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Citotocixidade e atividade antiparasitária de Lygodium venustum SW

Cytotoxic and antiparasitic activity of Lygodium venustum SW

 

Morais-Braga, Maria Flaviana B.¹; Souza, Teógenes .M.¹; Santos, Karla K.A.¹; Andrade, Jacqueline C.¹; Guedes, Gláucia M.M.¹; Tintino, Saulo R.¹; Souza, Celestina E.S.¹; Costa, José G.M.²; Saraiva, Antônio A.F.³; Coutinho, Henrique.D.M.¹*

¹Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular,
²Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais,
³Laboratório de Paleontologia da Universidade Regional do Cariri, Crato, Brasil.

*hdmcoutinho@gmail.com

Recibido: 2 de agosto de 2012
Aceptado: 12 de marzo de 2013

 

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Resumo. Doenças parasitárias infecciosas como leishmaniose e doença de Chagas tem se difundido nas últimas décadas a locais onde antes não se observava sua ocorrência. São consideradas negligenciadas por assolarem países pobres e serem marginalizadas farmacologicamente. O tratamento não apresenta muitas opções de fármacos e estes demonstram relevante toxicidade contribuindo para o aparecimento de diversos efeitos colaterais. A pesquisa com produtos naturais tem se mostrado uma interessante alternativa para a procura por novos fármacos. Lygodium venustum é uma samambaia cosmopolita de hábito lianescente encontrada na encosta na Chapada do Araripe, considerada por algumas populações americanas como planta medicinal para o tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases. Neste estudo foi avaliada sua atividade anti-parasitária contra Leishmania brasiliensis e Trypanosoma cruzi, bem como sua citotoxicidade através de ensaios n vitro. Foram testadas a fração hexânica e o extrato etanólico obtido das folhas de Lygodium venustum em diferentes concentrações. Para os testes in vitro de T. cruzi, foi utilizado o clone CL-B5 e para Leishmania brasiliensis foram utilizadas formas promastigotas. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com linhagens de fbroblastos. L. venustum não apresentou atividade antiparasitária clinicamente relevante na forma de extrato etanólico bruto nem como fração hexânica contra Leishmania. A fração hexânica apresentou uma atividade intermediária contra T. cruzi, porém a concentração de efeito moderado possui citotoxicidade máxima tornando-se inviável para aplicação clínica. Entretanto, a citoxicicidade apresentada poderá ser útil em pesquisas sobre atividade antineoplásica em células tumorais.

Palavras-chave: Samambaia; Atividade leishmanicida; Atividade tripanocida; Fração hexânica.

Abstract. Infectious and parasitic diseases like leishmaniasis and Chagas disease have spreading recent decades to places not observed before. They are considered neglected by desolating poor countries and marginalized pharmacologically. There are not many options for the treatment and these drugs have shown signifcant toxicity contributing to the appearance of several side effects. Research on natural products has been shown to be an interesting alternative to the search for new drugs. Lygodium venustum is a cosmopolitan fern with latescence habit found on the Chapada do Araripe, considered by some American populations as a medicinal plant for the treatment of skin diseases, infections, fungal infections and trichomoniasis. This study evaluated its antiparasitic activity against Trypanosoma cruzi and Leishmania brasiliensis, as well as its cytotoxicity through trials in vitro. We tested the ethanolic extract and hexane fraction obtained from the leaves of L. venustum at different concentrations. For in vitro tests of T. cruzi, we used the clone CL-B5 and for L. brasiliensis we used promastigotes. The cytotoxicity assay was performed with strains of fbroblasts. L.venustum showed no antiparasitic activity clinically relevant in the form of crude ethanolic extractor as the hexane fraction against Leishmania. The hexane fraction showed an intermediate activity against T.cruzi, but the concentration of moderate effect has maximum cytotoxicity becoming unfeasible for clinical application. However, the cytotoxicity presented may be useful in research on antineoplastic activity in tumor cells.

Keywords: Fern; Leishmanicidal activity, Trypanocidal activity; Hexane fraction.

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INTRODUÇÃO

Doenças infecciosas que acometem primordialmente os países em desenvolvimento tem sido a causa de morte de milhões de pessoas em todo o mundo. Estas doenças são negligenciadas e têm afligido a humanidade desde tempos imemoráveis e afetam principalmente comunidades marginalizadas, sem influência política, em áreas remotas, zonas de conflitos ou favelas urbanas onde há pouco ou nenhum acesso à saúde ou outros serviços. A alta morbidade das doenças afeta a freqüência escolar, o desenvolvimento cognitivo, o crescimento e a produtividade em geral (WHO 2003). Entre as doenças consideradas negligenciadas podemos citar a Doença de Chagas e Leishmaniose.

Ações vêm sendo realizadas no sentido de estabelecer metas por tempo limitado para o controle de algumas destas doenças mesmo diante de difculdades como recursos financeiros limitados, falta de pessoal treinado e fraqueza ou carência de infraestrutura de saúde para alcançar as populações afetadas (WHO 2003). Além dos entraves impostos por estas situações, ainda há uma grande desafo que é chamar a atenção da indústria farmacêutica, diante do reduzido potencial de retorno lucrativo. Dessa forma, o conhecimento produzido pelas pesquisas não se reverte em avanços terapêuticos, como, por exemplo, novos fármacos, métodos diagnósticos e vacinas (Ministério da Saúde 2010). Portanto, além de estigmatizadas socialmente, as pes-soas afetadas por estas doenças se vêem também marginalizadas farmacologicamente. A leishmaniose é uma doença prevalente em 88 países, em 4 continentes, estimando-se que cause 1,6 milhões de novos casos anualmente, dos quais cerca de 500.000 sejam visceral e 1,1 milhões cutânea ou mucocutânea (WHO 2010). Os agentes causadores dessa doença são parasitas unicelulares heteroxênicos do gênero Leishmania que apresentam duas formas morfológicas no seu ciclo de vida: promastigota, quando estão infectando o inseto vetor e amastigota quando estão infectando o homem (Magill 1995; Michalick 2005). Apresenta diversos tipos de manifestações clínicas e se dividem em dois grupos principais: a forma tegumentar, que pode ser cutânea localizada, que se caracteriza por lesões únicas ou múltiplas na pele, geralmente no rosto, braços e pernas; cutânea difusa, com lesões nodulares persistentes, no corpo inteiro; e mucocutânea ou cutâneo mucosa, que afeta de maneira preponderante as mucosas da face, como fossas nasais e o palato; e as formas viscerais, que se caracteriza pelo aumento no volume do fígado e baço, anemia, perda de peso e febre, e que, se não tratada a tempo, pode ser fatal (Grevelink e Lerner1996; Herwaldt 1999; Hepburn 2000). Apesar de sua alta toxicidade, os antimoniais pentavalentes têm sido utilizados como drogas de primeira escolha para tratamento da Leishmaniose. A anfotericina B lipossomal, pentamidina, paramomicina e miltefosine são drogas de interesse por representarem novas alternativas terapêuticas, porém apresentam grandes problemas como efeitos colaterais, preço do produto e produção da formulação (Pereira et al. 2011) . A Organização Mundial de Saúde (WHO 2010) recomenda que a leishmaniose visceral - que tem potencial de desenvolver resistência a drogas - seja tratada com combinação de medicamentos ao invés de monoterapia. Porém, desde 2009 foi recomendado que anfotericina B lipossomal seja utilizada como estratégia provisória até que as combinações possam ser implementadas. A doença de Chagas é uma zoonose causada por Trypanosoma cruzi, que continua a persistir na Região das Américas, entretanto com a introdução de medidas de controle de vetores e transfusão de sangue mais segura, diminuiu-se o risco de transmissão e com isto, o número estimado de pessoas infectadas caiu de aproximadamente 20 milhões em 1981 para cerca de 10 milhões em 2009. Porém, devido a mobilidade da população ser cada vez maior, tem ocorrido o movimento da doença para áreas antes consideradas não--endêmicas, representando um desafo sério de saúde pública (WHO 2010). As formas de transmissão de maior importância epidemiológica são a vetorial através de insetos hematófagos, os triatomíneos (barbeiros), a transfusional, a congênita e a oral (Coura et al. 2007). O T. cruzi possui um ciclo biológico complexo, envolvendo três formas evolutivas (tripomastigota, epimastigota e amastigota) e várias espécies de triatomíneos e de mamíferos, silvestres e domésticos, que atuam respectivamente, como vetores e reservatórios do parasito (Lana e Tafuri, 2005). As doenças endêmicas parasitárias representam um grave problema médico, social e humano e sua prevenção, controle e tratamento representam um grande desafo mundial (Dias et al. 2009). Atualmente, os dois medicamentos usados para o tratamento são benzonidazol e nifurtimox, sendo que este último é contraindicado em pacientes com antecedentes psiquiátricos ou distúrbios neurológicos (WHO 2010), tendo sido abolido em alguns países. Portanto, pesquisas por novos fármacos antiparasitários para o combate da leishmaniose e da doença de Chagas são urgentes e necessárias. Neste trabalho, iremos verifcar o potencial leishmanicida e tripanocida, bem como a citotoxicidade de uma samambaia lianescente, Lygodium venustum, cujo uso popular tem sido relatado para o tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases (Duke 2008).

MATERIAIS E MÉTODOS

Material vegetal

Folhas de L. venustum foram coletadas em Crato, estado do Ceará, Brasil em maio de 2010. O material vegetal foi identifcado pelo Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva e depositado no Herbário Cariense Dárdano de Andrade-Lima da Universidade Regional do Cariri URCA, com o número 5569 HCDAL.

Preparação do extrato etanólico e fração hexânica das folhas de L. venustum Folhas frescas de L. venustum (211,18 g) foram submersas em etanol 92% em temperatura ambiente durante 72 h. O extrato obtido foi fltrado e concentrado a vácuo em rotaevaporador a 60ºC e 760 mmHg de temperatura e pressão, respectivamente, obtendo-se 12,42 g de extrato bruto. O fracionamento foi realizado tomando-se metade do extrato bruto, obtendo-se a fração hexânica com rendimento de 0,22 g. Foram diluídos 0,01 mg do extrato e da fração em dimetilsulfóxido (DMSO) para realização dos testes.

Linhagens celulares utilizadas Para estudos in vitro de T. cruzi, cepas de parasito CL-B5 (clone CL-B5) foram usados. Os parasitos estavelmente transfectados com o gene ß -galactosidase de Escherichia coli (LacZ ) foram gentilmente cedidos pelo Dr. F. Buckner por meio do Instituto Comemorativo Gorgas (Panamá). Os epimastigotas foram cultivados a 28°C em infusão de fígado tripto-se (LIT) com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina e estreptomicina como descrito anteriormente e colhidas durante a fase de crescimento exponencial.

Para o estudo da atividade leishmanicida in vitro, foi utilizado formas promastigotas de L. braziliensis (MHOM/CO/88/UA301) a 26°C em Schneider's (meio para inseto) suplementado à 10% (v/v) de soro fetal bovino inativado pelo calor, 2% de urina humana normal (v/v) mais penicilina e estreptomicina. A linhagem de células utilizada no teste de citotoxicidade foi a de fbroblastos de mamífero NCTC clone 929. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado a 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor (30 minutos a 56ºC), penicilina G (100 U/ ml) e estreptomicina (100 mg/ml). Para os experimentos, as células na fase préconfuência foram colhidas com tripsina. Culturas de células foram mantidas a 37ºC em uma atmosfera de 5% umidifcado CO₂.

Ensaio de susceptibilidade para as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi O ensaio de rastreamento foi realizado em placas de microdiluição de 96 poços (Sarstedt, Inc.) com culturas que não atingiram a fase estacionária, como descrito por Vega et al (2005). Epimastigotas foram semeadas a 1 x 10⁵ por mililitro em 200 μl, as placas foram então incubadas com os extratos a 28°C por 72 horas, momento em que 50 μl de solução CPRG foram adicionados para dar a concentração fnal de 200 μM, as placas foram incubadas a 37°C por mais 6 h adicionais e então lidas a 595 nm em espectrofotômetro. O Nifurtimox foi utilizado como droga de referência. Cada concentração foi testada em triplicata. Cada experimento foi realizado duas vezes separadamente. O percentual de inibição (%AE) foi calculado como segue: %AE = [(AE _AEB)/ (AC _ACB)] x 100, onde AE = absorbância do grupo experimental; AEB = branco de compostos; AC = grupo controle de absorbância; ACB = branco de meio de cultura. As soluções dos extratos a ser analisado foram preparadas em dimetilsufóxido, com a concentração fnal uma mistura água/DMSO jamais excedendo 0,2% do solvente fnal.

Ensaio de suscetibilidade para formas promastigotas de Leishmania brasiliensis O ensaio foi realizado seguindo um método anteriormente descrito (Mikus e Steverding 2000 com modifcações). Formas promastigotas (2,5 x 105 parasitas/poço) foram cultivadas em placas de 96 poços de plástico. As amostras foram dissolvidas em dimetilsufóxido (DMSO). Diferentes diluições dos compostos de até 200 ml de volume fnal foram adicionados. Após 48 h a 26 °C, 20 ml de solução de resazurina foi adicionado e a oxidação-redução foi quantifcada a 570 a 595 nm Cada concentração foi testada em triplicata. Em cada ensaio foi utilizado como controle drogas de referência. As porcentagens antipromastigotas (%AP) formam calculadas. A efcácia de cada composto foi determinada.

Ensaio de citotoxicidade

O procedimento para a mediçáo de viabilidade celular foi avahada com resarzurina por método colorimétrico descrito anteriormente (Rólon et al. 2006). Fibroblastos NCTC929 foram semeados (5 x 10⁴ células/ poço) em placas de microdiluiçáo de fundo chato de 96 poços com 100 ul de meio RPM11640. Deixouse que as células pavimentassem as placas por 24 h a 37°C e atmosfera de 5% de C0₂. O meio foi substituído por diferentes concentraçóes das drogas em 200 μl de meio e, em seguida, foram incubados por mais 24 h. Controles de crescimento também foram incluídos. Posteriormente, um volume de 20 ul da soluçáo 2 mM de resazurina foi adicionado e as placas foram devolvidas á incubadora por outras 3 h para avahar a viabilidade celular. A reduçáo da resazurina foi determinada por medida de absorbencia do comprimento de onda a 490nm e 595nm. Cada concentracáo foi testada três vezes. Meio e drogas controle foram usados em cada teste como brancos. A citotoxicidade de cada composto foi estimada através do cálculo do percentual de citotoxicidade (C%). A atividade tripanocida e a citotoxicidade foram testadas paralelamente, enquanto que a atividade leishmanicida foi testada somente ñas concentraçóes em que não foram tóxicas às células de mamíferos.

RESULTADOS E DISCUSSÁO

No presente estudo foram avahadas a citotoxicidade de Lygodium venustum utilizando fbroblastos de mamíferos e a bioatividade antiparasitária contra as formas epimastigota de T. cruzi e promastigota de L. brasiliensis. A forma epimastigota de T. cruzi apresenta-se de forma alongada, com cinetoplasto justanuclear e anterior ao núcleo e fagelo livre na porçáo anterior. Podemos identifcá-la como sendo a forma de replicacáo que se observa no hospedeiro invertebrado (triatomíneo) localizada na porçáo posterior do intestino e em cultura em meio líquido (Chagas 1909; Rey 2001; Lana e Tafuri 2005). A forma promastigota de Leishmania possui fagelo único, núcleo no terço médio da célula e cinetoplasto em posiçáo anterior (Michalick 2005). Estas formas presentes no hospedeiro invertebrado são englobadas por macrófagos de hospedeiros vertebrados (Michalick 2005). De acordó com Castilhos (2008), estudos envolvendo Leishmania spp apresentam o foco na forma extracelular do parásito, conhecido como promastigota, ao invés da forma amasti-gota, devido à facilidade de cultura in vitro e de não envolver outra cultura de células como ma-crófagos, por exemplo. Dessa forma, entende-se que o mesmo se pode dizer do T. cruzi e a forma epimastigota, ensaiada nesta pesquisa. Fibroblastos são células encontradas no tecido conjuntivo de mamíferos. Estas células têm sido geralmente escolhidas para realização de testes de citotoxicidade porque são de fácil manutenção e produzem resultados que apresentam alta correlação com os biológicos e ainda por estarem presentes em ferimentos, sendo o principal tipo de célula presente na regeneração (Ratner et al. 2004). Os testes de toxicidade são elaborados com os objetivos de avaliar ou prever os efeitos tóxicos nos sistemas biológicos e dimensionar a toxicidade relativa das substâncias (Forbes e Forbes, 1994). Nesse sentido, os resultados podem fornecer informações valiosas para a triagem de produtos naturais que apresentem condições de serem considerados como prováveis candidatos a fármacos. Leishmaniose e doença de Chagas são doenças cujo tratamento é feito com medicamentos considerados tóxicos, além disso, este tratamento tem sido difcultado pelo desen-volvimento da resistência pelos parasitos. A quimioresistência está muito presente em alguns países onde o fármaco não é mais utilizado com efciência e novos estudos tiveram que ser conduzidos para o entendimen-to dos mecanismos de ação e compreensão da quimioresistência (Boibessot et al. 2002). Em busca de novos fármacos, pesquisas de produtos naturais com bioatividade antipara-sitária e ausência ou uma baixa citotoxicidade vem sendo realizadas (Luize et al. 2005; Mes-quita et al. 2005; Rojas et al. 2010). Nos testes realizados, a citotoxicidade e a ati-vidade tripanocida foram realizadas concomi-tantemente, observando-se o efeito do produto natural na medida em que se diminuía a sua toxicidade em fbroblastos (Tabela 1). De uma maneira geral, tanto o extrato como a fração foram extremamente tóxicos na concentração mais elevada do produto (1000 µg/ml), sendo que a fração hexânica continuou demonstrando toxicidade máxima até a concentração de 250 µg/ml. Na concentração em que não houve citotoxicidade, o efeito antiepimastigota foi irrelevante. O extrato demonstrou uma toxicida-de menor se compararmos extrato e fração na concentração de 500 µg/ml, entretanto o efeito sobre formas epimastigotas foi abaixo de 50%. Diante dos resultados da citotoxicidade é que foram realizados os testes de suscetibilidade para a forma promastigota. Nenhuma atividade foi demonstrada pelo extrato e a fração hexânica demonstrou um efeito extremamente baixo (Tabela 2).

Tabela 1. Citotoxicidade e atividade antiepimastigota de extrato e fragáo de Lygodium venustum.

Tabela 2. Atividade antipromastigota de extrato e fragáo de Lygodium venustum.

Segundo hipóteses mais recentes, metabólitos secundários de plantas seriam formados com a função de defender a espécie de predadores. Por isso, não é surpreendente que muitas plantas acumulem substâncias de elevada toxicidade. As substâncias tóxicas em uma planta podem estar limitadas a uma estação do ano ou a certas condições ambientais, ou ainda a certas variedades ou cultivares (Simões et al. 2010). Estudos mostram que o mecanismo de ação da citotoxicidade está relacionado à capacidade destas plantas de induzir apoptopse celular (Block et al. 2004). Este foi o primeiro relato sobre a citotoxicidade da samambaia Lygodium venustum. A avaliação de sua bioatividade antiparasitária contra T. cruzi e L. brasiliensis também é pioneira na família Lygodiaceae.

CONCLUSÓES

L venustum não apresentou atividade antiparasitária clinicamente relevante na forma de extrato etanólico bruto nem como fraçáo hexánica contra Leishmania. A fraçáo hexánica apresentou urna atividade intermediária contra T. cruzi, porém a concentraçáo de efeito moderado possui citotoxicidade máxima tornando-se inviável para aplicaçáo clínica. Os compostos químicos presentes no produto natural foram incapazes de afetar as formas de protozoários em concentracóes de baixa toxicidade. Portanto, para o caso do T. cruzi, as concentraçóes em que demonstraram atividade moderada foram tóxicas sobre as células fbroblásticas e para o caso da L. brasiliensis os produtos naturais não foram ativos ñas concentraçóes não tóxicas. Entretanto, a citotoxicicidade apresentada poderá ser estudada sobre diferentes tipos de células, como por exemplo, com linhagens de células tumorais, com a fnalidade de avahar seupotencial como fonte promissora de metabólitos secundários anticancerígenos.

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