ARTÍCULOS ORIGINALES

Evaluación del riesgo ambiental de carbofurano en bioensayos con organismos no blanco

 

Iannacone, José Alberto^1,2*; Alvariño, Lorena²; Paredes, Christian²; Alayo, Marianella^2,3; Mamani, Nancy⁴; Bonifacio, Juan²; Mariano, Mauro³; Miglio, María Cristina⁴

¹Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma (URP). Av. Benavides 5440, Santiago de Surco, Lima, Perú.
²Laboratorio de Ecofisiología Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemática (FCCNM). Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV). Av. Río de Chepén s/n. Urb. Villa Hermosa. Bravo Chico, El Agustino, Lima, Perú.
³Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM).
⁴Facultad de Pesquería. Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM).

^*joseiannacone@gmail.com

Recibido: 10 de febrero de 2011
Aceptado: 25 de abril de 2011

 

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Resumen. El carbofurano es uno de los plaguicidas más empleado en la agricultura peruana. El objetivo de este trabajo fue evaluar el riesgo ambiental del carbofurano en bioensayos de toxicidad, sobre once especies no destinatarias. La siguiente secuencia relativa de mayor a menor cocientes de riesgo (CR) del carbofurano para los 19 puntos finales de efecto en once especies fue encontrada: Daphnia magna (mortalidad) > Lemna minor (inhibición de formación de las hojas) > Paracheirodon innesi (nado extraño) = P. innesi (incremento del movimiento opercular) > Chironomus calligraphus (mortalidad) > L. minor (necrosis) > P. innesi (mortalidad) > L. minor (clorosis) > Tetrapygus niger (inhibición de la fecundación) > Coturnix japonica (mortalidad) > Oncorhynchus mykiss (incremento de coloración) > Ceraeochrysa cincta (no eclosión de huevos) > O. mykiss (mortalidad con oxígeno) > O. mykiss (mortalidad sin oxígeno) > Trichogramma pretiosum (mortalidad) > C. cincta (mortalidad) > T. pretiosum (no emergencia de adultos) > Trichogramma pintoi (mortalidad) > Beauveria bassiana (inhibición del crecimiento). Los cocientes de riesgo (CR) indicaron en todos los casos un alto riesgo del carbofurano principalmente en el ambiente acuático en comparación con el terrestre.

Palabras clave: Daphnia; Lemna; Paracheirodon; Plaguicida.

Abstract: Carbofuran is one of the most employed pesticides in Peruvian agriculture. This research aimed to evaluate the risk assessment in bioassays of carbofuran on eleven non-target species. The following relative sequence in decreasing ecotoxicity order in terms of RQ (Risk quotient) to carbofuran to 19 end points on 11 species was found: Daphnia magna (mortality) > Lemna minor (inhibition of new fronds) > Paracheirodon innesi (strange swim) = P. innesi (increase of opercula movement) > Chironomus calligraphus (mortality) > L. minor (necrosis) > P. innesi (mortality) > L. minor (chlorosis) > Tetrapygus niger (inhibition of fertilization)> Coturnix japonica (mortality) > Oncorhynchus mykiss (increase of coloration) > Ceraeochrysa cincta (not hatch of eggs) > O. mykiss (mortality without oxygen) > O. mykiss (mortality with oxygen) > Trichogramma pretiosum (mortality) > C. cincta (mortality) > T. pretiosum (not emergence of adults) > Trichogramma pintoi (mortality) > Beauveria bassiana (inhibition of growth). Risk quotient (RQ) indicated that carbofuran is highly risky mainly to aquatic environment than terrestrial.

Key words: Daphnia; Lemna; Paracheirodon; Pesticide.

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INTRODUCCIÓN

Dentro de los principales factores que impactan la biodiversidad en todas sus escalas, se destaca la degradación ambiental por sustancias químicas tóxicas y, en particular, los insecticidas químicos sintéticos que pueden llegar a los ambientes acuáticos y terrestres están considerados entre los más deletéreos. El carbofurano es un carbamato sistémico con efecto insecticida, acaricida y nematicida por contacto e ingestión y bajo efecto residual (Mascolo y col. 2005; Tazza 2005; Gera y col. 2009). Debido a su amplio empleo, se le puede encontrar en el suelo, aguas superficiales, alimentos y fauna silvestre (Dobšiková 2003). En el agua, la toxicidad del carbofurano puede verse influenciada por las poblaciones microbianas presentes en los sedimentos. El carbofurano puede degradarse en aguas neutras y moderadamente alcalinas (Mascolo y col. 2005).
El carbofurano provoca efectos negativos en la biota (Sarkar y col. 2005). En el Perú, el carbofurano se encuentra junto con el metamidofos, clorpirifos y metomilo en el control de plagas agrícolas y es considerado altamente tóxico. Se comercializa bajo 13 nombres en relación a sus diferentes formulaciones y cinco procedencias. El carbofurano, paraquat, metomilo, y terbufos, se encuentran entre los biocidas que ocasionan mayores intoxicaciones en los seres humanos (Tazza 2005).
Por estas razones, es importante determinar el nivel de riesgo en el ambiente (dulceacuícola, marino y terrestre) del carbofurano usando bioensayos ecotoxicológicos. Con este objetivo en mira se escogieron 11 especies biológicas y 19 puntos finales de lectura, que incluyeron seis acuáticas y cinco terrestres para realizar ensayos toxicológicos. Las seis especies acuáticas fueron: 1) pulga de agua, Daphnia magna Strauss, 1820, organismo de referencia utilizado en pruebas de toxicidad debido a su alta sensibilidad, ya que presenta una amplia información para determinar la toxicidad de sustancias químicas puras y de muestras ambientales (Shaw y col. 2006); 2) lombriz roja, Chironomus calligraphus Goeldi, 1905, abundante y con permanente disponibilidad del material biológico en el Neotrópico, fácil de criar en condiciones de laboratorio, ciclo biológico corto y sensible a tóxicos (Schuler y col. 2006); 3) erizo negro marino, Tetrapygus niger Molina, 1782, del ambiente rocoso marino del Pacífico Sur (Urriago y col. 2011), en la que se han realizado estudios en bioquímica, fisiología reproductiva y en distribución geográfica (Miranda y col. 2007); 4) neón tetra, Paracheirodon innesi Rabout, 1940, buscada por los acuaristas amazónicos y evaluada ecotoxicológicamente (Iannacone y col. 2007a); 5) trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792, recurso íctico de la acuicultura continental en el Perú y muy sensible a contaminantes acuáticos (Orrego y col. 2005), y 6) lenteja de agua Lemna minor L., macrófita usada frecuentemente para remover sólidos suspendidos, nutrientes y metales pesados de cuerpos de agua contaminados (Iannacone y col. 2000; Brain y col. 2004).
Las cinco especies terrestres seleccionadas fueron: 1) hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., microorganismo promisorio y alternativo para el control biológico de insectos plagas del orden Lepidóptera y Coleóptera que afectan al hombre, a la salud animal y a la agricultura (Cova y col. 2009); 2) crisópido Ceraeochrysa cincta Schneider, 1851, distribuida desde Florida, Estados Unidos de América (EUA), hasta Argentina (Ramírez y col. 2007) y con potencial para la cría masiva y utilización en programas de control biológico (Tauber y de León 2001; Bortoli y col. 2005); 3 y 4) microavispas Trichogramma pretiosum Riley, 1879 y Trichogramma pintoi Voegelé, 1982, controladores biológicos de lepidópteros plaga (Basso y Pintureau 2004) y sensibles a varios insecticidas (Thuler y col. 2007); 5) codorniz Coturnix japonica Temminck y Schlegel, 1849, ave popular por su huevos, carne; por ser mascota y animal de laboratorio, usada por las Agencias Reguladoras Ambientales Internacionales (Environment Canada, United States Environmental Protection Agency (USEPA), Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD)). En esta ave también hay estudios de comportamiento, neurológicos, genéticos, nutricionales y reproductivos (Ottinger y col. 2005; Chełmońska y col. 2008).
Los estudios de evaluación de riesgos acuáticos y terrestres de plaguicidas empleando modelos biológicos, combinan la evaluación de la exposición y la sensibilidad, por lo que permiten predecir el posible efecto de estas sustancias químicas en la matriz ambiental, y tomar decisiones regulatorias con relación al registro, restricciones de uso y compatibilidad con otras estrategias de control de plagas (Solomon y col. 2008).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la ecotoxicidad del carbofurano sobre once organismos no blancos y a partir de estos resultados evaluar su posible riesgo ambiental de este insecticida sintético en el ambiente acuático y terrestre.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos
Carbofurano (2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran- 7il-metilcarbamato, PM= 221,3): se utilizó la formulación de pasta fluída (Furadán 4F®, Farmagro SA, USA). Para los bioensayos la sustancia química sintética se disolvió al 20% en agua destilada (pH= 7,3; conductividad específica= 75 μmhos/cm) y se aplicaron concentraciones de ingrediente activo (ia) utilizando usualmente factores de dilución fluctuantes entre 0,06 y 0,5 dependiendo de cada ensayo. Para las diluciones se empleó agua de grifo reposada (Iannacone y col. 2007b).

Diseño experimental
Para D. magna (mortalidad), L. minor (clorosis, necrosis y formación de hojas nuevas) y Ch. calligraphus (mortalidad): se usaron formulaciones de carbofurano a las siguientes cinco concentraciones: 0,003; 0,007; 0,0145; 0,029 y 0,048 mg/l. Para B. bassiana (inhibición del crecimiento) se emplearon nueve concentraciones: 0,006; 0,07; 0,82; 9,42; 108,52; 434,08; 1.736,32; 6.945,28; y 27.781,20 mg/l. Para C. cincta (mortalidad larvaria y eclosión de huevos) se usaron cinco concentraciones: 0,00002; 0,0002; 0,003; 0,03 y 0,48 mg/l. Para T. pretiosum (mortalidad) se emplearon cinco concentraciones: 0,006; 0,07; 0,82; 9,43 y 108,52 mg/l. Para los adultos de T. pretiosum (emergencia de adultos) se usaron cinco concentraciones: 0,0044; 0,055; 0,694; 8,68 y 108,52 mg/l, y para T. pintoi (emergencia de adultos) se emplearon cinco concentraciones: 0,58; 2,70; 12,42; 57,16 y 262,95 mg/l. Para O. mykiss (mortalidad e incremento de la coloración) se emplearon las siguientes cinco concentraciones en ausencia de oxígeno: 0,384; 0,96; 2,4; 6 y 15 mg/l, y con presencia de oxígeno: 11,9; 23,8; 47,5; 95 y 190 mg/l. Para P. innesi se usaron cinco concentraciones: 0,0362; 0,0725; 0,145; 0,290 y 0,480 mg/l. Cuatro concentraciones 0,47; 0,94; 1,88 y 3,75 en mg/kg se emplearon para C. japonica (mortalidad y manifestaciones en el comportamiento). Para T. niger (inhibición de la fertilización) se usaron cinco concentraciones: 0,003; 0,006; 0,012; 0,025 y 0,025 mg/l. Todos los bioensayos tuvieron un diseño en bloque completamente aleatorio (DBCA) de 5-9 (concentraciones) x 4 (repeticiones). Únicamente en el caso de C. japonica se usaron dos repeticiones. En todos los casos se emplearon concentraciones nominales del carbofurano.

Material biológico y criterios de puntos finales
Daphnia magna. Se siguió el procedimiento señalado por Castillo (2004). Hembras maduras y oviplenas se obtuvieron de un acuario procedente de Lima, Perú. Los cultivos parciales con las hembras partenogenéticas se mantuvieron a 22 ± 2°C y a un fotoperiodo de 12:12. El oxígeno disuelto se mantuvo sobre 8 mg/l. Para la prueba de toxicidad aguda se emplearon cohortes de neonatos (<24 h de nacidos). La duración de la prueba fue de 48 h de exposición. A cada envase circular de 250 ml se agregaron 100 ml de cada una de las concentraciones, a los cuales se transfirieron diez neonatos. Se usó como criterio de mortalidad la carencia de movilidad o la ausencia de ritmo cardiaco a 15 s de observación al microscopio estereoscopio.
Chironomus calligraphus. Para cada ensayo se colectaron masas de huevos de C. calligraphus procedentes de una laguna de estabilización de Villa El Salvador, Lima, Perú. La obtención, cría estandarizada y bioensayo de Chironomus siguió las recomendaciones de Iannacone y col. (2007b). Las pruebas se efectuaron con larvas de primer estadio con menos de 24 h de edad; se colocaron 10 especímenes en cada uno de los envases de vidrio de 35 ml, con un volumen final de 25 ml. La mortalidad se midió a las 24 y 48 h de exposición. Se consideraron muertas aquellas larvas que no efectuaron ningún movimiento al ser pinchadas con un alfiler entomológico, bajo observación con estereoscopio durante 15 s. Tetrapygus niger. Se siguió el protocolo indicado por Iannacone y col. (2007b). Los especímenes se colectaron de la playa Ancón, Lima, Perú. Para estimular en los erizos la evaluación del esperma y de los óvulos se les inyectó KCl 0,5 M. Se prepararon soluciones de 5 x 107 espermios/ml y 2.000 óvulos/ ml. El ensayo se realizó a una temperatura de 20 ± 2ºC. Para el bioensayo se emplearon tubos de centrífuga de 20 ml, a los que se agregaron 100 μl de la suspensión de espermios y después de 1 h, se le agregó 1 ml de la suspensión de óvulos. Se consideró como criterio de validez del bioensayo un 80% de fertilización en los controles después de 20 min. de agregar la suspensión de óvulos. Se agregó 0,5 ml de formalina a cada tubo para conservar el material para una lectura posterior. Para evaluar el porcentaje de fertilización se transfirió 1 ml de cada tubo de prueba a una cámara de Sedgwick-Rafter (Phycotech ®, Sedgwick-Rafter cell, Saint Joseph, Michigan, USA). Se contabilizó un total de 400 huevos, separándolos en huevos fertilizados y no fertilizados, diferenciándolos por la ausencia de la membrana de fertilización. Paracheirodon innesi. Adultos de "neón tetra" P. innesi, sin distinción de sexo, se obtuvieron de un acuario del distrito de Lince en Lima, Perú. Los peces se alimentaron semanalmente con alimento para peces en hojuelas (TetraMin, Tetramin Tropical Flakes, Buffalo, New York, USA), y con hojuelas de cereal (Cereal Leaves, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) a 26 ± 2ºC. Los neones tetra usados en los bioensayos se extrajeron del cultivo a partir de la primera semana de aclimatación (Iannacone y col. 2007a). Las lecturas definitivas de la pruebas ecotoxicológicas se realizaron a 96 h de exposición. Los peces no se alimentaron durante los bioensayos. Cada grupo de cinco neones se colocó al azar en recipientes plásticos circulares de 500 ml con las respectivas concentraciones. La prueba de toxicidad se repitió dos veces. Se utilizaron tres parámetros como punto final de lectura: uno letal: muerte (al tocar el pez con un estilete y si después de 10 s no realiza ningún movimiento), y dos subletales: inmovilización (al tocar el pez con un estilete y si después de 10 s sigue moviendo el opérculo), y nado extraño.
Oncorhynchus mykiss. Se emplearon las edificaciones del Laboratorio de Sanidad del Centro Piscícola, El Ingenio (11º52' LS, 75º15' LO, 3510 msnm), provincia de Concepción, departamento de Junín, Perú. Se usaron alevines de 18 ± 2 días después de la absorción del saco vitelino. Estos alevines se encontraron bajo condiciones de iniciación de alimento artificial. El protocolo de bioensayo siguió lo indicado por Iannacone y col. (2007b). El fotoperíodo fue 12:12. Los bioensayos de carácter agudo (mortalidad) y subletal (incremento de coloración) tuvieron una duración de 96 h, con un recambio de agua a las 48 h de exposición. Se realizó el ensayo con ausencia de oxígeno y otro con presencia de oxigenación. Este último fue repetido tres veces. Para cada prueba se necesitó un total de 240 alevines, de 2,4 a 3,8 cm de longitud (F= 0,67, P= 0,43) y en un número de 10 especímenes por unidad de experimentación.
Lemna minor. Se colectó de la laguna terciaria de 1 ha de la Planta de aguas residuales domésticas de San Juan de Miraflores, ubicada a 14 km al sur de la ciudad de Lima- Perú. Se crió masivamente durante dos semanas antes del inicio de la prueba, en un acuario de 60 cm largo x 30 cm de ancho x 30 cm de alto con sales nutritivas (Iannacone y col. 2000), a una profundidad del agua mayor de 80 mm y con un fluorescente de luz blanca de 4300 lux. La temperatura se mantuvo a 24 ± 2°C (Brain y col. 2004). Se evaluó en bioensayos estáticos un total de 12 especímenes/ envase. Los especímenes tuvieron dos hojitas de aproximadamente el mismo tamaño. Los envases fueron vasos de vidrio de 80 x 50 mm. Se agregaron 25 ml de la solución tóxica/envase disuelto en solución nutritiva. La duración de la prueba fue de 96 h. Las lecturas finales de los tres efectos subletales fueron: formación de hojitas nuevas, clorosis (50% de pérdida de pigmento) y necrosis (50% de tejido muerto).
Beauveria bassiana. La cepa empleada se aisló de un trips (Thrip tabaci Lindeman, 1889) procedente de Lima, Perú. Estas cepas se mantuvieron en el medio de cultivo sólido Agar Sabouraud Maltosa (ASM) más 0,1 de extracto de levadura y tetraciclina 50 mg/ml a 25ºC y a un fotoperiodo 12:12 durante 20 días para la producción de conidios (Vasquez y col. 2006). Los conidios obtenidos de tres placas por separado se colectaron empleando un portaobjeto de vidrio en una suspensión acuosa estéril con Tween 80 al 0,05% como diluyente para dispersar y mantener la uniformidad de los conidios y se contaron en una cámara de Neubauer. Se ajustó a una concentración de 3 x 108 conidios/ ml para los bioensayos y en placas de ASM se sembró el hongo por picadura profunda, 4 veces en cada placa y a 4 cm de separación entre picaduras. Se colocaron en cada una de ellas cuatro discos de papel filtro (Schleicher y Shuel®, 90 mm) de 0,5 cm de diámetro. Cada disco fue embebido por un tiempo de 1 s en las concentraciones del carbofurano y fue secado a una temperatura ambiente de 25ºC. Se determinó el crecimiento micelial (mm) a 7 días de exposición y fue determinado el porcentaje de inhibición del crecimiento fúngico (%) de cada una de las concentraciones en comparación con el control (Alizadeh y col. 2007).
Ceraeochrysa cincta. Se siguió para la crianza y el bioensayo lo descrito por Iannacone y Lamas (2002). Los huevos fueron obtenidos del Programa Nacional de Control Biológico- Servicio Nacional de Sanidad Agraria (PNCB-SENASA) del Perú. Se evaluaron huevos de menos de 48 h. Las larvas fueron criadas individualmente en envases de plástico de 12 ml de capacidad y alimentadas ad libitum con huevos de Sitotroga cerealella (Olivier 1819). Las larvas fueron criadas hasta el primer estadio de desarrollo y se emplearon cohortes de especímenes entre 24 a 48 h. Se realizaron ensayos de inmersión para los huevos y de contacto-residual para las larvas, para evaluar la eclosión de huevos y la mortalidad larvaria, respectivamente (Iannacone y Lamas 2002).
Trichogramma pretiosum y Trichogramma pintoi. Ambas microavispas fueron obtenidas de colonias mantenidas por el PNCB-SENASA y criadas en el laboratorio sobre huevos de S. cerealella a 23 ± 2 °C y 12:12 h de fotoperíodo. Por razones logísticas los ensayos de mortalidad de contacto residual se llevaron a cabo únicamente para los adultos de T. pretiosum. Los ensayos de emergencia de adultos se realizaron con ambas microavispas. Para los ensayos de mortalidad con T. pretiosum se usaron envases de plástico de 8 ml cubiertos con una tapa de algodón, a los que se les agregó 500 μl de cada una de las concentraciones acuosas con la ayuda de una pipeta automática con puntas descartables y luego con un hisopo se esparcieron homogéneamente sobre la superficie interna del vial de vidrio. Los experimentos se realizaron con cohortes de adultos < de 24 h de emergidos. Se consideraron muertos cuando no se posaban sobre el vial de vidrio y se encontraban con las patas dirigidas hacia arriba, durante 10 s de observación al microscopio estereoscopio. El porcentaje de emergencia de T. pretiosum y T. pintoi se calculó contando el número de microavispas emergidas en huevos adheridos a una cartulina de S. cerealella, dividiéndolo entre el número total de huevos parasitados.
Coturnix japonica. Se adquirieron especímenes machos adultos con un peso aproximado de 150 g cada uno en una tienda de aves localizada en el Centro de Lima, Perú. En el laboratorio se aclimataron por más de 30 días previos a la realización del bioensayo de toxicidad vía oral de 96 h de exposición. Grupos de cinco aves fueron dispuestas en cajas-jaulas de 40 cm x 40 cm x 24 cm. Las jaulas fueron hechas de cajones de frutas con una base de malla de metal. En la parte inferior de cada jaula se les colocó unas láminas de cartón forrado con bolsas de plástico de color negro para que allí se deposite materia fecal de las aves y la comida sobrante. Las aves fueron alimentadas con una dieta de 300 g a base de codornina® y maíz refinado remojado, la cual se distribuyó en dos porciones por día, mañana y tarde, durante todo el periodo de aclimatación. Todos los especímenes fueron pesados antes de iniciar el bioensayo. Los bioensayos de 96 h de exposición se realizaron con los ejemplares adultos de C. japonica a 18 ± 2ºC y aproximadamente 80% de humedad relativa. Un ml de cada una de estas concentraciones fue suministrado a las aves por vía oral. Siete manifestaciones de comportamiento fueron observadas a los 15 min de exposición: debilitamiento de las patas, convulsiones respiratorias, plumas erizadas, temblores, expulsión de heces, convulsiones musculares espasmódicas y descoordinación motora. Al final del ensayo las aves fueron diseccionadas para observar la presencia de hepatomegalia y la coloración del hígado.

Consideraciones éticas
Todos los procedimientos en animales siguieron los protocolos estándares de las 3Rs (reemplazar, reducir y refinar) aprobados para la experimentación animal, minimizando la angustia durante la experimentación, principalmente en peces y aves (Pardo 2005).

Análisis estadístico
La eficacia de los tratamientos y las repeticiones se evaluó a través de un análisis de varianza (ANDEVA) de dos vías con prueba a posteriori de Tukey. Los datos fueron previamente normalizados (transformación de los datos a raíz cuadrada del arcoseno). Las Concentraciones Letales (efectiva) (inhibición) media [CL(E)(I)s50] fueron determinados empleando el programa Probit versión 1,5. El modelo de regresión fue verificado con el estadístico Chi-cuadrado (÷2). Se usó el paquete estadístico SPSS, versión 17.0 para Windows XP para calcular los estadísticos descriptivos e inferenciales a un nivel de significancia de 0,05.

Evaluación del Riesgo Ambiental (ERA)
Se empleó el método de riesgo prospectivo de cálculo simple y de criterios conservadores del cociente de riesgo (CR) de tamizaje o evaluación inicial en ecotoxicología predictiva para determinar la naturaleza y magnitud del riesgo de carbofurano, usando los escenarios ambientales (acuático y terrestre) más críticos y de peor exposición. Con el fin de determinar la concentración efectiva ambiental (CEA) para los organismos acuáticos se asumió una profundidad del cuerpo de agua de 30 cm y para la CEA terrestre, a excepción de la codorniz se consideró un valor directo de aplicación, respectivamente. Para la determinación de la CEA para la codorniz se usó el nomograma de Fletcher, considerando el peso del ave (30% para las codornices) y una dieta de 15% de cultivos forrajeros, 70% de cereales y 15% de insectos foliares. Se siguió el protocolo indicado por González- Valero y col. (2000). Para los ensayos de toxicidad agudos y crónicos se usó un nivel crítico de comparación 0,5 y de 1, respectivamente.

RESULTADOS

Se determinó el efecto toxicológico agudo del carbofurano sobre los neonatos de D. magna a 24 y 48 h de exposición (Tabla 1). Se observó efecto toxicológico del carbofurano a 24 y 48 h, y un incremento significativo en el porcentaje de mortalidad de D. magna en comparación con el control entre las 5 concentraciones de 0,003 a 0,048 mg ia/l evaluadas (F=8,1-13,4; P < 0,05). La concentración letal media (CL50) a 48 h de exposición fue 0,002 mg ia/l. Se encontró un aumento en el porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo B. bassiana con las nueve concentraciones crecientes entre 0,006 a 27.781,2 mg ia/l a 7 días de exposición (F=46,02; P< 0,05) (Tabla 1). Se vio efecto del carbofurano en el porcentaje de inhibición del crecimiento de B. bassiana desde 108,52 mg ia/l. La CE50 a 7 d de exposición fue 1085 mg ia/l.

Tabla 1. Efecto del carbofurano en el porcentaje de mortalidad de Daphnia magna a 24 h y 48 h de exposición, en el porcentaje de inhibición del crecimiento de Beauveria bassiana a 7 días de exposición, en el porcentaje de mortalidad larvaria a 6 h de exposición y de no eclosión de huevos de Cereaochrysa cincta (Chrysopidae) a 120 h de exposición, en el porcentaje de inhibición de formación de nuevas hojas y en los porcentajes de formación de clorosis y de necrosis de Lemna minor de 24 a 96 h de exposición, en el porcentaje de mortalidad de adultos a 24 h y de emergencia de adultos a 120 h de Trichogramma pretiosum y Trichogramma pintoi (Trichogrammatidae) y en el porcentaje de mortalidad de larvas de Chironomus calligraphus a 24 a 48 h de exposición

 

Al evaluar el efecto de contacto del carbofurano sobre las larvas de C. cincta se encontró que a las 6 h de exposición, la CL50 fue 1,89 mg ia/l (F= 24,78; P< 0,05) (Tabla 1). El porcentaje de no eclosión de huevos de C. cincta a 120 h presentó un valor de mayor sensibilidad al carbofurano que el de mortalidad larvaria a 6 h de exposición (F =15,49; P < 0,05) (Tabla 1). A 96 h de exposición el porcentaje de inhibición de formación de nuevas hojas, el porcentaje de clorosis y de necrosis de L. minor presentaron valores de CE50 que incrementaron en términos de toxicidad: 0,003 ug ia/l; 0,022 ug ia/l y 0,015 ug ia/l (F=11,83-47,28; P < 0,05) (Tabla 1). En el caso de los adultos del microhimenóptero T. pretiosum, se vio a 24 h de exposición, que el carbofurano produjo una CL50 de 0,45 mg ia/l (Tabla 1). Los porcentajes de mortalidad del adulto de T. pretiosum mostraron para la concentración de 0,006 mg ia/l, efecto significativo diferentes al control (F=14,43; P< 0,05) (Tabla 1).
Los porcentajes de emergencia de los adultos de T. pretiosum y T. pintoi, mostraron para la concentración de 0,006 mg ia/l, efectos significativos en ambos parasitoides (F=19,17-36,74; P< 0,05) (Tabla 1).
La emergencia de adultos en términos de CE50 de T. pretiosum fue mayor al de T. pintoi en sensibilidad al carbofurano (Tabla 1). En el caso de la larva del díptero Ch. calligraphus, el carbofurano a las concentraciones entre 0,003 a 0,048 mg ia/l se vio que la CL₅₀ fue 0,010 ug ia/l a 48 h de exposición (F= 10,57-21,28; P< 0,05) (Tabla 1). Se encontró efecto del carbofurano en el porcentaje de mortalidad de O. mykiss desde 0,384 mg ia/l, en un bioensayo con o sin oxígeno, respectivamente. A las 96 h de exposición los alevines de O. mykiss presentaron una CL₅₀ < 0,44 mg ia/l en ausencia de oxígeno y de 0,36 mg ia/l en presencia del oxígeno (F=21,09-29,42; P<0,05) (Tabla 2). En el ensayo subletal de porcentaje de incremento de la coloración en O. mykiss a 9 6 h de exposición al carbofurano se observó un valor de CE50 de 0,29 mg ia/l (F=26,79-45,37; P<0,05) (Tabla 2). En la Tabla 2 se observó en el ensayo de toxicidad aguda oral en C. japonica efectos en el porcentaje de mortalidad diferentes al control desde la concentración de 0,94 mg ia/kg (F=44,81; P<0,05). A 96 h de exposición se observó que la CE50 de movimiento opercular de P. innesi fue 2,2 veces más sensible a la mortalidad (F=13,91-38,65; P<0,05) (Tabla 2). El porcentaje de nado extraño desde la concentración 0,0362 mg ia/l ocasionó un 100% de efecto en P. innesi (F=18,66-30,19; P< 0,05) (Tabla 2).

Tabla 2. Efecto del carbofurano en el porcentaje de mortalidad (letal) y en el porcentaje de incremento de la coloración (subletal) de alevines de Oncorhynchus mykiss entre 24 a 96 h de exposición; en el porcentaje de mortalidad (letal), en el porcentaje de movimiento opercular y de nado extraño (subletal) de Paracheirodon innesi entre 24 a 96 h de exposición; en el porcentaje de mortalidad de Coturnix japonica y en el porcentajes de inhibición de la fertilización de Tetrapygus niger (subletal)

El porcentaje de inhibición de la fertilización en el erizo T. niger fue diferente del control desde 0,003 mg ia/l (F=9,12; P<0,05). El valor de CI₅₀ fue de 0,208 mg ia/l (Tabla 2).
Se encontraron efectos en el comportamiento como debilidad en las patas, convulsiones respiratorias espasmódicas, plumas erizadas, temblores y expulsión de heces desde 0,47 mg ia/kg. Convulsiones musculares espasmódicas y descoordinación motora en C. japonica se observaron desde la concentración 0,94 mg ia/kg (Tabla 3). La hepatomegalia por acción del carbofurano en C. japonica se observó a la dosis de 3,75 mg ia/kg y parcialmente notoria desde 0,94 mg ia/kg. Un cambio en la coloración del hígado a roja con bordes negros fue vista a 0,47 mg carbofurano/ kg (Tabla 3).

Tabla 3. Efecto del carbofurano en el comportamiento y en las manifestaciones patológicas de Coturnix Japonica

Así, la secuencia relativa de mayor a menor cocientes de riesgo (CR) del carbofurano para los 19 puntos finales de efecto en las once especies fue: D. magna (mortalidad) > L. minor (inhibición de formación de las hojas) > P. innesi (nado extraño) = P. innesi (incremento del movimiento opercular) > Ch. calligraphus (mortalidad) > L. minor (necrosis) > P. innesi (mortalidad) > L. minor (clorosis) > T. niger > C. japonica > O. mykiss (incremento de coloración) > C. cincta (no eclosión de huevos) > O. mykiss (mortalidad con oxígeno) > O. mykiss (mortalidad sin oxígeno) > T. pretiosum (mortalidad) > C. cincta (mortalidad) > T. pretiosum (no emergencia de adultos) > T. pintoi (mortalidad) > B. bassiana (inhibición del crecimiento) (Tabla 4).

Tabla 4. Resumen de la evaluación de riesgo ambiental (ERA) del carbofurano con organismos no blanco

La ERA del carbofurano, indicó para nueve especies en el ambiente acuático y terrestre riesgo, debido a que el cociente de riesgo (CR) en base a los ensayos y al CAE para cada una de las especies fluctuó entre 0,96 y 1.440 para el carbofurano (Tabla 4). Las seis especies acuáticas mostraron en base al CR, riesgo al carbofurano. De las cinco especies terrestres, sólo una especie, C. japonica presentó riesgo en base al CR (Tabla 4). Las cuatro especies terrestres restantes que no mostraron riesgo al carbofurano en relación al CR fueron B. bassiana, T. pintoi y T. pretiosum (no emergencia de adultos) y C. cincta (mortalidad). La ERA del carbofurano en base a las especies terrestres mostró que los CR variaron entre 0,003 y 10,1. La ERA en base a los ensayos agudos indicó que los CR fluctuaron entre 0,019 y 1.440; y la ERA en relación a los ensayos crónicos presentó variación del CR entre 0,003 y 960 (Tabla 4). Quince (78,94%) efectos finales de lectura, de los 19 evaluados para las once especies acuáticas y terrestres, presentaron valores mayores a 0,5 y 1, para los ensayos agudos y crónicos, respectivamente, mostrando presencia de riesgo del carbofurano a nivel del ambiente acuático y terrestre.

DISCUSIÓN

La toxicidad del carbofurano es altamente dependiente de la duración, frecuencia, intensidad de exposición, formulación y la susceptibilidad del organismo evaluado, siendo este último influenciado por la edad, sexo, vigor y variación genética (Iannacone y Tejada 2007). La comparación de mayor a menor cociente de riesgo (CR) del carbofurano para los 19 puntos finales de efecto en las once especies ensayadas es adecuada desde una perspectiva ecotoxicológica, debido a que considera los escenarios característicos de exposición de cada especie biológica. Aunque las rutas de exposición para cada especie son diferentes y, por ende, los procesos metabólicos y bioquímicos también deben variar. Los cocientes de riesgo (CR) indicaron un alto riesgo del carbofurano en el ambiente acuático en comparación al terrestre. Esto podría explicarse por la alta toxicidad de este insecticida carbámico en artrópodos acuáticos y en peces (USEPA 2006), su alta solubilidad en agua (351 mg/l) a 25^ºC, su bajo coeficiente de adsorción (Koc) de 22 y a su relativa movilidad en el suelo. Al ser un producto insecticida presenta efectos por ingestión en artrópodos plagas, y por lo tanto en especies no blanco del mismo grupo biológico como D. magna y Ch. calligraphus.
D. magna fue la especie más sensible al carbofurano, lo cual podría deberse a que este agroquímico al incrementar la toxicidad anticolinesterásica inhibe la acción farmacológica de la carboxilesterasa (CaEs) que tiene un rol importante en la detoxificación de muchos plaguicidas (Laetz y col. 2009). Golombieski y col. (2008) señalan que los cladóceros como D. magna, fueron el grupo más sensible al efecto del agroquímico carbofurano, al provocar declinación en la densidad de estos microcrustáceos en cultivos de arroz. Los cladóceros fueron mucho más sensibles al carbofurano que rotíferos y copépodos. Herbrandson y col. (2003) muestran para D. magna, valores de CL₅₀ de 92 a 159 ug ia/l, más altos que los encontrados en el presente estudio de 2,38 ug ia/l. La diferencia encontrada podría deberse a que en nuestro trabajo empleamos una formulación de carbofurano comercial, en contraste a Herbrandson y col. (2003) que usó carbofurano grado técnico. La USEPA (2006) señala un valor similar al obtenido en nuestro estudio de 2,23 ug ia/l para la pulga de agua Ceriodaphnia dubia Richard, 1894. Esta especie de invertebrado acuático herbívoro tiene una posición central y de conexión en las cadenas de alimentación lénticas al servir de alimento a larvas y juveniles de peces dulceacuícolas (Golombieski y col. 2008).
La lectura final de inhibición en la formación de hojas en L. minor fue altamente sensible al carbofurano (3,85 ug ia/l), este efecto fitotóxico en esta macrofita no es concordante con lo indicado con la USEPA (2006), que señala que debido al mecanismo de acción del carbofurano de inhibición de la acetilcolinesterasa, no tiene efecto fitotóxico en plantas terrestres y acuáticas. De igual forma, Hartman y Martin (1985) no encontraron efectos fitotóxicos en L. minor y en Potamogeton pectinatus L. a concentraciones de carbofurano sobre 10 mg ia/l. El carbofurano empleado fue un formulado y por lo tanto el vehículo o inerte posiblemente contribuyó a la toxicidad del producto usado aunque no fue testeado.
El alto impacto del carbofurano a P. innesi evaluando el nado extraño fue concordante con lo observado por Saglio y col. (1996) en el pez Carassius auratus (Linnaeus, 1758), quienes encontraron efectos en la actividad de nado (refugio, mordisquear y nado en ráfaga), interacciones sociales y disminución a la atracción química a un extracto de alimento (quironomidos) por acción del carbofurano a las concentraciones de 1, 10 y 100 ug ia/l hasta las 12 h de exposición. El carbofurano es un plaguicida altamente tóxico para peces al presentar valores de CL₅₀ menores a 1 mg/l (Saglio y col. 1996; Dobšícová 2003). La USEPA (2006) señala un valor de toxicidad aguda de CL₅₀ de 88 y 280 ug ia/l para el carbofurano en el pez Lepomis macrochirus Rafinesque, 1819 y O. mykiss, respectivamente, siendo mucho más alto que el obtenido para los tres puntos finales de lectura en el neón tetra P. innesi.
La codorniz fue la única especie dentro de las terrestres, según el cociente de riesgo, que presentó riesgo al carbofurano. Bernados y Zaccagnini (2008) señalan un riesgo muy alto del carbofurano en aves de 0,4 mg/ kg para patos y 5 mg/kg para codornices, siendo las principales vías de ingreso la oral (por el alimento expuesto al tóxico) y el acicalamiento de las plumas en contacto con el tóxico. La USEPA (2006) señala para Dendrocygna bicolor (Vieillot, 1816) un valor de toxicidad oral aguda DL₅₀ de 0,238 mg/kg y considera al carbofurano altamente tóxico para las aves y entre los 15 productos plaguicidas más tóxicos para este grupo de vertebrados (Tenenbaum 2008). Existen registros de envenenamiento secundario de aves rapaces que se alimentan de aves herbívoras e insectos contaminados por carbofurano (USEPA 2006).
La especie menos sensible, de las once especies evaluadas frente al carbofurano, fue B. bassiana. Varios estudios han mostrado la tolerancia de este hongo entomopatógeno al uso combinado con plaguicidas carbámicos y organofosforados inhibidores de la acetilcolinesteresa, encontrando escaso efecto colateral en este hongo a varios insecticidas y la compatibilidad con el control químico (Alizadeh y col. 2007).
La guía de calidad de aguas Canadienses considera un valor máximo de contaminación por carbofurano de 0,0018 mg ia/l para la protección de la vida acuática de agua dulce. Dos de las especies acuáticas (18,18% de las ocho especies ensayadas) y dos puntos final de lectura (18,18% del total de puntos finales evaluados): D. magna (mortalidad) y L. minor (inhibición de formación de las hojas), presentaron valores de toxicidad cercanos al nivel máximo permitido de carbofurano en agua para la protección de la vida acuática. Este hallazgo nos muestra la importancia de re-analizar el valor máximo de carbofurano propuesto para la protección de la vida acuática del agua dulce. La ERA de un solo químico y de una sola aplicación podría subestimar el impacto en los ambientes acuáticos y terrestres, donde las mezclas de múltiples agroquímicos estresores y varias aplicaciones de plaguicidas han sido comúnmente registradas, produciendo cambios bioquímicos, fisiológicos y en el comportamiento de las especies (Golombieski y col. 2008). En general se acepta que la degradación ambiental de los ecosistemas por plaguicidas de uso cotidiano como el carbofurano es un factor causal de la declinación de especies en peligro o amenazadas. Esto permite conectar la ecotoxicología y la biología de la conservación con una meta en común (Laetz y col. 2009).
Los cocientes de riesgo (CR) indican en todos los casos un alto riesgo del carbofurano principalmente en el ambiente acuático en comparación con el terrestre.

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigación de la Universidad Ricardo Palma (URP) por la subvención de la presente investigación.

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