ARTÍCULOS ORIGINALES

Comparación entre dos métodos de producción para la elaboración de antivenenos ofídicos

de Roodt, Adolfo Rafael^{1 (*)};Litwin, Silvana¹; Estevez, Judith²; Gould, Eduardo G.³; Dolab, Jorge A.¹; Gould, Jorge⁴ *

¹I.N.P.B.–A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”. Av. Vélez Sarsfeld 563, CP 1281, Ciudad de Buenos Aires, Argentina.
²INDRE, México DF, México.
³Laboratorio Gulcos, Pte. Perón, Provincia de Buenos Aires.
⁴In Memoriam.
*Corresponding author: aderoodt@gmail.com

Resumen: Las mordeduras producidas por serpientes venenosas son un serio problema médico en varias regiones del mundo y sobre las cuales los sistemas de salud actúan en diferentes grados en lo referente a tratamiento y prevención. Sin embargo, el tratamiento de las mordeduras de serpientes venenosas en animales domésticos puede resultar difícil por diversos motivos, siendo uno de estos la baja oferta o ausencia de antivenenos para uso veterinario. Las presiones comerciales en la industria farmacéutica han llevado a una reducción en la producción de antivenenos en varias partes del mundo, su disponibilidad es, a veces, bastante limitada y en algunos casos, son imposibles de conseguir. En este trabajo, inmunizamos caballos con veneno de serpientes Sudamericanas para obtener el plasma hiperinmune que fue procesado para obtener IgG entera o fragmentos F(ab´)₂ usando dos métodos convencionales (fraccionamiento por ácido caprílico o doble precipitación salina y digestión con pepsina). Los antivenenos así obtenidos fueron probados en sus características bioquímicas e inmunoquímicas, así como en su potencia neutralizante. El SDS-PAGE de los antivenenos mostró bandas en el orden de los 150 y 100 kDa en los antivenenos conteniendo IgG entera o fragmentos F(ab´)₂, respectivamente. La presencia de albúmina o contaminantes de alto o bajo peso molecular no fue detectada en ninguna de las preparaciones. No se observaron diferencias importantes en la potencia neutralizante de los antivenenos, aunque el costo de producción fue mucho más bajo en la obtención de IgG completa. A partir de esto, se sugiere que los bajos costos de producción en la obtención de antivenenos de IgG entera para uso veterinario, hacen a esta tecnología adecuada y rentable cuando la producción de F(ab´)₂ no es posible.

Palabras clave: Serpiente; Antiveneno; Veneno; Acido caprílico.

Abstract: Snake Antivenin: Comparison Between Two Production Methods. Bites by venomous snakes are a serious medical problem in several regions of the world, on which the different health systems act with different modalities. Nevertheless, the treatment of venomous snakebites in domestic animals can turn diffcult due several problems among which, the conspicuous, is the low availability or lack of antivenoms for veterinary use. As commercial pressures on the pharmaceutical industry have led to a reduction in the production of antivenins in several parts of the world, their availability is sometimes rather limited and sometimes these products are impossible to obtain. In this work, we immunized horses with venom of South American vipers to obtain hyperimmune plasma. The plasma was processed to separate whole IgG of F(ab´)₂ fragments using two conventional methods (caprylic acid fractionation or double saline precipitation and pepsin digestion). The obtained antivenins were tested for their biochemical and immunochemical characteristics and neutralizing potency. The SDS-PAGE of the antivenins showed, in the processed antivenin, bands in the order of 150 and 100 kDa in the whole IgG or F(ab´)₂ fragments, respectively. The presence of albumin or contaminants of high or low molecular weight was not detected in any of the preparations. No important differences were observed in the neutralizing potency of the antivenins, although production cost was very low with the method used to obtain pure IgG. The low production cost makes the production of antivenins for veterinary use proftable when the production of F(ab´)₂ fragments is not possible.

Keywords: Snake; Antivenin; Venom; Caprylic acid.

INTRODUCCIÓN

Las mordeduras de serpientes venenosas son emergencias médicas muy frecuentes en ciertas regiones del mundo, causando miles de muertes y discapacidades físicas permanentes cada año (Theakston y col. 2003). Las mordeduras por serpientes venenosas no sólo son comunes en humanos, sino también en animales domésticos en áreas rurales y salvajes de América (de Roodt y col. 1994; Mendez y Riet-Correa 1995; Hackett y col. 2002; de Roodt y col. 2002, 2006), Asia (Akhatari y Bhoop 1983; Yeruham y Avidar 2002), Australia (Pascoe 1975; Barr 1984; Robertson y col. 1992; Mirtschin y col. 1998), África (Lawal y col. 1992; Vaughan-Scott y Lobetti 1995; Leisewitz y col. 2004; Lobetti y Joubert 2004) e incluso en Europa, aunque la frecuencia es menor, en donde también se registran accidentes por serpientes venenosas en animales (Kangstrom 1989; Arbuckle y Theakston 1993; Kraft y col. 1998). Estos accidentes no se limitan a animales domésticos o humanos en zonas rurales o selváticas sino que pueden incluso ocurrir también en las áreas urbanas (Figura 1).

Figura 1. Siberian husky mordido en la cara cercano al ojo derecho, por un especimen de Bothrops alternatus (Serpentes,Viperidae) en Berisso (en el Sur de la ciudad de Buenos Aires). Fotografía de la Dr. Susana Robelo.

Las mordeduras de serpientes tienen una morbilidad y mortalidad signifcativa en animales domésticos en regiones como Sudáfrica y Australia (Leisewitz y col. 2004) y en algunas regiones de Sudamérica que presentan fauna y características geográfcas y climáticas similares, variando éstas últimas entre los climas templado y subtropical (de Roodt y col. 1994; Bicudo 2003). Sin embargo, aún cuando las mordeduras por serpientes venenosas son comunes en animales domésticos en algunas de estas áreas, el tratamiento específco de estos accidentes es bastante difcultoso debido a la baja disponibilidad y el alto costo del antiveneno, el único tratamiento específco aceptado para este tipo de envenenamiento (WHO 1981; Theakston y col. 2003). Recientemente, debido a presiones comerciales algunos laboratorios productores de antivenenos cesaron o redujeron drásticamente la producción, llevando a un aumento de la escasez ya existente y, por lo tanto, a la falta de disponibilidad de antivenenos para humanos en varias partes del mundo (Theakston y col. 2003; Chippaux y col. 2005; Stock y col. 2007). Obviamente, esto también infuyó en la disponibilidad de antivenenos para uso en animales, lo que es importante dado que no es poco común que los animales domésticos sean tratados con antivenenos para uso humano. El precio de estos productos puede variar desde diez a cientos de dólares estadounidenses por ampolla, y es muy común que no estén incluidos en el stock usual de medicinas en la práctica veterinaria, debido a su alto costo y/ o baja disponibilidad. Su precio es alto, entre otras razones, debido al proceso de purifcación a que son sometidos los plasmas hiperinmunes para purifcar las fracciones con inmunoglobulinas, el cual representa el principal costo de producción.
En los comienzos de la seroterapia, los tratamientos para mordeduras de serpientes o infecciones tóxico-infecciosas como difteria o tétanos consistían en la inyección de suero hiperinmune completo de equino (von Behring y Kitasato 1890; Physalix y Bertrand 1894; Calmette 1984). Luego de éste período inicial, la presentación farmacéutica de los antivenenos y antitoxinas se fue modifcando para disminuir el alto número de reacciones adversas producidas por el suero entero. Estas modifcaciones consistieron en la eliminación de la albúmina, las globulinas no inmunes y otras proteínas no inmunes del suero. Los procesos de purifcación de plasma hiperinmune o suero tienden a obtener solamente las inmunoglobulinas purifcadas, químicamente modifcadas o enzimáticamente tratadas a fn de bajar la ocurrencia de reacciones adversas (de Roodt y col. 2004). Estas modifcaciones fueron llevadas a cabo para evitar, o al menos disminuir, reacciones de hipersensibilidad y anaflactoides causadas cualitativamente por la inoculación de proteínas extrañas y cuantitativamente por la gran cantidad de proteínas inoculadas en el torrente sanguíneo (Grasset y Christensen 1947; Christensen 1966; Morell 1986), dado que la cantidad de proteínas inyectadas es un importante factor involucrado en el desarrollo de reacciones adversas (Cardoso y col. 1993). Las reacciones adversas ocurridas por la inyección de proteínas heterólogas como los antivenenos son bastante frecuentes en humanos (Sutherland y Lovering 1979; Reid 1980; Sullivan 1987; Moran y col. 1998). En el caso de los antivenenos ofídicos, en casi todo el mundo son producidos en caballos (Theakston y Warrell 1991) debido a las excelentes características de estos animales para la producción de sueros hiperinmunes (Sjostrom y col. 1994). Las globulinas hiperinmunes en el suero equino son IgG, particularmente del isotipo IgG(T) (Ek 1974; Fernández y col. 1997), un isotipo altamente glicosilado y muy antigénico, debido a las características químicas de las glicoproteínas. En los animales domésticos, sin embargo, las reacciones adversas producidas por el uso de antivenenos o antitoxinas purifcadas parecen ser menos frecuentes e intensas que aquellas descriptas para los humanos (de Roodt y col. 1997; Leisewitz y col. 2004).
En vista de estos hechos, estudiamos la potencia neutralizante de dos antivenenos producidos en equinos mediante dos metodologías diferentes. Por un lado, la mayormente recomendada para uso humano, los fragmentos F(ab´)₂ (Krif y col. 1999), siendo ésta la presentación que suele utilizarse ampliamente desde hace muchas décadas, y por otro lado, un antiveneno conteniendo la molécula de IgG entera, obtenido por precipitación ácida, que más recientemente se ha comenzado a utilizar también para el tratamiento de humanos (Rojas y col. 1994). A tal efecto, inmunizamos caballos con veneno de tres especies de serpientes del Género Bothrops de Argentina con gran importancia médica para hombres y animales (de Roodt y col. 1994; de Roodt y col. 1996) y responsables de más del 98% de los accidentes por serpientes venenosas en humanos en Argentina (Ministerio de Salud 2007). El plasma hiperinmune fue obtenido y procesado por el método de Pope (1939a; 1939b) y Pope y Stevens (1951), para obtener fragmentos F(ab´)₂ o a través del fraccionamiento con ácido caprílico (octanoico) para obtener IgG entera (Rojas y col. 1994), logrando así antivenenos con las preparaciones farmacéuticas más comunes (fracción F(ab´)₂ o IgG a molécula completa). Se midió entonces la potencia neutralizante de ambas preparaciones para comparar ambas metodologías de obtención a partir de una misma fuente de plasma hiperinmune.

MATERIALES Y MÉTODOS

Equinos
Para el plan de inmunización se utilizaron quince equinos mestizos de 300 a 500 kg de peso, en buen estado de salud, negativos para anemia infecciosa equina y piroplasmosis y desparasitados con albendazol–praziquantel. Los equinos se mantuvieron a campo durante todo el proceso de inmunización, en San Vicente, provincia de Buenos Aires.

Venenos
Se utilizaron venenos de B. alternatus, B. neuwiedii (sensu lato) y B. jararacussu obtenidos a partir de especímenes sanos provistos por el Serpentario del “Centro Zootoxicológico de Misiones”, Oberá, Misiones, Argentina. Considerando la alta reactividad cruzada observada entre los venenos de serpientes del género Bothrops (de Roodt y col. 1998), esta mezcla inmunogénica se consideró adecuada para obtener un antiveneno que pueda ser usado para neutralizar el veneno de estas serpientes. Los venenos fueron obtenidos por extracción manual, inmediatamente secados in vacuo y almacenados a –20ºC hasta su uso. La potencia letal fue determinada usando la técnica descripta por Meier y Theakston (1986).

Esquema de inmunización
Los equinos fueron inmunizados usando el método descripto por de Roodt y col. (1996) con leves modifcaciones. Brevemente, los caballos fueron inoculados por vía subcutánea (s.c.) los días 1, 15, 30, 45, 55 y 65 con 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 y 4,0 mg de una mezcla de los venenos en partes iguales, en diferentes puntos en el lomo. En las primeras inmunizaciones (días 1 a 30), los venenos fueron inactivados con EDTA 10 mM en concordancia con la técnica sugerida por Higashi y col. (1989). En el protocolo de inmunización, el veneno fue inoculado con Adyuvante de Freund Completo (día 1) o Adyuvante de Freund Incompleto (día 15) o con 10% de gel de Al(OH)₃ (días 30 y 45) o fnalmente, sólo con NaCl 0,15 M (en los días restantes). En el esquema de reinmunización, se inocularon 4 mg de veneno con 10% de gel de Al(OH)₃ en el día 1 y se repitió la inoculación de 4 mg de veneno usando sólo NaCl 0,15 M los días 10 y 20. El antiveneno usado en este trabajo, corresponde al primer ciclo de inmunización.

Purifcación de inmunoglobulinas
Las inmunoglobulinas enteras fueron purifcadas por fraccionamiento con ácido caprílico usando técnicas convencionales (Rojas y col. 1994). Los fragmentos F(ab´)₂ fueron purifcados a partir del plasma usando el método de Pope (Christensen 1966). Se agregaron thimerosal 1/10000 y fenol 1/1000 como conservantes en ambos productos fnales.

Determinación de proteínas

Las proteínas fueron determinadas mediante el método de Bradford (Bradford 1976) usando el Protein Assay Kit (BioRad) para los venenos, y por el método de Biuret, usando el kit Proti II (Wiener) para los sueros y antivenenos.

Control de la evolución de la respuesta inmune

Con el objeto de evaluar la cinética de la respuesta inmune, se estudiaron semanalmente muestras individuales de los caballos utilizando la técnica de doble inmunodifusión (método de Ouchterlony) en agarosa 1% (Difco) siguiendo técnicas convencionales (Harlow y Lane 1988). Brevemente, se realizaron diluciones seriadas de las muestras de sueros individuales obtenidas a partir de los equinos hiperinmunizados, las cuales fueron enfrentadas a soluciones de venenos disueltos en NaCl 0,15 M de manera de lograr una concentración de 1 mg/ml e incubados durante 48 hs a temperatura ambiente. Los geles fueron, entonces, observados registrándose la presencia de bandas de precipitación. Teniendo en cuenta experiencias previas no publicadas, el título obtenido a partir del test de doble inmunodifusión para seleccionar a los caballos para su sangrado (testeando suero completo contra una solución de veneno de 1 mg/ml) fue 1/25 o mayor. Finalmente, todas las muestras individuales y el pool constituido por las muestras individuales fueron testeados en ratones CF-1 de 18-20 g enfrentándolos contra 3 dosis letales 50% (DL₅₀) inoculadas por vía intraperitoneal (i.p.) usando la misma técnica que en el experimento de preincubación descripto más adelante. Para el manejo de los animales se siguieron los lineamientos éticos sugeridos por el National Research Council (2002).

Neutralización de la potencia letal de los antivenenos
Ratones CF-1 de 18-20 g fueron desafados con 5,0 DL₅₀ de veneno preincubado con diferentes dosis de antiveneno diluido en NaCl 0,15 M. Luego de 48 hs se registraron las muertes y se determinó la dosis efectiva 50% (DE₅₀: dosis de antiveneno que protege a la mitad de los ratones inoculados) mediante técnicas convencionales (WHO 1981; Theakston y Reid 1983). Los resultados fueron analizados usando el software combinado Prisma-StatMate (GraphPad, Inc., San Diego, CA). La DE₅₀ fue expresada en microlitros y en miligramos de proteína ± desvío estándar. La potencia neutralizante del antiveneno fue también expresada como el número de miligramos de veneno neutralizado por un mililitro de antiveneno (Ministerio de Saúde 1996) o por DL₅₀ neutralizada (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 2000).

Estudios de pureza del antiveneno
La purifcación de ambos antivenenos fue estudiada por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras, en geles al 10% de acrilamida / bis acrilamida siguiendo técnicas convencionales (Laemmli 1970).

Estudios de especifcidad
Fueron realizados por doble inmunodifusión en geles de agarosa enfrentando el antiveneno con anti IgG equina o anti suero total equino usando técnicas clásicas (Ministerio de Saúde 1996).

Estadísticas
Todos los resultados fueron analizados usando el software combinado Prisma-StatMate (GraphPad Inc., San Diego, CA).

RESULTADOS

Las potencias letales de los venenos fueron: 3,5 ± 0,3 mg/kg para el veneno de B. alternatus, 3,1 ± 0,5 mg/kg para B. neuwiedii y 0,9 ± 0,2 mg/kg para B. jararacussu. El contenido de proteínas totales de los antivenenos obtenidos en el proceso de primo-inmunización (no consideramos el de reinmunización) fue de 12,3 ± 1,9 mg/ml para el antiveneno obtenido por fraccionamiento con ácido caprílico y de 14,1 ± 1,5 mg/ml para el antiveneno obtenido por precipitación salina y digestión enzimática.
El estudio electroforético de los antivenenos mostró sólo una banda en el orden de los 150 kDa en el antiveneno obtenido por ácido caprílico, lo que corresponde a la masa molecular de la IgG(T) y una banda en el orden de los 100 kDa en aquél obtenido por el método de Pope, correspondiendo a la masa molecular del fragmento F(ab´)₂ (Figura2). El estudio de especifcidad mostró sólo una banda cuando el veneno fue enfrentado con el suero anti IgG equina completa o el anti suero total equino, mostrando la pureza de los antivenenos obtenidos.

Figura 2. SDS-PAGE al 10% de acrilamida/bisacrilamida en condiciones no reductoras. Calle 1: Suero Total Equino (STE); Calle 2: IgG; Calle 3: fragmentos F(ab´)₂ . En cada calle se corrieron 22 µg de proteína. A la izquierda está indicada la migración de los marcadores de peso molecular (MPM).

Los resultados de los estudios de neutralización son mostrados en la Tabla 1 como mg de veneno o DL₅₀ neutralizadas por ml de antiveneno, de acuerdo a las diferentes formas de expresar la potencia neutralizante en diferentes países de América (Farmacopea Argentina 1978; Ministerio de Saúde 1996; Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 2000; United States Pharmacopeia 2004). El plasma obtenido en el proceso de reinmunización, brindó una capacidad neutralizante superior a 2,5 mg de veneno por ml de IgG purifcada para el veneno de B. alternatus y sobre los 2,0 mg/ml para el veneno de B. neuwiedii (sensu lato), en ambos casos por sobre los valores mínimos de neutralización requeridos por la Farmacopea (Farmacopea Argentina 1978).

Tabla 1. Capacidad neutralizante en los venenos usados como inmunógenos de ambos antivenenos.

V: veneno; AV: antiveneno. Los resultados son expresados como Dosis Efectiva Media (DE₅₀) en microlitros (µl AV) o miligramos (mg AV) de antiveneno de IgG entera o fragmentos de F(ab´)₂. La potencia teórica, expresada en miligramos de veneno por mililitros de antiveneno (mgV/mlAV), indica los miligramos de veneno neutralizado por un mililitro de antiveneno a partir de datos en crudo de potencias letales y neutralizantes. La potencia de neutralización, expresada como los miligramos de veneno por 10 mililitros de antiveneno (mgV/10 ml AV) (*), fue estimada por el método sugerido por el Ministerio de Salud de Brasil (Ministerio de Saúde 1996) (estimando la potencia del antiveneno considerando n-1 a las dosis de desafío, dado que, de las dosis de desafío excluida del cálculo es la que mata al 50% de los ratones en el desafío). La potencia expresada en DL₅₀ (DL₅₀/10 ml AV) indica la cantidad de Dosis Letal Media (en ratón) neutralizada por 10 mililitros de antiveneno (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 2000). Los intervalos de confanza (95%) están expresados entre paréntesis.

DISCUSIÓN

Ambos antivenenos obtenidos en el proceso de inmunización fueron efcientes en neutralizar los venenos de serpientes estudiados. Si consideramos el contenido de proteínas, los títulos neutralizantes obtenidos por ambos métodos fueron cercanos. Aunque se observaron algunas diferencias en la potencia neutralizante, no fueron estadísticamente signifcativas (P>0,05).
La cantidad de proteínas obtenida en ambos casos fue similar y en el estudio por SDS-PAGE los antivenenos se mostraron casi totalmente compuestos por IgG o fragmentos F(ab´)₂. En este punto, debe tenerse en cuenta que, en la misma cantidad de proteína, la presentación F(ab´)₂ tiene más sitios de unión al antígeno con respecto a la molécula de IgG entera, dado que estos fragmentos tienen 100 kDa y la IgG de caballo tiene alrededor de 150-160 kDa (Sugiura 2000). Esto podría sugerir una potencia mayor de una preparación con respecto a la otra con similar contenido proteico, si bien en este caso no se notaría esa diferencia. En estos procesos de purifcación, las diferencias podrían ser atribuidas a las diferentes condiciones en el tratamiento de los sueros para la purifcación de las inmunoglobulinas, que infuiría en sus capacidades de unión a los diferentes antígenos. El “sufrimiento” de las inmunoglobulinas purifcadas con la precipitación con ácido caprílico es menor comparado con la termocoagulación (50-60°C), doble precipitación salina y digestión enzimática a pH bajo (pH 2-3). Los títulos neutralizantes obtenidos en esta primera instancia no fueron muy altos, posiblemente debido al hecho de que los anticuerpos procesados provenían de animales vírgenes en una primoinmunización. Sin embargo, estas potencias (alrededor de 1,3 a 2,9 mg de veneno por mililitro o alrededor de 150 a 1200 DL₅₀ por ampolla de 10 ml) son buenas en este caso. Considerando que, durante los procesos de reinmunización los títulos neutralizantes suben, y que, con los procesos de concentración la potencia se eleva, los títulos alcanzados son adecuados para el proceso de producción de un antiveneno. Además, considerando la baja cantidad de proteínas (123 mg [IgG] o 141 mg [F(ab´)₂] por 10 ml), éstas podrían concentrarse varias veces con el consiguiente aumento de título, dado que la cantidad de proteínas de los antivenenos comercialmente oscila en general entre 700 y 1400 mg/ 10 ml (OMS 1981).
Respecto al título neutralizante alcanzado es importante destacar que, si se considerase la potencia encontrada, aún sin ningún proceso de concentración, llevando el volumen de un vial a 20 ml, volumen común para los antivenenos en la medicina veterinaria, se superarían los requerimientos de neutralización por vial (25 mg de veneno/vial) requeridos por la Farmacopea Nacional para los antivenenos para uso humano (Farmacopea Argentina 1978). La conveniencia del uso de las diferentes técnicas para la preparación de antivenenos es tema de constante discusión (Krif y col. 1999). Dado que los antivenenos están constituidos por proteínas heterólogas, deben tenerse en cuenta todas las consideraciones para evitar que el tratamiento de las mordeduras de serpientes con el antiveneno, complique o empeore el cuadro de envenenamiento por problemas de hipersensibilidad. Hasta el presente, el uso de fragmentos F(ab´)₂ parece ser la mejor presentación farmacéutica para uso humano debido a su baja incidencia en la producción de efectos adversos y su farmacocinética (Krif y col. 1999). El método de doble precipitación salina, termocoagulación y digestión enzimática (método de Pope) para obtener estos fragmentos, es ampliamente aceptado como una de las mejores elecciones para la preparación de antivenenos para uso humano. (Ministerio de Saúde 1996; Chippaux y Goyffon 1998; Krif y col. 1999). Una de las principales ventajas del método de Pope es la ausencia de regiones de cadena pesada de la inmunoglobulina. La digestión enzimática reduce el suministro de proteínas heterólogas al sistema inmune de las personas o animales tratados con estos fragmentos y, consecuentemente, la posibilidad de aparición de reacciones adversas por la falta de dominios relacionados al sistema de complemento o la activación de células blancas sanguíneas, los cuales se localizan en la parte digerida por la pepsina. (Morell 1986; Sullivan 1987; Le Moli y col. 1989; Chippaux y Goyffon 1998). Estos fragmentos son altamente conservados y la respuesta humoral contra éstos puede resultar en una reacción de Arthus en el subsecuente tratamiento con los antivenenos (de Roodt y col. 2004). Otra ventaja importante del método de precipitación salina es que facilita el trabajo a nivel industrial, dado que las inmunoglobulinas son obtenidas en una alta concentración y dependiendo del sistema de producción, pueden ser almacenadas en pequeños espacios como una “pasta” de proteína-sulfato por largos períodos de tiempo. En suma, el concentrado de inmunoglobulinas facilita la preparación de los antivenenos, dado que es más fácil y barato diluir proteínas que concentrarlas. Sin embargo, para obtener un producto de alta calidad, este proceso debe ser realizado por personal experimentado, se necesitan varios pasos y es caro a causa de la gran cantidad de sales que requiere, el uso de pepsina, la necesidad de agitación y cambios de pH, y la necesidad de sistemas de calor en algunos pasos del proceso de producción. Contrariamente, la purifcación por fraccionamiento con ácido caprílico requiere menor cantidad de pasos de purifcación y no necesita el uso de temperatura ni tratamiento enzimático. Los antivenenos producidos usando fraccionamiento por ácido caprílico han demostrado ser útiles experimentalmente (León y col. 1997; León y col. 1999) y clínicamente en humanos, en países con serios problemas de mordeduras de serpientes (Theakston y col. 2003). Además, estas preparaciones son seguras con respecto a la aparición de reacciones adversas inmediatas, dado que la activación del complemento sería solo levemente mayor que la observada usando fragmentos F(ab´)₂ (Morais y col. 1994; Rojas y col. 1994). Una interpretación respecto a las bondades de esta metodología de purifcación para el uso veterinario podría ser que, si la inyección de IgG equina altamente purifcada no parece plantear un gran problema para humanos, esta presentación no causaría problemas al ser usada en caballos (en este caso, la preparación es un antiveneno homólogo), vacas, perros, gatos u otros animales domésticos que pudieran ser mordidos por una serpiente. El consenso general es que la mejor presentación farmacéutica es la que involucra fragmentos F(ab´)₂ o Fab (de Roodt y col. 2004). Sin embargo, esta recomendación que ha sido hecha para productos para uso humano, está bajo constante discusión (Morais y col. 1994; Otero-Patiño y col. 1998; Krif y col. 1999; Gutierrez y col. 2003) y no es necesariamente aplicable a preparaciones que serán usadas en animales.
Independientemente de la ausencia de experimentación en reacciones adversas a los antivenenos en medicina veterinaria, los fenómenos de hipersensibilidad son diferentes en hombres y animales, y en las diferentes especies de animales domésticos (de Roodt y col. 1994; Driggers 1995; de Roodt y col. 1997) y son raramente encontrados luego del tratamiento con antivenenos (Leisewitz y col. 2004). Puede asumirse que estas preparaciones de inmunoglobulinas de alta calidad no presentarían mayor riesgo en animales que las preparaciones comunes (suero total, fracción gamma, inmunoglobulinas purifcadas, fragmentos F(ab´)₂ o Fab) usadas para tratar el envenenamiento en casi todo el mundo. El riesgo de reacciones adversas inmediatas debería ser bajo y el riesgo de una reacción de Arthus, 7 a 15 días luego de la inoculación, debería ser similar a aquel producido por el uso de cualquier otro tipo de antiveneno. En este aspecto, la experiencia con perros tratados con fragmentos F(ab´)₂ sugieren que, aunque estas reacciones pueden ocurrir, son raras (Leisewitz y col. 2004).
Sin embargo, a pesar de lo enunciado, los esfuerzos productivos deberían estar dirigidos a obtener el mejor antiveneno, aún para uso veterinario, dado que los animales merecen ser tratados con productos de calidad. De esta manera, todos los procesos de purifcación y/o tratamiento enzimático deberían ser considerados para productos veterinarios cuando los costos y la demanda los hagan viables. Con respecto a los costos de producción de antivenenos, si consideramos los principales reactivos para purifcar plasma hiperinmune (con sulfato de amonio, pepsina o ácido caprílico), el costo es alrededor de tres a ocho veces menor con ácido caprílico, dependiendo de algunos aspectos técnicos y de los precios de las drogas usadas (precios estimados a partir del catálogo Sigma, 2007). La diferencia es mayor, si consideramos la necesidad de reactores adecuados, sistemas de fltración y sistemas de calentamiento, necesarios para obtener los fragmentos de inmunoglobulinas por precipitación salina y digestión enzimática (Raw y col. 1991).
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que es posible producir antivenenos de calidad con una considerable reducción de los pasos de purifcación y de los costos de producción, lo cual nos lleva a asumir que la producción de antivenenos de bajo costo y buena calidad para uso veterinario es posible y debe ser alentada. El paso fundamental, y la clave de este tipo de producción, es obtener altos títulos de anticuerpos evitando la necesidad de labores de concentración para aumentar la potencia neutralizante, lo que encarecería el costo del producto. Afortunadamente, con varios venenos de serpientes es posible obtener altos títulos de anticuerpos, como en el caso del veneno de la mayoría de los vipéridos americanos.
La producción de antivenenos o antitoxinas para uso veterinario es un desafío para la industria farmacéutica veterinaria. Aunque, en ocasiones, estos productos pueden no rendir altos benefcios a los fabricantes por las razones antes mencionadas (especialmente en comparación con productos cosméticos, antibióticos o antiparasitarios) los antivenenos y antitoxinas pueden constituir una línea regular de producción que sería muy útil para los productores, veterinarios, dueños de animales y animales en países donde las mordeduras de serpientes en animales domésticos son frecuentes.

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