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Estudio comparativo de la frecuencia de micronúcleos y anormalidades nucleares en eritrocitos de tres especies ícticas

Comparative studies of the frequency of micronuclei and nuclear abnormalities in erythrocytes of three species fishes

 

Pollo, Favio E.¹; Salas, Nancy E.¹; Mancini, Miguel A.²; Martino, Adolfo L.¹

¹Ecología, Dpto de Cs Naturales, Fac Cs Exa Fco-Qca y Nat.
²Acuicultura, Fac Agro-Vet. Universidad Nacional de Río Cuarto. Ruta Nacional N° 36 - Km 601, (X5804BYA) Río Cuarto, Córdoba, Argentina.

faviopollo@gmail.com

Recibido: 18 de junio de 2012
Aceptado: 4 de septiembre de 2012

 

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Resumen. Los ecosistemas acuáticos cercanos a las zonas urbanas sufren un deterioro constante ocasionado por diversos factores físico-químicos relacionados con la actividad antrópica, representando un riesgo para los organismos que los habitan, en especial los peces. Estos efectos pueden ser biomonitoreados mediante técnicas de amplia utilización, como el Test de Micronúcleos (Mn) y el de Anormalidades nucleares (AN), entre otros. El objetivo de este trabajo fue verifcar y comparar la frecuencia de micronúcleos y anormalidades nucleares en tres especies ícticas colectadas en un lago urbano, Cyprinus carpio, Astyanax eigenmanniorum y Cheirodon interruptus. Luego de la captura y anestesia de los peces, se extrajo de cada individuo una muestra de sangre y se registró el peso y la longitud total. Las muestras fueron fjadas y luego teñidas con Giemsa al 10%, posteriormente se las analizó con microscopio (1000X) y se les tomaron fotografías con cámara digital. Se calculó, además, el índice de condición corporal (K) para cada uno de los ejemplares capturados. Se aplicó un análisis de correlación de rangos de Spearman (rs) entre frecuencia de Mn y AN vs K para cada especie. La prueba de Kruskal-Wallis se aplicó para evaluar diferencias de Mn y AN entre las especies. Los resultados no mostraron una correlación estadísticamente signifcativa (P> 0,05) entre las frecuencias de Mn y AN vs K. Las frecuencias de Mn entre las diferentes especies no arrojaron diferencias signifcativas (P> 0,05), mientras que las AN sí (P< 0,05). Astyanax eigenmanniorum fue la especie que mayor sensibilidad presentó. Las diferencias preliminares de AN entre las especies utilizadas, convierten a A. eigenmanniorum en una especie "centinela" y posible biomonitor de agentes xenobióticos.

Palabras clave: Micronúcleos; Anormalidades nucleares; Peces; Xenobióticos.

Abstract. Aquatic ecosystems near urban areas suffer a steady deterioration caused by physical and chemical factors related to human activity, representing a danger to organisms that inhabit them, especially the fsh. These effects may be biomonitored by widely used techniques, such as the Micronucleus Test (Mn) and Nuclear Abnormalities (NA), among others. The aim of this study was to verify and compare the frequency of micronuclei and nuclear abnormalities in three fsh species collected in an urban lake, Cyprinus carpio, Astyanax eigenmanniorum and Cheirodon interruptus. After the capture and anesthesia of the fsh, weight and length were registered, and a blood sample was obtained from each individual. The samples were fxed and stained with 10% Giemsa, subsequently they were analyzed with the microscope (1000X) and photographed with a digital camera. The body con-dition index (K) was calculated for each fsh caught. A correlation analysis Spearman rank (rs) between frequency of Mn and NA vs. K was performed for each species. The Kruskal-Wallis test was applied to assess differences in Mn and NA between species. The results showed no statistically signifcant correlation (P> 0.05) between the frequencies of Mn and NA vs K. The frequencies of Mn between different species yielded no signifcant differences (P> 0.05), whereas NA (P <0.05) did. A. eigenmanniorum was the most sensitive species. NA preliminary differences between the species used, convert A. eigenmanniorum in a sort of "sentinel specie" and a possible biomonitor of xenobiotic agents.

Keywords: Micronuclei; Nuclear abnormalities; Fish; Xenobiotics.

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INTRODUCCIÓN

El rápido crecimiento de la población humana, la industrialización, y la urbanización son las principales causas asociadas a la contaminación del agua, la cual pone en peligro a los ecosistemas acuáticos continentales (Vázquez Silva y col. 2006). En general, estos ecosistemas mantienen una gran diversidad de organismos, por lo que los impactos, como la introducción de xenobióticos inducen cambios en la estructura de las comunidades, la dinámica de las poblaciones y las funciones biológica de los organismos, afectando su ciclo de vida, crecimiento y condición reproductiva (López 2008).

Como respuesta a esta problemática, ha surgido la necesidad de realizar monitoreos de los recursos biológicos con el propósito de detectar cambios signifcativos en la fora y en la fauna (Margalef 1974). Durante los últimos años, se han intensifcado los estudios destinados a detectar los impactos sobre los ecosistemas acuáticos provocados por la contaminación derivada de las actividades humanas. En la última década, el uso y desarrollo de biomarcadores ha cobrado un gran interés a la hora de evaluar el riesgo de una sustancia o mezcla de sustancias químicas potencialmente tóxicas. Particularmente, los biomarcadores de efecto son buenos parámetros indicativos de la presencia de sustancias exógenas o cambios biológicos como respuestas a distintos xenobióticos (Palma Acuña 2005; Hurtado Alarcón y col. 2007). Entre los marcadores más utilizados se encuentran el Ensayo Cometa, aberraciones cromosómicas, intercambio de cromátidas hermanas y micronúcleos (Klobucar y col. 2010). Muchos grupos de organismos han sido propuestos como indicadores de la calidad ambiental en ecosistemas acuáticos. Sin embargo, las comunidades de peces se han convertido en bioindicadoras para los programas de monitoreo biológico, por cubrir muchos eslabones de la cadena alimenticia, por acumular sustancias tóxicas y reaccionar a bajas concentraciones de xenobióticos (Torres Bugarín y col. 2007).

El objetivo de este trabajo fue verifcar y comparar la frecuencia de Micronúcleos (Mn) y Anormalidades Nucleares (AN) en tres especies ícticas colectadas en un ambiente urbano.

MATERIAL Y MÉTODOS

El lago urbano Villa Dálcar (S 33º 07'- W 64º 20') se encuentra ubicado al oeste de la ciudad de Río Cuarto, Córdoba, Argentina (Figura 1). Es un lago artifcial de múltiples usos que mantiene su volumen de agua por bombeo y escorrentías de las zonas próximas. El lago tiene una superfcie aproximada de 7 ha y una profundidad máxima superior a los 3 metros. Este ambiente ha registrado en los últimos años episodios de mortandades de peces de diferentes especies, algunos de los cuales de acuerdo a su magnitud y características, fueron asociados a la presencia de sustancias tóxicas (Mancini y col. 2011).

Figura 1. Ubicación geográfca del sitio en la provincia de Córdoba.

Durante los años 2009 y 2010 se realizaron tres colectas. Se obtuvieron un total de 73 peces pertenecientes a las siguientes especies: carpa (Cyprinus carpio), mojarra (Astyanax eigenmanniorum) y mojarrita (Cheirodon interruptus). Los peces fueron procesados en forma inmediata a su captura en el campo, donde se anestesiaron con metomidato incorporado directamente en el agua a una concentración de 5 mg/l (Stoskopf 1993). Se registró la longitud total por medio de un ictiómetro con precisión de 1 mm y el peso total húmedo con una balanza digital Ohaus Scout II con una precisión de 0,1 g. Las muestras de sangre se tomaron mediante un corte en el pedúnculo caudal (Torres Bugarín y col. 2007), posteriormente se realizaron los frotis sobre portaobjetos limpios previamente codifcados. Las muestras fueron fjadas con metanol por 20 minutos, luego se enjuagaron con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente. Finalmente se procedió a la tinción con Giemsa al 10% durante 25 minutos (Junín y col. 2008). La lectura de la frecuencia de aparición de Mn y AN se cuantifcó para 4000 eritrocitos por individuo, utilizando un microscopio Zeiss Axiophot-Axiolab con objetivo de 100 X de inmersión en aceite. Se tomaron fotografías con cámara digital Axiocam HRc Zeiss con la utilización de software Axio Vision 4.3.

Los Mn fueron identifcados según los criterios sugeridos por Schmid (1975) y Fenech (2000), mientras que para las AN se siguieron las clasifcaciones realizadas por diferentes autores (Çavas y Ergene-Gözükara 2005; da Silva Souza y Fontanetti 2006; Ergene y col. 2007; Zafalon Silva y Bobrowski 2008; Cogua y Duque 2009).

Con las medidas morfométricas, se calculó el índice de condición corporal (K) en cada uno de los ejemplares capturados, por medio de la siguiente fórmula:

K = (P)* (1000)/L³ donde P = peso total y L = longitud total (Royce 1996). Posteriormente, se aplicó un análisis de correlación de rangos de Spearman (r_s) entre frecuencia de Mn, AN vs K para cada especie. La prueba estadística no paramétrica de Kruskal-Wallis se utilizó para evaluar diferencias de Mn y AN entre las tres especies. Para el análisis de los datos se utilizó el programa Statgraphics v. 5.0.

RESULTADOS

En la Tabla 1 se resume la frecuencia de Mn y AN de cada especie con su correspondiente desvío estándar. Mientras que en la Tabla 2 se presentan los valores promedios para cada especie de la longitud total, peso e índice de condición. En la Figura 2 se muestran las distintas AN registradas en sangre periférica de las tres especies estudiadas. A través de la prueba de Kruskal-Wallis, se observó que los valores de eritrocitos micronucleados no mostraron diferencias signifcativas entre las especies ícticas (P> 0,05). Por el contrario, las AN sí exhibieron diferencias signifcativas entre especies, utilizando la misma técnica estadística (H= 28,99; P< 0,05), donde A. eigenmanniorum fue la especie más afectada.

Figura 2. Eritrocitos de sangre periférica de Cyprinus carpio, Cheirodon interruptus, Astyanax eigenmanniorum, a) Eritrocito con micronúcleo, b) Eritrocito globular, c) Eritrocito escotado, d) Eritrocito brotado, e) Eritrocito binucleado y f) Eritrocito con puente núcleo plasmático.

Tabla 1. Frecuencia media, desvío estándar de micronúcleos y anormalidades nucleares de las especies estudiadas.

Tabla 2. Longitud, peso e índice de condición corporal promedio para cada una de las especies estudiadas

No se encontró correlación entre la frecuencia de Mn y el índice de condición corporal para C. carpio (r_s = 0,05; P> 0,05) y C. interruptus (r_s = 0,07; P> 0,05). Para A. eigenmanniorum la correlación fue de r_s = 0,36, pero no signifcativa (P> 0,05). En el caso de la frecuencia de AN los valores fueron, C. carpio (r_s = 0,35; P> 0,05), C. interruptus (r_s = 0,12; P> 0,05) y A. eigenmanniorum (r_s = 0,15; P> 0,05), como se observa tampoco fue estadísticamente signifcativa.

DISCUSIÓN

La cuantifcación in situ de Mn y AN en eritrocitos de peces ha demostrado ser un adecuado biomarcador en la evaluación del impacto de xenobióticos en ecosistemas acuáticos (Junín y col. 2008; Palacios Betancur y col. 2009). Sin embargo, algunos autores han señalado la importancia de la elección adecuada de la especie (Hurtado Alarcón y col. 2007; Torres Bugarin y col. 2007; Klobucar y col. 2010). Las tres especies en estudio presentaron formación de Mn y AN, observándose la mayor frecuencia en A. eigenmanniorum y la menor en C. carpió. Esto puede tener cierta relación con la rusticidad de esta última especie (Mancini y Grosman 2008) y el pequeño tamaño de los ejemplares analizados.

En el caso de los Mn, estos tuvieron una frecuencia de aparición muy baja en las tres especies. Comparando nuestros resultados con los reportados por otros autores, los valores en todos los casos fueron mucho mayores a los obtenidos en este trabajo (Gustavino y col. 2001; Zhu y col. 2004; Arkhipchuk y Garanko 2005; Çavas y col. 2005; Ossana y col. 2009). En cuanto a la frecuencia de las AN, estas presentaron siempre valores mayores que los Mn en las tres especies, resultados que coinciden con los de otros autores (Zafalon Silva y Bobrowski 2008). Dado que el mecanismo de formación de estas anormalidades no es muy claro, solo se registran sus valores (Ramsdorf 2007; Rocha y col. 2010). La correlación entre el índice de condición corporal y la frecuencia de Mn y AN en las tres especies, no mostró relación estadísticamente signifcativa, lo que estaría evidenciando que el número de Mn y AN no se asocia, en principio, con la condición corporal de los peces, fenómeno que también ha sido observado en otras especies (Palacios Betancur y col. 2009). Las frecuencias observadas podrían estar relacionadas con el transporte de sustancias por escorrentías de las zonas aledañas que ingresan luego de abundantes precipitaciones o por la concentración de las mismas, ya que en la actualidad no ingresa agua superfcial en forma periódica, manteniendo actualmente su volumen por bombeo y escorrentías producto de las lluvias.

De las tres especies estudiadas, A. eigenmanniorum exhibió una mayor sensibilidad frente a la potencial presencia de agentes xenobióticos. Estos resultados coinciden con los de Ramsdorf (2007), quien reporta al género Astyanax como un buen biomonitor de calidad ambiental. En el mismo sentido, A. eigenmanniorum fue, dentro de la ictiofauna del lago Villa Dálcar, la especie que registró mayor cantidad de ejemplares muertos en un cuadro de intoxicación registrado en el año 2009 (Mancini y col. 2011).

Las diferencias preliminares de AN entre las especies utilizadas en este estudio, sumado a la facilidad de captura, hábitos alimenticios y a la gran diversidad de hábitats que esta especie presenta en la región sur de América, convierten a A. eigenmanniorum en una especie "centinela" y posible biomonitor de agentes xenobióticos. Por último, se recomienda la realización de bioensayos con xenobióticos identifcados para corroborar la posibilidad de utilizar a A. eigenmanniorum en estudios de mayor precisión.

Agradecimientos: a los encargados del cuidado del lago Villa Dálcar. Este trabajo fue realizado con el fnanciamiento de los programas 18/C350 y 18/A277 de la Secretaría de Ciencia y Técnica (SECyT) de la Universidad Nacional de Río Cuarto.

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