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Estrés oxidativo en cefalópodos: I. Determinación de TBARS

Oxidative stress in cephalopods: I. TBARS determination

 

Fassiano, Anabella Victoria¹*; Ortiz, Nicolás^2,3; Ríos de Molina, María del Carmen^1,3

¹Laboratorio de Enzimología, Estrés y Metabolismo, Departamento de Química Biológica, FCEN-UBA, Ciudad Universitaria pabellón II 4to. piso., Int. Güiraldes 2620 CP1428, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
²Área de Biología y Manejo de Recursos Acuáticos, Centro Nacional Patagónico (CONICET), Bvd. Brown 2915, CP9120, Puerto Madryn, Argentina.
³CONICET, Av. Rivadavia 1917, CP1033, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

*afassiano@qb.fcen.uba.ar

Recibido: 17 de mayo de 2012
Aceptado: 2 de septiembre de 2012

 

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Resumen. El estrés oxidativo se produce cuando se genera un desbalance desfavorable entre las especies reactivas del oxígeno y las defensas antioxidantes, provocando daño oxidativo a macromoléculas. Varios estudios han resaltado la importancia del estrés oxidativo en el campo de la ecotoxicología, particularmente su relación con el impacto que generan los contaminantes que alcanzan los cuerpos de agua. El cuantifcar los parámetros de estrés oxidativo ha permitido el uso de los mismos como herramienta de diagnóstico (biomarcadores), con capacidad predictiva del impacto de los contaminantes sobre los organismos. Uno de los índices más frecuentemente utilizados para estimar el daño oxidativo a lípidos es la determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), producto fnal de la peroxidación lipídica. Octopus tehuelchus es un importante recurso pesquero en la costa patagónica, expuesto en algunas áreas a contaminación antrópica. Dado que el estudio de parámetros de estrés oxidativo aún no ha sido abordado en esta Clase de moluscos y que en muchos modelos biológicos, los contaminantes ambientales actúan generando estrés oxidativo, es clave encontrar sus blancos de acción, para empezar a caracterizar las alteraciones metabólicas y fsiológicas asociadas a su mecanismo de acción. El objetivo de este trabajo fue la puesta a punto del método de determinación de daño oxidativo a lípidos en distintos tejidos del pulpo Octopus tehuelchus desde modelos previamente ensayados en el laboratorio.

Palabras clave: Estrés oxidativo; Malondialdehído; Octopus tehuelchus; Cefalópodos.

Abstract. Oxidative stress occurs when there is an unfavorable imbalance between reactive oxygen species and antioxidant defenses, causing oxidative damage to macromolecules. Several studies have highlighted the importance of oxidative stress in the ecology feld related to the impact generated by pollutants reaching water bodies. The quantifcation of oxidative stress parameters led to their use as diagnostic tools (biomarkers) with predictive capability of showing the impact of pollutants on organisms. One of the most frequently used indexes to estimate the oxidative damage to lipids is the determination of reactive thiobarbituric acid substances (TBARs) (fnal product of lipid peroxidation). Octopus tehuelchus is an important fshery resource in the Patagonian coast exposed to anthropogenic pollution. The study of oxidative stress parameters has not been yet tackled in this class of molluscs. Taking into account that, in many biological models, environmental pollutants generate oxidative stress, it is important to fnd their targets of action, to start to characterize metabolic and physiological alterations associated to their mechanisms of action. The aim of this work was to adjust the method of determination of oxidative damage to lipids in various tissues of the octopus, Octopus tehuelchus, from models previously tested in the laboratory.

Keywords: Oxidative stress; Octopus tehuelchus; Malondialdehyde; Cephalopods.

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INTRODUCCIÓN

Vivir en un ambiente oxigenado implica estar expuesto a metabolitos intermedios en la vía de reducción de oxígeno, conocidos como especies reactivas del oxígeno (ERO). Estas moléculas, en ciertas condiciones, pueden resultar tóxicas y lesionar a los componentes celulares.

Existen varios trabajos publicados que relacionan la expectativa de vida de los organismos con el grado de daño oxidativo en su sistema, entre otros parámetros de estrés oxidativo (Orr y Sohal 1994; Sohal y col. 2002; Turrens 2003; Abele y Puntarulo 2004; Halliwell 2007; Monaghan y col. 2009). Asimismo, se sabe en la actualidad, que muchos factores ambientales como la contaminación por metales pesados o pesticidas, pueden inducir estrés oxidativo (Watanabe y Suzuki 2002; Rocchetta 2006; Ochoa y González 2008; Sabatini y col. 2009a, 2009b).

Los factores ambientales pueden modifcar la tasa metabólica de organismos y, consecuentemente, la tasa de producción de ERO. En los invertebrados marinos expuestos a contaminantes de origen antrópico puede aumentar la formación intracelular de ERO y pueden presentar modifcaciones en la actividad de sus defensas antioxidantes, niveles de producción de ERO y su vulnerabilidad a éstas (Regoli 2000; Abele y Puntarulo 2004; Borković y col. 2005). Por otra parte, existen numerosas evidencias de que los animales acuáticos acumulan y transferen distintos tipos de contaminantes, tales como metales y xenobióticos (Amiard 1988; Chaufan y col. 2006; Sabatini y col. 2009b). Los pulpos en particular, poseen una notable capacidad para almacenar grandes cantidades de metales pesados y otros contaminantes, siendo una importante ruta de transferencia hacia los predadores tope, incluido el hombre (Seixas y Pierce 2005; Raimundo y col. 2008). El pulpito, Octopus tehuelchus, es un importante recurso pesquero en varias localidades rurales y urbanas de la costa patagónica (Ré y Ortiz 2008) en el que el estudio de parámetros de estrés oxidativo no ha sido, aún, abordado. Considerando que, en muchos modelos biológicos, los contaminantes ambientales actúan generando estrés oxidativo y que, como otros pulpos, O. tehuelchus sería un importante bioacumulador, es clave establecer los valores basales de los parámetros de estrés para encontrar los blancos de acción de los contaminantes y comenzar a caracterizar las alteraciones metabólicas y fsiológicas asociadas Existen distintas determinaciones que dan indicios del grado de estrés oxidativo que sufren diversos organismos marinos (Sukhotin y col. 2002; Abele y Puntarulo 2004), entre ellos los cefalópodos decápodos (Zielinski y Pörter 2000). Uno de los índices más frecuentemente utilizados para estimar el daño oxidativo a lípidos es la determinación de la peroxidación lipídica mediante la técnica de TBARS (sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico). Como producto fnal de la peroxidación lipídica predomina el malondialdehído (MDA), principal sustrato de esta reacción. El MDA reacciona con el ácido tiobarbitúrico (TBA) en medio ácido en caliente para dar un complejo coloreado, cuyo máximo de absorción es a 535 nm (Ohkawa y col. 1978). El objetivo de este trabajo fue la puesta a punto del método de determinación de daño oxidativo a lípidos en distintos tejidos del pulpo O. tehuelchus basándonos en otros modelos previamente ensayados en el laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS

El área de muestreo fue una región de la costa atlántica de la provincia de Chubut, en las cercanías del Muelle Almirante Storni, en la zona portuaria Puerto Madryn, Golfo Nuevo (42° 45′S, 65° 01′O). En esta región se instalaron refugios artifciales en el piso submareal, a aproximadamente 10 metros de profundidad, que se controlaron periódicamente por buceo. Los ejemplares se capturaron en los meses de abril y mayo de 2009.

Los ejemplares fueron trasladados en agua de mar al Laboratorio de Peces y Mariscos de Interés Comercial (LAPEMAR) en el CENPAT-CONICET y, previo a la disección, se anestesiaron con alcohol al 5% en agua de mar, en acuerdo con las recomendaciones establecidas por Moltschaniwskyj y col. (2007). Se obtuvieron muestras de manto (M), glándulas oviductales (GO), glándula digestiva (GD), brazo (Br), sifón (Si), sistema nervioso (SN) y branquias (Bq). Estos tejidos fueron almacenados a -20°C hasta ser trasladados a Buenos Aires para realizar las mediciones bioquímicas en el Laboratorio de Enzimología, Estrés y Metabolismo (LEEM), del departamento de Química Biológica, FCEN-UBA.

Cada tejido fue homogeneizado mecánicamente con un rotor Precytec, en KCl 0,154 M (1:5, p/v) conteniendo inhibidores de proteasas (fuoruro de fenilmetil sulfonilo -PMSF- 0,5 mM y benzamidina 0,2 mM) según Chaufan y colaboradores (2006). De cada homogenato se fraccionó una alícuota (para hacer las determinaciones en homogenato total) y el resto se centrifugó a 11.000 x g por 20 minutos, obteniéndose un sobrenadante y un precipitado. Todos los preparados se utilizaron inmediatamente o se guardaron a -20ºC hasta su uso. Se trabajó sobre alícuotas de homogenato total, sobrenadante y sedimento de centrifugación de muestras de manto, glándulas oviductales, glándula digestiva, brazo, sifón, sistema nervioso y branquias. Se estimó el índice de peroxidación lipídica mediante la determinación de TBARS (Ohkawa y col. 1978), con ligeras modifcaciones. A alícuotas de 50 ml del homogenato total o del sobrenadante y al sedimento correspondiente (previamente resuspendido en un volumen fnal de 50 ml en buffer de homogeneización) se les agregó 1 ml de reactivo compuesto por TBA 0,3% p/v, TCA 4% (p/v) y hidroxitolueno butilado (BHT) 0,01% (p/v). Se incubaron a 100°C durante 20 minutos. Luego se dejaron enfriar en hielo y se clarifcaron los sobrenadantes por centrifugación a 10.000 x g por 10 min. Se leyó la absorbancia del sobrenadante a 535 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV/visible. La concentración de complejo coloreado se calculó mediante el empleo del coefciente de extinción molar del complejo MDA-TBA en las condiciones de trabajo (156 mmoles^-1.cm^-1.l).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A fn de verifcar en qué localización se lograba la mejor determinación de MDA (valores dentro del límite de detección de la técnica y menor dispersión de datos), se aplicó la técnica de TBARS sobre el homogenato total, el sobrenadante de 11.000 x g y sobre el sedimento de la misma centrifugación.

En la Figura 1 se presentan los datos obtenidos en los distintos tejidos. Se observó que, en la mayoría de los casos (exceptuando el brazo), no hubo diferencias apreciables para la determinación realizada entre los valores obtenidos en el homogenato total y los valores obtenidos en el sobrenadante. Por otra parte, se observó que el valor obtenido para el sobrenadante y el homogenato total indicarían que, durante la homogeneización, el MDA se liberó a la fracción soluble y se recuperó totalmente con el sobrenadante de homogenato tras la centrifugación a 11.000 x g. Medir una alícuota del homogenato total con precisión resultó difcultoso, dado que se trató una suspensión de alta densidad y no totalmente homogénea, por lo que, desde este punto de vista, resultó más conveniente utilizar el sobrenadante como material de partida para realizar determinaciones cuantitativas y lograr duplicados más precisos y exactos (Tabla 1). Esto se aplicó a todos los tejidos analizados, excepto el brazo, para el cual resultó mejor trabajar con el homogenato total, dado que los niveles obtenidos en esta fracción fueron mayores que los obtenidos para el sobrenadante. Esto pudo deberse a que el proceso de homogeneización no fue lo sufcientemente efectivo para este tejido y que una parte signifcativa de los productos de peroxidación lipídica fue retenida en los fragmentos celulares, que luego de la centrifugación sedimentaron. En cuanto al tejido óptimo para la determinación de la peroxidación lipídica en O. tehuelchus, los resultados indicaron que los mayores valores para esta determinación se obtuvieron en glándula digestiva, seguido por el sistema nervioso, aunque en todos los tejidos analizados se obtuvieron valores medibles, revelando una gran sensibilidad de la técnica en este organismo. Esto permitió concluir que la técnica es aplicable para cualquiera de los tejidos analizados, partiendo de homogenato total para el caso del brazo o sobrenadante de homogenato en el resto de los tejidos.

Figura 1. Contenido de MDA (μmoles de MDA/gr de tejido), en los distintos sistemas y órganos ensayados. GO: glándulas oviductales, SN: sistema nervioso, Bq: branquias, Br: brazo, M: manto, Si: sifón, GD: glándula digestiva. Los datos están expresados como la media ± el desvío estándar.

Tabla 1. Contenido de MDA (μmoles de MDA/gr de tejido), en el homogenato total y en las fracciones obtenidas por centrifugación a 11.000 x g durante 20 minutos.
Los datos están expresados como la media ± el desvío estándar.

A partir de las variables ensayadas en el presente trabajo, se propone que el sobrenadante de homogenato de 11.000 x g, de la glándula digestiva de O. tehuelchus, sería la muestra de elección sobre la cual realizar el bioensayo en futuras investigaciones.

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