50 48 h para arresto embrionario: 24 mg/L). Se utilizó un esquema semi-estático, con renovación de la solución de plaguicida cada 48 h. El desarrollo de los embriones se monitoreó bajo lupa estereoscópica y se determinaron los estadios embrionarios de acuerdo a Del Conte y Sirlin (41). Se tomaron muestras en los estadios de brote caudal (BC), boca abierta (BA) y OC, que corresponden a 4, 7 y 10 días de desarrollo respectivamente. Cada muestra consistió en 50 embriones (en el estadio de BC) o 25 embriones (en los estadios más avanzados) por mL de buffer de homogenado (buffer fosfato de potasio 143 mM pH 7,4 más 6,3 mM EDTA). Las muestras se tomaron al menos por duplicado de cada tratamiento, en cada experimento independiente. La actividad de enzimas antioxidantes se determinó en sobrenadante de 10000 x g, realizándose por triplicado la determinación para cada muestra. Para la determinación de PKC se tomaron 50 embriones OC en 1 mL de buffer Tris 20 mM pH 7,4 más EDTA 2 mM y EGTA 2 mM, y se utilizó el sobrenadante de 1000 x g. Se realizaron dos experimentos independientes con tratamientos por duplicado. Las determinaciones se realizaron por triplicado para cada muestra.

Monitoreo de malformaciones en embriones de R. arenarum expuestos a MA
Se determinó el porcentaje de embriones malformados en cada estadio y se documentaron los defectos morfológicos encontrados.

Determinación de la actividad de enzimas del sistema antioxidante en embriones expuestos a MA
La actividad de las enzimas involucradas en la reducción de hidroperóxidos: CAT (14,42,43) y GPox Se-dependiente (14,44,45); en el metabolismo de glutatión: GR (14,46); y en la detoxificación de xenobióticos, GST (14,47), se determinó por métodos espectrofotométricos cinéticos.

Determinación del contenido de glutatión reducido (GSH) en embriones expuestos a MA
El contenido de GSH se determinó como tioles ácido-solubles (10,14) en homogenado completo.

Determinación de niveles de poliaminas (PAs) en embriones expuestos a MA y CP
Se prepararon los derivados dansilados de las PAs putrescina (Put), espermidina (Spd) y espermina (Spm), y se determinaron sus niveles por HPLC en fase reversa (48).

Determinación de la actividad enzimática de Ornitina Descarboxilasa (ODC) en embriones expuestos a MA y CP
La actividad de ODC se determinó utilizando 14C-Ornitina como sustrato para monitorear la reacción de decarboxilación. El 14CO2 liberado por la actividad de ODC presente en la muestra fue atrapado en un papel de filtro embebido en KOH 2M. Dicho papel se transfirió a un vial y se llevó a contador de centelleo líquido (49).

Análisis inmunohistoquímico de ODC en embriones expuestos a MA
Se analizó la presencia y distribución embrionaria de la proteína ODC por métodos inmunohistoquímicos descriptos para larvas de R. arenarum por Yovanovich et al. (50). Se utilizó un anticuerpo primario de conejo contra ODC humana (Santa Cruz Biotechnology; ODC (H- 71) sc-33539) y un anticuerpo secundario biotinilado anti IgG de conejo, seguido del agregado de estreptavidina-peroxidasa de rábano. El revelado de los cortes se realizó utilizando diaminobencidina.

Actividad de proteína-quinasa C (PKC) en embriones expuestos a MA
La actividad de proteína-serina/treonina-quinasas basal y PKC se realizó en sobrenadante de 1000 x g de embriones en OC (51,52). Se utilizó histona como sustrato, en presencia o no de diacil glicerol/fosfatidil serina y Ca2+ como activador específico para PKC, y se inició la reacción con 32PγATP. Se terminó la reacción con ácido fosfórico en papel de fosfocelulosa. Se midió la radioactividad de histona fosforilada por centelleo líquido.

Análisis estadístico
Se realizaron al menos dos experimentos independientes para cada estudio, a partir de ovulaciones distintas, en los cuales cada tratamiento se realizó por duplicado, excepto para el análisis de mortalidad y malformaciones donde se realizaron triplicados. Los datos se analizaron por ANOVA seguido de Fisher LSD como test a posteriori. Para los datos de porcentaje de malformaciones se realizó previamente una transformación arcsen (raíz cuadrada (porcentaje/100)).

RESULTADOS

Monitoreo de malformaciones en embriones de Rhinella arenarum
El porcentaje de embriones malformados se incrementó significativamente en embriones expuestos a 2 mg/L y 9 mg/L MA (Tabla 1), tanto en el estadio de BA como en el de OC. Se alcanzó un 100% de embriones malformados en OC debido a que todos se encontraban arrestados en el desarrollo. Bajas concentraciones de CP no causaron un incremento significativo del número de malformaciones, mientras que 16 mg/L (valor cercano a la CL50) produjo malformaciones significativas desde BC, llegando al 100% en OC. Entre las malformaciones y defectos del desarrollo se observaron: arresto del desarrollo en estadios tempranos con exogastrulación y profusa descamación celular, atrofia, protuberancias notorias en el cuerpo que alteraron la movilidad, desbalance hídrico con desarrollo de hidropesía con distintos grados de severidad, alteraciones de la aleta caudal, etc. (Figuras 1 y 2). La exposición al plaguicida MA incrementó la frecuencia de aparición de dichas situaciones.

Tabla 1. Porcentaje de malformaciones en embriones de R. arenarum expuestos a MA o CP.


Figura 1
. Morfología de embriones de R. arenarum expuestos a MA. A. Embrión control en estadio de respuesta muscular (4 días). B, C, D. Embriones en estadio de respuesta muscular expuestos a 0,5, 2 y 9 mg/L MA, respectivamente. E. Embrión control en estadio de circulación en aleta caudal (7 días y medio). F, G, H. Embriones en estadio de circulación en aleta caudal expuestos a 0,5, 2 y 9 mg/L MA, respectivamente. I. Embrión control en estadio de opérculo completo (10 días). J, K, L. Embriones en estadio de opérculo completo expuestos a 0,5, 2 y 9 mg/L MA, respectivamente.


Figura 2
. Malformaciones en embriones de R. arenarum en estadio de brote caudal expuestos a 16 mg/L CP desde fertilización. A. Control; B-F. Expuestos a CP.

En la Figura 3 se muestran cortes transversales de embriones de R. arenarum en estadio de BC. Los embriones expuestos a CP poseen una mayor masa vitelina endodérmica, un arquenterón (intestino primitivo) de reducidas proporciones, primordios pronéfricos de gran tamaño, y alteración de somitas, entre otros.

Figura 3. Histología de embriones de R. arenarum en estadio de BC en embriones control (izquierda) y embriones expuestos a 2 mg/L CP (derecha).

Efecto del plaguicida MA sobre el sistema antioxidante
Se procedió a la determinación del contenido de GSH y de la actividad de las enzimas CAT, GST, GR y Gpox Se-dep en embriones de R. arenarum. El contenido de GSH se incrementó en los controles a lo largo del desarrollo emarbrionario de R. arenarum (Tabla 2), y la exposición al plaguicida OP MA causó una tendencia al incremento a bajas concentraciones de MA y una caída en sus niveles cuando los embriones fueron expuestos a 9 mg/L (53% y 45% de disminución en los estadios de BA y OC respectivamente).

Tabla 2. Niveles de GSH (nmol/mg prot) en embriones de R. arenarum expuestos en forma continua a MA.

Por otra parte, la respuesta del sistema enzimático antioxidante fue más variable (Tabla 3). La actividad enzimática de CAT se mantuvo elevada y constante durante todo el desarrollo embrionario; no se observaron cambios significativos en su actividad por exposición al plaguicida MA. La actividad enzimática de GPox Se-dep se incrementó a lo largo del desarrollo embrionario. En los estadios de BC y BA se verificó una tendencia al incremento en la actividad de GPox Se-dep en embriones expuestos a la menor concentración de 0,5 mg/L MA, que fue reduciéndose proporcionalmente a mayores concentraciones llegando a una tendencia a la disminución en embriones expuestos a 9 mg/L MA. En el estadio de OC la actividad de GPox Se-dep disminuyó significativamente en embriones expuestos a MA, excepto para la concentración de 2 mg/L, probablemente debido a la alta dispersión experimental obtenida. La actividad enzimática de GST se incrementó significativamente en el estadio de BC a las tres concentraciones de MA empleadas: 23%, 29% y 32% para 0,5, 2 y 9 mg/L MA, respectivamente. Dicho incremento se revirtió luego de 7 días de exposición (BA), mientras que en el estadio de OC para embriones expuestos a 9 mg/L MA la actividad de GST disminuyó significativamente un 14% respecto del control.

Tabla 3. Actividad de CAT, GPox Se-dep, GST y GR en embriones expuestos en forma continua a MA.

La actividad enzimática de GR se incrementó significativamente en un 66% en el estadio de BA frente a 2 mg/L MA. En OC la actividad de GR fue mayor que en estadios anteriores, siendo inducida significativamente por exposición a 0,5 mg/L y 2 mg/L MA en un 53% y 69% respectivamente, mientras que en embriones expuestos a 9 mg/L MA la actividad retornó a valores control. Observamos una correlación directa (r=0,877; p=0,0008) entre la depleción de las reservas de GSH y la frecuencia de aparición de alteraciones morfológicas en los embriones expuestos al plaguicida MA (Figura 4). Esto sugiere una conexión entre el estado de estrés oxidativo, dado por la caída en los niveles de GSH, y la alteración de procesos de proliferación y/o diferenciación celular que llevan a la aparición de malformaciones.


Figura 4
. Correlación entre el porcentaje de malformaciones y la inhibición de GSH en embriones de R. arenarum expuestos en forma continua a MA.

Efectos de los plaguicidas OP sobre el metabolismo de PAs
Los niveles de PAs se incrementaron paulatinamente durante el desarrollo embrionario de R. arenarum. Put es la PA mayoritaria, seguida por Spd y Spm, que alcanzó niveles detectables en el estadio de OC (0,25 nmol/mg prot). CP (8 y 16 mg/L) produjo una caída temprana de Put y de Spd (Figura 5). Por otra parte, los niveles de Put se incrementaron significativamente en un 60% en embriones expuestos a 9 mg/L MA en el estadio OC, a diferencia de los niveles de Spd que sufrieron un descenso altamente significativo del 56% en dicho estadio, respecto de embriones control (Tabla 5). El tratamiento con 9 mg/L MA provocó también un descenso en los niveles de Spm por debajo del límite de detección de la técnica.

Tabla 5. Niveles de Put, Spd y ODC en embriones expuestos a MA.


Figura 5
. Niveles de PAs y actividad específica de ODC en embriones de R. arenarum en estadio de BC expuestos a CP. Las barras corresponden a Media ± ES de duplicados de tratamiento.

La actividad de ODC en el estadio de BC fue semejante en embriones control y expuestos a MA (Tabla 5), mientras que CP provocó una disminución progresiva hasta los 8 mg/L (Figura 5). La actividad enzimática de ODC de embriones control se incrementó en el estadio de BA respecto a BC; la actividad fue inhibida por la exposición a 0,5 y 2 mg/L MA (53%; p<0,05), mientras que 9 mg/L MA provocó su aumento. En el estadio de OC la actividad de ODC se incrementó en forma altamente significativa en embriones expuestos a 9 mg/L (18 veces), comparado con embriones control. El análisis de correlación de la actividad de ODC y el porcentaje de malformaciones provocado por CP en el estadio temprano de BC marcó una alta correlación negativa; r=0,837, p=0,0001 (Figura 6).


Figura 6
. Análisis de correlación entre el porcentaje de embriones malformados y la actividad específica de ODC en embriones de R. arenarum expuestos a CP (2, 4, 8 y 16 mg/L) hasta el estadio de BC.

Debido a la importancia que reviste la enzima ODC en el metabolismo de PAs, se procedió a su detección inmunohistoquímica. Se detectó claramente la proteína en zonas particulares del embrión, como en las glándulas cementales, siendo la marca más intensa en embriones tratados que en aquellos no expuestos a MA (Figura 7). Esto concuerda con la elevada actividad de ODC determinada en embriones expuestos a 9 mg/L MA (Tabla 5) respecto de embriones control.


Figura 7
. Análisis inmunohistoquímico de ODC en cortes transversales de embriones de R. arenarum en estadio de OC expuestos en forma continua a 9 mg/L MA.
Detalle de las glándulas cementales A) Control. B) Tratado. Las flechas indican células que expresan la proteína ODC.

Se determinó el efecto de la exposición embrionaria de R. arenarum a OP sobre la actividad de proteína quinasas. La actividad de serina/ treonina quinasas basal se incrementó 3,2 veces en embriones en estadio de OC debido a la exposición continua a 9 mg/L MA (0,22±0,01 vs. 0,70±0,08 nmol P/mg prot controles y MA respectivamente; p<0,01). Por otra parte, la actividad medida en condiciones específicas para PKC marcó un aumento altamente significativo debido a MA 9 mg/L respecto tanto a la actividad de PKC en controles (1,08±0,13 vs 0,27±0,01 nmol P/mg prot respectivamente, 4,0X de incremento; p<0,01) como a su actividad quinasa basal (1,5 veces; p<0,05).

DISCUSIÓN

CAT, junto con SOD, constituyen la primera línea de defensa antioxidante en R. arenarum (14) y Xenopus laevis (13). En larvas de rana toro (Lithobates catesbeiana) expuestas a glifosato se verifica un incremento de actividad de dichas enzimas en tejido hepático frente al aumento de EROs provocado por el plaguicida (53). La actividad específica de enzimas relacionadas al glutatión es menor que la actividad de CAT, siendo GST la más activa, seguida por GPox Se-dep y GR. En condiciones basales, la actividad de dichas enzimas responde a cambios en el ambiente del embrión, como una mayor exposición al O2 ambiental al momento de la eclosión o al procesamiento del agua a través de sus branquias (13,14). GST es una enzima detoxificante de fase II que se encuentra bajo control del factor de transcripción Nrf2, a través del elemento de respuesta antioxidante (ARE). GST incrementa significativamente su actividad por exposición a MA en embriones en BC como respuesta detoxificante, siendo finalmente inhibida en embriones en OC expuestos a la mayor concentración ensayada. La inhibición de la actividad específica de GPox Se-dep en el estadio de OC en embriones expuestos a MA, de manera similar a lo que ocurre con GST, sugiere un efecto debido a un exceso de EROs que supera las defensas antioxidantes, situación debida probablemente a lo prolongado de la exposición a la concentración más alta de MA ensayada (9 mg/L). Como se mencionó anteriormente, GR posee una baja actividad en embriones de R. arenarum comparada con otras enzimas dependientes de glutatión. Esto ha sido observado en otros embriones de anfibios (13). Hay una clara inducción de la actividad de GR en embriones expuestos hasta OC a 0,5 y 2 mg/L de MA. El incremento de actividad de GR podría indicar la necesidad de reciclar el GSH que habría sido oxidado por el aumento de EROs inducido por MA. Por otra parte en embriones expuestos a 9 mg/L MA la actividad es semejante a los valores control. Esto es concordante con lo descripto previamente para GPox, reforzando entonces la hipótesis del predominio de EROs sobre la capacidad antioxidante. Los resultados sugieren claramente una situación de estrés oxidativo en donde el GSH es depletado gradualmente; la respuesta inductiva sobre la síntesis de GSH y las enzimas antioxidantes se vería sucesivamente superada por el impacto de EROs sobre sitios susceptibles de ataque sobre las proteínas.
La correlación observada entre la depleción de GSH y la proporción de malformaciones observadas (Figura 4), lleva a pensar en primer lugar en un efecto dirigido por el estrés oxidativo sobre procesos de proliferación y/o diferenciación celular. La biotransformación de OP por los sistemas oxidativos de detoxificación llevaría a una situación de estrés y consumo de defensas antioxidantes como el GSH. De esta manera, el estrés oxidativo causado por la metabolización de OP podría ser uno de los mecanismos a través de los cuales estos plaguicidas causan malformaciones durante el desarrollo embrionario de anfibios (54).
Es reconocida la importancia de las PAs en diversos procesos celulares que incluyen proliferación, diferenciación, muerte celular e incluso desarrollo embrionario (26). El patrón de PAs determinado en embriones de R. arenarum es coincidente con el de otros anfibios como X. laevis. Put es mayoritaria, seguida de Spd, mientras que Spm es la minoritaria o incluso indetectable (27). El incremento de Put por exposición de los embriones a MA sería consecuencia de un incremento de la actividad de ODC, una de las enzimas limitantes en la biosíntesis de PAs. La disminución de Spd y Spm podría deberse a un incremento en su degradación oxidativa (vía PAO y DAO) o bien a una alteración a nivel de la enzima S-adenosilmetionina decarboxilasa, que proporciona los grupos aminopropilo que se adicionarán sobre Put y que la transformarán en Spd, y luego a ésta en Spm. La degradación oxidativa de Spd y Spm también podría ser causante del aumento de Put. En el estadio de desarrollo temprano BC no se ven alterados los niveles de PAs o la actividad de ODC por exposición a MA. En el estadio de BA se altera la actividad de ODC sin modificar los niveles de PAs, y finalmente, en el estadio de OC se altera tanto la actividad de ODC como los niveles de PAs, incrementándose la actividad de ODC y aumentando Put. Esta situación de incremento de la actividad de ODC desencadenada por la exposición de los embriones a MA sería una respuesta de tipo reparadora u homeostática, a fin de permitir al embrión continuar con su desarrollo. Si bien se requieren profundizar los estudios histoquímicos de expresión de la ODC, en un primer análisis los niveles aumentados de la enzima se corresponderían con una mayor proliferación de ciertos tejidos (Figura 7).
La vía de señalización de respuesta a estrés oxidativo está dirigida por la regulación sobre el factor de transcripción Nrf-2 a través de la disminución de GSH, actuando también positivamente la fosforilación por PKC (24,25). Nuestros resultados son coincidentes con esta vía de regulación, ya que el OP MA es capaz de aumentar notoriamente la actividad de PKC en el final del desarrollo embrionario, en respuesta a una depleción de GSH por estrés oxidativo. Este aumento es en principio un regulador positivo de GST, que aliviaría el estrés oxidativo, y de ODC, que actuaría en la reparación proliferativa de tejidos. Sin embargo, si los OP aumentasen la degradación oxidativa de las PAs en su acción deletérea sobre tejidos, estarían entonces potenciando el estrés oxidativo y provocando en consecuencia un mayor daño (10,33). Por su parte, CP produjo un descenso de la actividad de ODC que concuerda con la disminución de los niveles de Put y Spd en embriones de desarrollo temprano. El descenso de la actividad de ODC en el estadio embrionario temprano de BC se encuentra altamente correlacionado con el porcentaje de embriones que desarrollan diversas malformaciones. Estas circunstancias serían indicativas de la activación de una vía apoptótica que conduciría finalmente al arresto del desarrollo embrionario. Ambos OP estarían entonces activando diferentes respuestas, debidas a una distinta capacidad pro-oxidante, o bien a acciones a través de vías diferenciales de señalización teniendo en cuenta su variabilidad estructural.

En conclusión, el estrés oxidativo inducido por los insecticidas organofosforados y la acción potenciadora o sinérgica causada por su efecto sobre el metabolismo de PAs conllevaría a una alteración de los procesos de proliferación y diferenciación, al modificar la actividad de diversos factores de transcripción relacionados al destino celular, ocasionando así las alteraciones observadas a nivel del desarrollo embrionario de Rhinella arenarum.

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