RESÚMENES DE TESIS

Producción de un fragmento de anticuerpo recombinante quimérico anti esfingomielinasa D contra la mordedura de la araña Loxosceles

Moctezuma González, Claudia L.

Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 1001, colonia Chamilpa. Cuernavaca, Morelos.

klaudya_moktezuma@yahoo.com.mx

De las más de 40.000 especies de arañas descritas, se consideran cuatro géneros de importancia médica por las manifestaciones clínicas y letalidad de sus venenos: Latrodectus, Loxosceles, Phoneutria, y Atrax. Las arañas del género Loxosceles, conocidas como violinistas, son cosmopolitas, de las cuales aproximadamente el 85% de las especies se encuentran en el continente americano.
El veneno de Loxosceles está constituido por diversos componentes, sin embargo, se ha comprobado que la esfingomielinasa D (SMD) es la responsable de la actividad tóxica del veneno. Como parte de la estrategia en la investigación de esta proteína, se generaron diversos anticuerpos monoclonales (AcM) específicos para la SMD de distintas especies. Uno de ellos fue capaz de reconocer e inhibir in vitro, la actividad de la toxina recombinante de L. reclusa (Oklahoma) y de L. boneti (México). Esta característica única del AcM, llevó a la propuesta para la generación de un fragmento de anticuerpo (Fab) recombinante quimérico derivado de este AcM, para que posteriormente pudiera ser evaluado como una herramienta terapéutica.
La estrategia para la generación del Fab quimérico consistió en amplificar por PCR las regiones variables del AcM a partir de RNA total, obtenido del hibridoma correspondiente. Los primers antisentido de cada cadena se diseñaron en función de las secuencias reportadas de IgG1 de ratón con cadenas ligeras tipo kappa. Para los primers sentido fue necesario obtener la secuencia del amino terminal y en función de ella se diseñaron primers degenerados. El primer aminoácido del extremo amino de la cadena pesada se encontraba bloqueado lo cual impidió su secuenciación. Por lo tanto se recurrió a la técnica de amplificación rápida de los extremos de cDNA (kit RACE de Gibco BRL Cat. 18374-058) y en función de esta se diseñó el primer correspondiente.
Los fragmentos variables fueron subclonados en el vector de expresión, pSyn modificado (FEBS Journal Volume 272, Issue 10, pages 2591-2601,), el cual contiene los segmentos de las regiones constantes de un Fab humano. Este plásmido genera un RNA mensajero bicistrónico (cadena pesada y ligera) e incorpora 6 histidinas en el carboxilo terminal de cada cadena, las cuales son enviadas al espacio periplásmico. Se utilizó la cepa TG1 y el medio de cultivo YT2X (ampicilina 100 g/ml y 0,1 % de glucosa). Las condiciones de crecimiento para el cultivo fueron a 30°C con agitación constante durante 12 horas después de la inducción con 1 mM de IPTG. Las células fueron colectadas e incubadas durante 20 minutos a 4°C en PPB (200 mg/l sacarosa, 1 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl). Después de centrifugar, se recuperó y el precipitado se resuspendió en 5 mM de MgSO4. Nuevamente se incubó durante 20 minutos a 4°C, se centrifugó y recuperó el sobrenadante. Finalmente, los sobrenadantes se centrifugaron y mezclaron. La proteína se purificó utilizando una columna de afinidad (Ni-NTA- Sepharose, Qiagen). La elución se realizó con 250 mM de imidazol en buffer de fosfatos (PBS). La proteína fue dializada contra PBS y analizada por gel de SDSPAGE. El rendimiento de producción del Fab recombinante fue de 62,5 μg/l.
Para la generación del Fab murino fue necesario inocular intraperitonialmente ratones Balb/C con células del hibridoma productor y purificar los anticuerpos por cromatografía afinidad (Sepharose® 4B acoplada a Proteína A, Zymed, Cat. 101042). El AcM fue dializado contra PBS y analizado por SDS-PAGE. La digestión se realizó con papaína. La enzima en (1 mM EDTA, 50 mM buffer fosfatos, 10 mM cisteína) a 0.65 mg/ml se incubando durante 10 min a 37°C. Posteriormente se incubó un volumen de AcM en (1 mM EDTA + 50 mM buffer de fosfatos + 10 mM cisteína) a 1 mg/ ml y 1 volumen de papaína durante 2 horas a 37°C. La reacción se detuvo adicionando la cantidad necesaria de E64 (ROCHE) para quedar a una concentración final de 40 μM. La purificación se realizó mediante un sistema de FPLC de intercambio iónico con dos columnas acopladas en tándem (Hi-Trap Q FF y Hi Trap SP FF Amersham Pharmacia Biotech). Las columnas se equilibraron con 25 mM Tris- HCl pH 8,0 y elución se realizó con 25 mM Tris-HCl pH 8 + 2 M NaCl. El Fab murino fue dializado contra PBS.
Para ambos fragmentos de Fab, quimérico y murino, se evaluó la capacidad de reconocimiento por ELISA y la capacidad de neutralización in vitro e in vivo. Para los ensayos de neutralización in vitro se usó el Kit AmplexTM Red, Molecular Probes, el cual después de una cascada de cuatro reacciones produce una molécula colorida (resorufina) en presencia de actividad de SMD. Los ensayos in vivo se realizaron en ratones Balb-C, inoculando una mezcla de 3 dosis letales medias de la toxina con distintas cantidades de Fab (murino o quimérico).
Los valores de EC50 del análisis por ELISA son de 2.2 (95% de intervalo de confianza de 2 a 2.5) tanto para el Fab murino como para el Fab quimérico, lo cual indica que ambos fragmentos reconocen en la misma proporción a la SMD de L. reclusa.
El ensayo de inhibición in vitro con la SMD de L. reclusa indicó un valor de EC50 de 0.031 para el AcM (95% de intervalo de confianza de 0.02824 a 0.03439) y de 0.032 para el Fab murino (95% de intervalo de confianza de 0.02370 a 0.04181). Al traducir estos valores a relaciones molares toxina:inhibidor, se encontró una relación de 1:0.5 para el AcM y 1:1.4 para el Fab. Considerando que el AcM es una molécula con el doble de avidez, la capacidad de inhibición del Fab no es significativamente distinta.
De los ensayos in vivo se encontró que el valor EC50 es de 84 μg/ratón (95% de intervalo de confianza de 80 a 88) para el AcM y de 23 μg/ ratón (95% de intervalo de confianza de 22 a 25) para el Fab murino.
El Fab quimérico no fue capaz de inhibir la actividad de la toxina. La molécula Fab es un fragmento de anticuerpo que conservó una estabilidad y capacidad inhibitoria proporcional a la del anticuerpo completo. Sin embargo, la proteína quimérica perdió su capacidad neutralizante, muy probablemente el plegamiento del fragmento se ve afectado por el ambiente de la bacteria y/o por el cambio en la secuencia de las regiones constantes. El AcM presenta características únicas y su correspondiente fragmento Fab las conserva por lo que pueden evaluarse otros sistemas de expresión que además mejore los rendimientos de producción y permitan evaluar al anticuerpo quimérico.

Este trabajo contó con el apoyo económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) de México y del Instituto Bioclon S.A de C.V, México.
Tesis para obtener el grado de Maestría en Ciencias por el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México
Tutor: Dr. Alejandro Alagón Cano
Co-Tutor: M. en C. Alejandro Olvera Rodríguez