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Acta toxicológica argentina

versión On-line ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. vol.19 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jul./dic. 2011

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Bromadiolona: un caso judicial relacionado con la muerte de abejas

Bromadiolone: a judicial case related to bees death

 

Salinas, Guillermo Pablo

Gabinete Científico Mar del Plata. Policía Federal Argentina. Sarmiento 2564, 7600, Mar del Plata. Tel-Fax: (54-223) 451-2571 labmdppfa@gmail.com

Recibido: 30 de mayo de 2011
Aceptado: 14 de diciembre de 2011

 


Resumen.

Como resultado de una investigación impulsada por la justicia, se analizaron muestras provenientes de un posible derrame intencional de plaguicidas sobre colmenas con abejas. En los análisis realizados se utilizó GC-MS previa extracción con solventes orgánicos. Debido a dificultades iniciales en la identificación de plaguicidas sobre tres de las muestras, se procedió al reprocesamiento de los cromatogramas utilizando selección de las relaciones de masas m/z 158, 173 y 143. Utilizando es herramienta analítica se obtuvieron los correspondientes cromatogramas, y los espectros de masas con coincidencia frente al divulgado para el producto de descomposición de bromadiolona (PDB), determinando que tanto las abejas como las colmenas habían tenido contacto con bromadiolona (3-[3-(4'-bromobifenil-4-il)- 3-hidroxi-1-fenilpropil]-4- hidroxicumarina), un anticoagulante cumarínico de utilización agraria para combatir roedores, que parece ser prácticamente no tóxico para las abejas según informes internacionales. Se observó que en la literatura no se halla propuesta una estructura química definida para el PDB, lo cual podría constituir el fundamento para encarar trabajos futuros con el fin de elucidar el comportamiento de la droga madre en el contexto del caso.

Palabras clave: Bromadiolona; CG-MS; Plaguicidas; Abejas.

Abstract.

As a result of an investigation boosted by ordinary justice, samples from a probable deliberate spill of pesticide over bees and hives were analyzed. Solvent extractions and then GC-MS were used to perform the tests. Due to difficulties since the beginning in pesticide identification upon three samples, chromatograms were reprocessed using mass selection at m/z 158, 173 y 143 mass rates. The correspondent chromatograms were gathered by these analytical tool, and their mass spectrums were found coincident with the previously reported as bromadiolone decomposition product (BDP), showing that hives as well as bees had been in contact with bromadiolone (3-[3-(4'-bromobiphenyl-4-yl)- 3-hydroxy-1-phenylpropyl]-4- hydroxycoumarin) - a coumarin rodenticide (anticoagulant) for agricultural use - which seems to be, according to international reports, practically non toxic for bees. It was observed that in the literature has not been proposed a defined chemical structure for BDP, so this could be a challenge for a future research in order to clarify its behavior in a similar situation.

Key words: Bromadiolone; GC-MS; Pesticide; Bees.


 

INTRODUCCIÓN

El presente es un reporte acerca de una investigación iniciada por una denuncia realizada en la justicia, a raíz de que un apicultor resultara perjudicado por un vuelco intencional de alguna sustancia química sobre sus colmenas a modo de sabotaje, resultando en la muerte de la totalidad de las abejas en todas las colmenas que poseía. En la denuncia propiciada por el damnificado figuran informes policiales de testigos que aseguran haber visto personas volcando alguna clase de líquido sobre las colmenas. En la misma se señala al propietario del campo vecino, como sospechoso, debido a antiguas disputas. Luego de la orden judicial respectiva, las muestras fueron tomadas por una patrulla policial rural el 5 de marzo de 2009, y por motivos administrativos arribaron al laboratorio el 20 de setiembre de 2010; es decir que entre la toma de muestras y sus análisis transcurrieron cerca de 19 meses. Se desconoce la forma de conservación. Se habían tomado muestras de las colmenas y de productos químicos hallados en un depósito del campo vecino.
El objetivo de la investigación fue establecer un vínculo cualitativo entre posibles sustancias que se puedan hallar en las abejas o colmenas con elementos secuestrados en el galpón rural perteneciente al campo del vecino sospechoso, como parte de la evidencia judicial para relacionar la muerte de las mismas a un acto deliberado por parte del imputado.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos
Acetona p.a. (Merck, Darmstadt, Germany), cloroformo p.a. Rosin (Sintorgan, Buenos Aires, Argentina), 2-propanol p.a. (Sintorgan, Buenos Aires, Argentina), sulfato de sodio anhidro p.a. (Biopack, Argentina), n-hexano p.a. (Merck, Darmstadt, Germany).

Muestras
Las muestras provenientes del campo afectado consistieron en una abeja entera sobre la que se observó ligera tinción fucsia (muestra 1) y una sustancia (muestra 2) colectada de las colmenas con un hisopo. Las muestras correspondientes al campo vecino consistieron en distintos líquidos contenidos en cinco botellas, algunas de ellas rotuladas y otras no, las que se describen a continuación: Un líquido amarillento (muestra 3) contenido en una botella de vidrio transparente sellada con tapa a rosca. Un líquido verde (muestra 4) contenido en una botella de vidrio transparente, sellada, con tapa a rosca. Una botella de vidrio sin contenido aparente de color caramelo con tapa a rosca y etiqueta en la que se leyó "NOCTOLIN Insecticida, Repelente, Cipermetrina", sobre la que se efectuó un lavado con 3 ml de acetona y se retuvo el líquido resultante como muestra 5. Un líquido amarillento (muestra 6) contenido en una botella de plástico blanco, con tapa a rosca, con etiqueta en la que se leyó "KARATE Lamdacialotrina". Un líquido de color rojo fucsia (muestra 7) contenido en una botella de plástico color caramelo con tapa a rosca con etiqueta en la que se leyó "GLEX RAT, Raticida, Rodenticida, Bromadiolona". Para el análisis, se tomó un volumen de 1 ml de cada líquido.
Como referencia de técnica analítica se utilizó el protocolo de trabajo propuesto por Sato (2005) y técnicas extractivas provistas por Esteve- Turrillas (2007a, 2007b).
Debido a la escasez en la cantidad de evidencia secuestrada respecto de las muestras 1 y 2, sólo se realizó cuidadosamente una extracción con acetona para cada muestra.

Procedimiento
Las muestras y un blanco de muestras se procesaron según la metodología sugerida por Sato (2005), mediante la extracción con 5 ml de una mezcla de cloroformo/2-propanol (9:1, v/v), y luego asistida por microondas durante 30 seg a 800 W. Las mismas se centrifugaron 10 min a 1000 g. El extracto orgánico resultante fue separado y tratado posteriormente con sulfato de sodio anhidro, se centrifugó y se separó la porción orgánica. La capa orgánica resultante se transfirió cuidadosamente a viales de vidrio, donde fue evaporada hasta ser llevada a sequedad bajo presión reducida. El residuo de cada muestra se reconstituyó en 200 μl de n-hexano, y ese volumen de cada muestra se transfirió a viales de vidrio color caramelo que se cerraron con precinto de aluminio y septo de goma.
El análisis de los extractos correspondiente a las siete muestras se realizó mediante la utilización de cromatografía gaseosa acoplada a detector de masas, utilizando la metodología sugerida por Sato (2005), trabajando en las siguientes condiciones: equipo utilizado: cromatógrafo gaseoso Perkin Elmer Clarus 600 T con inyector automático y detector de masas por ionización por impacto de electrones mediante filamento de renio (Perkin Elmer Instruments, Shelton, EEUU). Columna: capilar de 30 m, diámetro interno 0,25 μm, fase estacionaria 0,25 μm compuesta por metilpolisiloxano-( 5% fenil) (Perkin Elmer Instruments Elite- 5MS, Shelton, EEUU). Programa de temperatura de horno: inicial a 50 °C durante 2 min, luego incremento hasta 330 °C a una tasa de 20 °C/min, manteniendo la temperatura final por 3 min. Tiempo total de programa: 19,00 min. Tipo de inyección: Splitless. Volumen de inyección: 2 μl (jeringa N610-1390 5 μl - Perkin Elmer Instruments, Australia). Temperatura de inyección: 250 °C. Temperatura de fuente de iones: 150 °C. Temperatura de interfase GCMS: 330 °C. Energía electrónica: 70 meV. Gas carrier: helio 5.0 99,999 % (Linde AG Group, Gases Division, Pullach, Germany). Flujo 50 ml/min. Detector: Scan entre 0 y 19 min, con tiempo de scan 0,4 seg, e inter-scan delay 0,05 seg. SIR scan entre 8,50 y 10,50 min, para relaciones m/z de 158, 173 y 143, con intervalos de 0,02 seg.
Criterio para el análisis de resultados: el objetivo de la investigación ordenada por la justicia fue el de demostrar el hallazgo de sustancias en común entre las muestras provistas. Esto es, hallar sustancias que se comporten de manera similar en los ensayos de laboratorio entre las muestras provistas, sirviendo como conexión o nexo entre una o más sustancias contenidas en las botellas y sustancias xenobióticas halladas en abejas. Por ese motivo no se contó con testigos indubitables de las sustancias analizadas, como así tampoco fue el objetivo judicial determinar cantidades del o los xenobióticos en las muestras. Como punto de corte para el hallazgo de sustancias, a partir del cual considerarlo como un hallazgo positivo, se utilizó el concepto comúnmente aplicado donde señal atribuida a un analito es aquella en que la relación señal-ruido es igual o mayor a 2 (McNair y Miller, 2009).

RESULTADOS

Inicialmente, se realizó el análisis de los extractos obtenidos mediante GC-MS en las condiciones descriptas y por triplicado obteniendo cromatogramas en modo TIC (Cromatograma de Iones Totales). Se identificó clorpirifos, cipermetrina, dietanolamina, n-dodecildimetilamina, 2,4-D y 1-N-(2-fluorofenil)-3-(4-morfolinil) propanamida en las muestras 3 a 6 (Tabla 1). Para la pesquisa se reprocesaron los mismos cromatogramas ya obtenidos en su forma TIC, y se realizó la selección de masas m/z 158, 173 o 143 para las siete muestras y el blanco debido a que esos iones resultaron ser mayoritarios según lo publicado para el producto de degradación de bromadiolona (Sato 2005). Los resultados correspondientes a los cromatogramas TIC y por selección de masa específica sólo para m/z 158 se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Listado de sustancias halladas en las muestras analizadas y sus respectivos tiempos de retención en modo TIC y por selección de masa específica m/z 158. Selecciones de m/z 173 y 143 rindieron resultados similares para PDB (no mostrado).

 

En la Figura 1, se reproducen los cromatogramas para una selección de masas de 158. Se observaron picos con tiempos de retención compatibles con bromadiolona. Los mismos se analizaron posteriormente a través de sus espectros de masas para confirmar o descartar la compatibilidad con bromadiolona.


Figura 1. Cromatogramas para una selección de masas de 158.
Referencias: 0204 1-3: muestra 1 (abeja); 0204 2-4: muestra 2 (hisopo);
0204 7-4: muestra 7 (líquido conteniendo supuestamente bromadiolona).

En la Figura 2, se reproducen los espectros de masas obtenidos en las muestras 1, 2 y 7, los mismos corresponden a los picos observados con tiempo de retención (TR) entre 10,56 y 10,69 min, los que concordaron con el espectro de masas propuesto por Sato (2005) para el producto de descomposición de bromadiolona (PDB).


Figura 2. Espectros de masas obtenidos en las muestras 1, 2 y 7, que corresponden a los picos observados (en la figura 1) con TR entre 10,56 y 10,69 min para PDB.
Referencias: m/z: relación de masas obtenidas; %: porcentaje en intensidad de relación masas detectadas respecto de la masa mayoritaria (158). 0204 1-3: muestra 1 (abeja); 0204 2-4: muestra 2 (hisopo); 0204 7-4: muestra 7 (líquido conteniendo supuestamente bromadiolona), entre paréntesis se indica el TR correspondiente.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Según la Organización Mundial de la Salud (WHO 1996) y la Universidad Florida (Fishel 2010) la bromadiolona es un producto anticoagulante de la familia de las cumarinas muy tóxico para todos los mamíferos, nocivo por ingestión, que inhibe el metabolismo de la vitamina K y causa disminución de los factores de coagulación dependientes, provocando la reducción de la tasa de protrombina.
La Lista Internacional de Plaguicidas Altamente Peligrosos (Neumeister y Weber 2009), menciona, entre otras sustancias, a la bromadiolona como altamente tóxica; además de indicar ser persistente y bioacumulativa. El documento de la Oficina de Información de Pesticidas de la Universidad de Florida PI-76 (Fishel 2010) cita a la bromadiolona como relativamente no tóxica.
Previo al procesamiento de las muestras se observó que tanto la abeja (muestra 1) como el hisopo (muestra 2) presentaron una coloración rojiza no muy intensa (fucsia claro). De las cinco botellas con líquidos sólo la que correspondía a la muestra 7 poseía color rojo intenso (fucsia). Debido a esta observación se pensó en que, si bien la sustancia responsable de la muerte de las abejas podría ser cualquiera presente en la evidencia (muestras 3 a 6) o simplemente una sustancia tóxica cuya evidencia no hubiera sido secuestrada, era muy factible que hubiera una relación entre las muestras 1 y 2 con la muestra 7. Según el rótulo observado sobre la botella correspondiente a la muestra 7, el líquido de color fucsia debería contener bromadiolona, y a causa de los resultados negativos en la detección de otras sustancias tóxicas sobre la muestra 7 y en las muestras 1 y 2, y a la particularidad de la mencionada coloración, se puso especial interés en tratar de determinar o descartar la presencia de bromadiolona. Además surgió de la causa, según documentos aportados por la justicia, que testigos oculares habían visto personas realizando maniobras de vuelco de alguna clase de líquido sobre las colmenas. Este hecho sugirió la posibilidad de que las abejas hayan tenido contacto directo con alguna sustancia volcada sobre ellas.
La bromadiolona es difícil de detectar mediante GC-MS luego de cualquier tipo de derivatización practicada sobre la molécula con el fin de mejorar su detección. A pesar de la dificultad de detección por derivatización o en forma directa, la bromadiolona fue analizada mediante la localización de su producto de descomposición, el cual se informó detectable a través de un espectro de masas con picos de relación m/z de 158 (mayoritario), 173 y 143 (Sato 2005).
En los cromatogramas TIC de las muestras 1, 2 y 7, los picos resultantes correspondientes a PDB se mostraron en niveles confundibles con ruidos de base. Por tal motivo se procedió al reprocesamiento de los datos mediante selección de m/z 158, 173 y 143 alternativamente, mostrando picos cromatográficos claramente diferenciables de ruidos de base (Figura 1). El retraso en algo más de 1 minuto en el tiempo de retención respecto del trabajo publicado por Sato (2005) podría deberse a diferencias en la columna utilizada, sin embargo, los tiempos de retención en las tres muestras implicadas fueron similares (Figura 1). De todos modos, los espectros observados de las muestras 1, 2 y 7 (Figura 2) y el publicado como identificatorio de bromadiolona (Sato 2005) resultaron similares entre sí.
El espectro de masas obtenido en todos los casos, según biblioteca de espectros NIST, correspondió con mayor probabilidad a 1,2-dihidro- 2,2,4-trimetil-quinolina (también conocido como Flectol H), cuya estructura molecular contiene un nitrógeno en lugar del esperado oxígeno resultante del clivaje de la molécula de bromadiolona. En el trabajo de Sato (2005) no se propuso una estructura química definida para el PDB, lo cual podría constituir el fundamento para encarar trabajos futuros con el fin de elucidar el comportamiento de la droga madre en el contexto del caso.
Finalmente, y a pesar de la escasez del tamaño de la muestra, el tiempo transcurrido entre la toma de muestras y su análisis, y de las dificultades iniciales en su hallazgo, se pudo establecer que las abejas tuvieron contacto con bromadiolona, aportando la evidencia química solicitada por la justicia. Sin embargo, el hallazgo del plaguicida sobre la abeja o colmena no sería suficiente para relacionar la muerte de esos insectos directamente a los elementos secuestrados en el campo vecino, siendo necesario en ese caso muestreos en otras propiedades aledañas y/o información adicional que complemente los hallazgos vertidos en este reporte.

AGRADECIMIENTOS

Dedico un especial agradecimiento a la Lic. Sandra Karina Medici, la que me brindó toda su experiencia y asesoramiento. Además reconocer la invalorable ayuda en la corrección del manuscrito a la Dra. Marta N. Vacchino, Dra. Mónica Viviana Barg y el Dr. Guillermo Humberto Sturlini.

BIBLIOGRAFIA CITADA

1. Esteve-Turrillas F.A. Preparación de Muestras para el Análisis de Plaguicidas Mediante Microondas y Fluidos Presurizados. Universitat de Valencia. Servei de Publicacions; 2007a. p. 37-43.         [ Links ]

2. Esteve-Turrillas F.A. Preparación de Muestras para el Análisis de Plaguicidas Mediante Microondas y Fluidos Presurizados. Universitat de Valencia. Servei de Publicacions; 2007b. p. 88-89.         [ Links ]

3. Fishel F.M. Pesticide Toxicity Profile: Coumarin and Indandione Rodenticides. University of Florida, IFAS Extension. Gainesville. PI-76, 2010.         [ Links ]

4. McNair H.M., Miller J.M. Detectors. En: Basic Gas Chromatography. 2nd. ed. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc; 2009. p. 109.         [ Links ]

5. Neumeister L., Weber C. PAN International list of Highly Hazardous Pesticides. Carina Weber Editor, PAN Germany for Pesticide Action Network International, 1/2009. Hamburg, January 16th; 2009. p. 12-13. [consulta 29 de mayo de 2011]; Disponible en: http://www.rapaluruguay.org/agrotoxicos/Prensa/PAN_HHPList_ 090116.pdf.         [ Links ]

6. National Institute of Standards and Technology (NIST). Mass Spectral Libraries software V2.1. Perkin Elmer Inc.; 2006.         [ Links ]

7. Sato S. Coumarin Rodenticides. En: Suzuki O., Watanabe K. Drugs and Poisons in Humans: A Handbook of Practical Analysis. Berlin. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2005. p. 599-608.         [ Links ]

8. WHO/PCS/DS/96.88. WHO/FAO Data Sheet on Pesticides No. 88; July 1996. [consulta 29 de mayo de 2011]; 2.0 Toxicology And risks. Disponible en: http://www.inchem.org/documents/pds/pds/pest88_e.htm.         [ Links ]