RESÚMENES DE TESIS

Caracterización bioquímica del veneno de la serpiente de coral Micrurus tener

Bénard-Valle, Melisa

Instituto de Biotecnología, Universidad Autónoma de México. México. Av. Universidad 1001, colonia Chamilpa. Cuernavaca, Morelos.

mel@ibt.unam.mx

Las serpientes de coral son el grupo de elápidos más diversifcado en el continente americano y pueden ser encontradas en prácticamente todos los hábitats desde el sur de E.U.A. hasta Argentina. Debido en parte a sus hábitos semifosoriales y a su naturaleza poco agresiva, estas serpientes ocasionan menos del 5% de los accidentes ofídicos que ocurren en América. Independientemente de su baja incidencia, estos envenenamientos ocasionan cuadros clínicos marcadamente neurotóxicos cuya severidad varía de leves a muy graves e incluso fatales. La investigación de la composición de estos venenos y la caracterización de sus componentes tóxicos es de vital importancia en la comprensión de la fsiopatología de los envenenamientos y por lo tanto el desarrollo de tratamientos adecuados. El objetivo del presente trabajo fue identifcar y caracterizar los componentes más relevantes del veneno de Micrurus tener involucrados en los procesos de envenenamiento en ratones así como en sus presas naturales. Éste contribuirá a ampliar el conocimiento actual respecto a la bioquímica de los venenos de serpientes de coral. Además, proporcionará nuevas herramientas para el estudio de estas toxinas desde un punto de vista funcional y toxicológico.

La estrategia experimental consistió en 3 etapas. En la primera se llevó a cabo el análisis del veneno completo mediante un ensayo titulométrico de actividad de fosfolipasa A₂ (PLA₂) sobre yema de huevo y electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Posteriormente, se determinó la dosis letal media (DL₅₀) y se realizaron observaciones de la signología en ratones y serpientes (género Conopsis) al inyectar el veneno por vía intravenosa y subcutánea. Para iniciar la segunda etapa, el veneno fue separado por RP-HPLC y cada una de las fracciones obtenidas fue sometida a los mismos ensayos que el veneno completo además de una determinación de masas moleculares mediante espectrometría de masas (ESI-MS). A partir de la información obtenida en las primeras dos etapas del proyecto, fueron seleccionadas las fracciones para realizar la tercera etapa. Ésta consistió en la determinación de la afnidad de cada fracción por el receptor nicotínico de acetilcolina muscular adulto (nAChR a(3ey) murino mediante ensayos electrofsiológicos en los que se expresaron los receptores en ovocitos maduros de Xenopus laevis. Para realizar las mediciones se utilizó la técnica de Voltage Clamp de dos electrodos. Se determinó en el veneno completo de M. tener una actividad de PLA₂ de 113,2 U/mg, la cual es acorde con la actividad observada en experimentos similares para otros venenos de coralillos norteamericanos. En cuanto a sus efectos in vivo, se determinó en ratones una DL₅₀ i.v. de 1,2 μg/g y una DL₅₀ subcutánea (s.c.) de 4,4 μg/g mientras que la DL₅₀ s.c. en reptiles fue de 12,1 μg/g. Posteriormente, se decidió obtener una dosis paralizante media (DP₅₀) defnida como la dosis capaz de ocasionar una parálisis fácida generalizada al 50% de una población inyectada por vía subcutánea. No se observaron diferencias signifcativas al comparar la DP₅₀ s.c. en ratones (4,7 μg/g) con la DP₅₀ s.c. en reptiles (4,1 μg/g) por lo que no es posible suponer la existencia de especifcidad del veneno por alguno de los modelos de estudio. Por otro lado, estas observaciones permiten concluir que el principal efecto ocasionado por el veneno es la parálisis fácida y la muerte de los ejemplares es consecuencia de ésta.

Al pasar el veneno por una columna C18 (RP-HPLC) se obtuvieron 32 fracciones, cada una de las cuales presentaba entre 2 y 8 componentes de masas moleculares distintas. Se identifcaron cinco familias: a) compuestos de bases nitrogenadas; b) péptidos de bajo peso molecular (1 a 5 KDa); c) componentes a-neurotóxicos; d) fosfolipasas A2 activas y e) proteínas de mayor peso molecular (17 a 22 KDa). El grupo de componentes a-neurotóxicos representa cerca del 40% del veneno total y lo conforman moléculas con peso molecular entre 6 y 8 KDa. Entre éstas, sólo una fracción (F12) ocasionó parálisis fácida y muerte tanto en el modelo murino como en el reptil. Por otro lado, la fracción 6 ocasionó parálisis fácida y muerte en el modelo murino, sin embargo no tuvo ningún efecto en serpientes. Finalmente, las fracciones 10, 11, 13 y 15 ocasionan algún grado de parálisis (desde debilidad hasta parálisis fácida generalizada y muerte) en las serpientes mientras que no tienen ningún efecto observable en ratones. En los experimentos electrofsiológicos se observó que seis de las fracciones probadas (F6, F8, F10, F11, F12 y F13) tienen efecto bloqueador del nAChR a|3ey murino con una dosis inhibitoria media entre 24 nM (F6) y 496,6 nM (F11). La familia de fosfolipasas A₂ activas está conformada principalmente por componentes de peso molecular entre 13 y 14 KDa y representa alrededor del 39% del total del veneno. En todas ellas se detectó actividad fosfolipasa A₂. En cuanto a sus efectos in vivo, las fracciones 20a, 22 y 23 probaron ser letales en el modelo murino y ocasionar algún grado de parálisis en serpientes. No se observó efecto alguno en ninguno de los modelos animales con el resto de las fracciones probadas. El veneno de Micrurus tener está constituido por una mezcla compleja de componentes. Entre éstos, los más relevantes durante el envenenamiento en ratones son a-neurotoxinas y fosfolipasas A₂. No se observó mayor letalidad del veneno completo al ser inyectado en serpientes respecto a aquella observada tras su inyección a ratones. El principal efecto ejercido por el veneno en ambos modelos animales es la parálisis fácida. Respecto a las fracciones del veneno, solamente cinco mostraron ser letales para ratones. Se identifcaron 6 fracciones con capacidad bloqueadora del nAChR murino. Se observaron 4 fracciones que ocasionan parálisis fácida en serpientes y sin embargo no tienen ningún efecto en ratones, lo cual puede ser evidencia de especifcidad por los nAChR de reptiles.

Apoyo económico: Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), México. Instituto Bioclon, México.

Tesis para optar al título de Maestra en Ciencias Bioquímicas. Director: Dr. Alejandro Alagón Cano