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Acta toxicológica argentina

On-line version ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. vol.21 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires July/Dec. 2013

 

ARTICULOS

Determinación de la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos de Bufo arenarum que habitan ambientes urbanizados

Determination of micronuclei frequency in erythrocytes of Bufo arenarum inhabiting urbanized environments

Caraffa, Evangelina1; Bionda, Clarisa del L.1,2; Pollo, Favio E.1,2;Salas, Nancy E.1, Martino, Adolfo L.1
1Ecología, Dpto de Cs Naturales, Fac Cs Exa Fco-Qca y Nat. Universidad Nacional de Río Cuarto. Ruta Nacional N° 36 - Km 601, (X5804BYA) Río Cuarto, Córdoba-Argentina.
2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina.

faviopollo@gmail.com

Recibido: 2 de enero de 2013 Aceptado: 20 de julio de 2013


Resumen. Los anfibios son constituyentes integrales de ecosistemas naturales y agrícolas, y debido a su sensibilidad pueden ser utilizados como bioindicadores. La frecuencia de micronúcleos se emplea como un biomarcador que evalúa la respuesta a agentes genotóxicos. El objetivo del trabajo fue determinar y comparar la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos de Bufo arenarum que habitan ambientes antrópicos de la ciudad de Río Cuarto. Se escogieron tres sitios modificados: un lago urbano Lago Villa Dálcar (33º06´S-64º22´W) y dos sitios de cultivo denominados Cultivo1 (33º05'S-64º26'W) y Cultivo 2 (33º05'S-64º25'W). Como control se escogió un área ubicada en las sierras de Comechingones, en el Campo Experimental Las Guindas (32º35'S- 64º42'W), pertenecientes a la UNRC. En cada sitio se recolectaron ocho individuos utilizando trampas de caída y relevamientos por encuentros visuales. A cada individuo se le extrajo sangre de la vena angularis inmediatamente después de la captura. Se realizaron dos extendidos por cada individuo, se dejaron secar al aire por 24 hs, luego se fijaron con metanol por 20 minutos y se colorearon con Giemsa al 5% durante 10 minutos. Posteriormente los frotis fueron analizados con microscopio (1000X) y se tomaron fotografías con cámara digital. La frecuencia de micronúcleos fue contabilizada para 4000 células por individuo. Se realizaron comparaciones utilizando el test de Kruskal-Wallis. Las frecuencias de micronúcleos encontradas son: Las Guindas: 0,17 ± 0,23; Cultivo1: 0,78 ± 0,28; Cultivo 2: 0,61 ± 0,45 y Villa Dálcar: 0,76 ± 0,47. Existen diferencias significativas entre el control y los demás sitios (p<0,01). Los resultados obtenidos demuestran la relevancia en la aplicación del test de micronúcleos in vivo en anfibios anuros para comparar distintos ambientes. Estos resultados indicarían la necesidad de nuevas investigaciones y de un monitoreo más prolongado en el tiempo para estos ambientes, incluyendo por ejemplo otros tipos de biomarcadores, así como otras posibles especies representativas de la región.

Palabras claves: Micronúcleos; Anfibios; Bufo arenarum; Agroecosistemas.

Abstract. Amphibians are integral constituents of natural and agricultural ecosystems, and because of their sensitivity can be used as bioindicators. Micronuclei test is used as a biomarker for determining the response to genotoxic agents. The purpose of this study was to determine and compare the frequency of micronuclei in peripheral blood erythrocytes of Bufo arenarum toads that inhabiting anthropic environments for the city of Rio Cuarto. Organisms used in the MN test were collected from three sites modified: an urban lakeVilla Dalcar (33º06´S-64º22´W) and two cultivation sites called Crop 1 (33º05'S-64º26'W) and Crop 2 (33º05'S-64º25'W). As a control site, an area in the mountains of Comechingones, Las Guindas (32º35'S-64º42'W), belonging to the UNRC was sampled. At each site, eight individuals were collected using pitfall traps and by visual encounter surveys. To each individual is bled from the vein angularis immediately after capture. We performed two extended for each individual, air-dried for 24 hours, then fixed with methanol for 20 minutes and stained with 5% Giemsa for 10 minutes. Then the smears were analyzed with microscope (1000X) and took pictures with digital camera. For each individual the frequency of micronuclei for 4000 cells was recorded. Comparisons were made using the Kruskal-Wallis test. Micronuclei frequencies found are: Las Guindas: 0.17± 0.23; Crop 1: 0.78 ± 0.28, Crop 2: 0.61 ± 0.45 and Villa Dalcar: 0.76 ± 0.47. There are significant differences between the control and the other sites (p< 0.01). These findings show the relevance in the application of micronucleus test in vivo for anuran amphibians to compare different environments. These results suggest the need for further research and monitoring longer time for these environments, including such other biomarkers, as well as other possible species representative of the region.

Keywords: Micronuclei; Amphibians; Bufo arenarum; Agroecosystems.


 

INTRODUCCIÓN

La agricultura es una de las perturbaciones de origen antropogénico asociado a los ambientes utilizados por los anfibios, es una de las causas principales de la disminución y modificación de los hábitats naturales, y en consecuencia, es considerada un factor relevante en la declinación registrada en los anfibios en las últimas décadas (GAA 2004; Stuart y col. 2004; Beebee y Griffiths 2005; Collins y Crump 2009; Peltzer y col. 2011). La proporción de bosques convertidos en tierras agrícolas está ocurriendo rápidamente en algunas áreas neotropicales (Pengue 2005; Rossi 2006). La modificación y destrucción del paisaje por esta actividad, es ocasionada principalmente debido a la presencia de ganado, el laboreo de la tierra para la siembra de cultivos y la incorporación excesiva de ciertos nutrientes a través de la aplicación de biocidas y fertilizantes, entre otros factores (Pengue 2005; Altieri y Pengue 2006). Los anfibios son componentes integrales de los ecosistemas naturales y agrícolas, y debido a su piel permeable y húmeda, escasa movilidad y su ciclo de vida complejo con estadios de vida acuático y terrestre, constituyen organismos sensibles a la calidad del medio ambiente y por tanto vulnerables a los contaminantes ambientales (Young y col. 2004). Numerosos trabajos realizados en condiciones de laboratorio han demostrado los efectos genotóxicos de diversos agroquímicos sobre especies de anfibios (Bly y col. 2004; Lajmanovich y col. 2005; Cabagna y col. 2006; Bosch y col. 2011). Sin embargo, pocos estudios han sido realizados con poblaciones de anfibios que habitan agroecosistemas, en los que se analizan los individuos en su ambiente natural. Este tipo de estudios suponen una visión más realista, porque contemplarían algunos fenómenos ambientales tales como la biodisponibilidad o la bioacumulación de los compuestos presentes en el ambiente en comparación con los ensayos en laboratorio (Djomo y col. 2000). Las poblaciones de anfibios que se reproducen en las charcas agrícolas pueden estar expuestos a un amplio rango de productos químicos, con diversos efectos en los individuos, tanto morfológicos como genéticos o fisiológicos (Cabagna y col. 2005; 2006; Lajmanovich y col. 2010; Peltzer y col. 2011; Bionda y col. 2012a). Para evaluar el riesgo potencial de poblaciones naturales a diferentes exposiciones ambientales, son utilizados biomarcadores (Hoffman y col. 2003). En general se distinguen tres tipos de biomarcadores: de exposición, de susceptibilidad y de efecto (Silbergeld y Davis, 1994). Entre dichos biomarcadores, uno de los más utilizados es el test de micronúcleos, el cual constituye un biomarcador de efecto temprano de daño genético tanto en humanos (Lucero y col. 2000; Zalacain y col. 2005), como en plantas y animales (Djomo y col. 2000; Palma Acuña 2005; Junín y col. 2008; Arslan y col. 2009; Pollo y col. 2012). En este sentido, los agroquímicos pueden producir daño cromosómico mediante la formación clastogénica o aneugénica de micronúcleos (Bly y col. 2004; Lajmanovich y col. 2005; Cabagna y col. 2011). Por tal motivo, el objetivo del presente trabajo fue determinar y comparar la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos de Bufoarenarum que habitan ambientes con distinto grado de alteración ambiental de la ciudad de Río Cuarto, Córdoba.

MATERIAL Y MÉTODOS

Áreas de estudio

La Ciudad de Río Cuarto se ubica en una zona agrícola-ganadera. Se escogieron cuatro sitios, tres de ellos constituyen ambientes urbanos y periurbanos con distintos tipos y grados de alteración ambiental. La importancia en la selección de dichos ambientes para el presente estudio, se basa en los antecedentes de estudios previos sobre modificaciones en los parámetros poblacionales en distintas especies de anfibios, así como cambios en las propiedades de las comunidades, posiblemente por el grado de alteración ambiental (Bionda y col. 2011a, 2011b; Bionda y col. 2012a, 2012b; Pollo y col. 2012; Bionda y col. 2013). Uno de los sitios es un lago urbano, Lago Villa Dálcar (S 33°07' - W 64°20'), este constituye un ambiente artificial de aproximadamente 8 ha, rodeado por residencias (Mancini y col. 2012; Pollo y col. 2012). Dos sitios de cultivos ubicados en los alrededores de la ciudad y que se encuentran rodeados de una matriz agrícola, principalmente por cultivos de soja (Glicine max Merril L). Uno de los cultivos fue denominado Cultivo 1 (S 33°05' - W 64°26') que cuenta con 9 ha y presenta cultivos a escasos metros del cuerpo de agua (15 m aproximadamente); y un Cultivo 2 (S 33°05' - W 64°25') de 5 ha que no presenta un cultivo cercano a los cuerpos de agua pero existen cultivos aledaños y recibe correntías de agua proveniente de éstos. En ambos cultivos existe además la práctica ganadera. El último sitio, utilizado como control, es un área ubicada en las sierras de Comechingones, Campo Experimental Las Guindas (S 32°04› - W 64°42›), perteneciente a la Universidad Nacional de Río Cuarto, cuenta con 1.200 ha y está ubicado a 90 kilómetros al noroeste de la ciudad de Río Cuarto. La región en la que se encuentra ubicado este ambiente presenta un 95,8% de géneros florísticos autóctonos, siendo considerada un área poco alterada (Natale, 1999; Vischi y col. 1999). De este modo, en un gradiente de mayor a menor alteración, ubicaríamos a los sitios Cultivo 1 y Cultivo 2 con mayor grado, asociado a la práctica agrícola-ganadera; el sitio Lago Villa Dálcar con una alteración media y de características urbanísticas; y por último el sitio Las Guindas, con escaso grado de alteración.

Metodología de campo y laboratorio

La especie Bufo arenarum tiene una distribución neotropical (Frost 2009). En Argentina presenta una amplia distribución, siendo encontrado en una variedad de hábitats, incluyendo ambientes costeros, zonas rurales o urbanas (Lajmanovich y col. 2010). Los individuos son principalmente más activos en los meses de octubre-diciembre, es decir, durante la primavera y el comienzo del verano (Bionda 2011). Debido a su amplia distribución y abundancia, esta especie es usada ampliamente para estudios ecológicos, fisiológicos, anatómicos y toxicológicos (Cabagna y col. 2005; Brodeur y col. 2008; Lajmanovich y col. 2010; Bionda y col. 2011a; 2012a, 2012b).

La captura de los ejemplares fue hecha a través de trampas de caída y relevamientos por encuentros visuales (Heyer y col. 1994). Se colectaron ocho individuos machos adultos por sitio, entre septiembre y diciembre de 2010. A cada individuo se le extrajo sangre de la vena angularis inmediatamente después de la captura (Nöller 1959). Se realizaron dos extendidos por cada individuo, se dejaron secar al aire por 24 hs, luego se fijaron con metanol por 20 minutos y se colorearon con Giemsa al 5% durante 10 minutos (Junín y col. 2008). La frecuencia de aparición de micronúcleos se cuantificó para 4000 células por individuo, utilizando un microscopio Carl Zeiss trinocular Primo Star (Pack 5).Se tomaron fotografías con cámara Canon Power Shot G10 14.7 Megapixeles utilizando el Software AxioVision CARL ZEISS Versión 4.3. Existen ciertos criterios para el reconocimiento de micronúcleos: el diámetro del micronúcleo debe oscilar entre 1/16 y 1/3 del diámetro del núcleo principal y debe estar separado de éste, debe haber una identificación clara del límite nuclear, no debe ser más refractivo y debe tener un color e intensidad como la del núcleo principal o mayor, su forma puede ser esférica u oval y debe estar incluido en el citoplasma celular (Schmid 1975; Fenech 2000; Zalacain y col. 2005). Se utilizó un análisis Kruskal-Wallis para corroborar si existían diferencias en la frecuencia de micronúcleos entre sitios.

RESULTADOS

En la Tabla 1 se indican las medias y desvíos estándar registrados en la frecuencia de micronúcleos para cada uno de los sitios estudiados. Hay diferencias estadísticamente significativas entre los sitios en las frecuencias de micronúcleos (Kruskall-Wallis, p = 0,0023). La frecuencia de micronúcleos registrada en los individuos capturados en el sitio control Las Guindas son menores a las registradas en los restantes sitios. Además en el sitio control se encontraron eritrocitos en división en el 37,5% de los individuos. Entre los sitios modificados se registra una frecuencia de micronúcleos semejante, sin embargo, está es algo mayor en los sitios Cultivo 1 y Lago Villa Dálcar, seguido por el Cultivo 2. En la Figura 1 se muestran fotos de micronúcleos registrados en los distintos ambientes y los eritrocitos en división pertenecientes a los individuos del sitio Las Guindas.

Tabla 1. Frecuencia de micronúcleos en B. arenarum para los cuatro sitios de muestreo.


Figura 1. Micronúcleos registrados en individuos de: a) y b) Villa Dálcar; c) Las Guindas; d) Cultivo 1; e) Cultivo 2 y f) Células en división en individuos de Las Guindas.

DISCUSIÓN

La frecuencia de micronúcleos es un biomarcador de efecto, que puede reflejar la exposición temprana a un contaminante (Bly y col. 2004). Por tal motivo, los estudios realizados en poblaciones que habitan ambientes con distintos tipos de alteraciones (agrícolas y urbanas) son útiles para conocer la relación entre los organismos y su medio y, con ello, la salud del ambiente (Hoffman y col. 2003). Los resultados muestran que el número de micronúcleos encontrado en los individuos de los sitios alterados (Lago Villa Dálcar, Cultivo 1 y Cultivo 2; ver Tabla 1) es mayor al registrado en el sitio control (0,17 ± 0,23; Tabla 1) y al propuesto como número basal para la especie (0,30 ± 0,09) (Bosch y col. 2011). De esta manera, los resultados obtenidos podrían indicarnos que existiría cierto grado de inestabilidad genética en las poblaciones de B. arenarum presentes en los sitios analizados, y que estos ambientes representarían un ambiente hostil para las poblaciones que allí habitan.

El lago Villa Dálcar se encuentra dentro del ejido urbano de la ciudad y constituye una importante área de recreación y pesca. En los últimos años se han registrado episodios de contaminación por escorrentías provenientes de campos cultivados (Mancini y col. 2000), como también un afloramiento algal (Novoa 2006) e inestabilidad genética en poblaciones de peces (Pollo y col. 2012). Recientemente, un estudio realizado por Bionda y col. (2012b) con poblaciones de B. arenarum ha demostrado una frecuencia alta de individuos con anormalidades morfológicas. De esta manera, con los resultados obtenidos en el presente estudio sumado a las observaciones realizadas en los estudios de anormalidades morfológicas por Bionda y col. (2012b) y considerando la importancia socioeconómica del lago, se podrían plantear serios cuestionamientos sobre la salud y calidad de este ambiente, y la necesidad de un monitoreo exhaustivo. Por su parte, los sitios Cultivo 1 y Cultivo 2, también mostraron una frecuencia de micronúcleos considerablemente más alta a la registrada en el sitio control, y a la considerada basal para la especie. El hecho de que estos ambientes se encuentren rodeados de una matriz agrícola, supone un grado de alteración y posible degradación ambiental. Estudios realizados sobre la ecología y demografía de poblaciones de B. arenarum y otras especies de anfibios, también han mostrado indicios de una posible degradación ambiental en dichos cultivos (Bionda y col. 2011a; 2011b; 2012a). Estos resultados indicarían la necesidad de nuevas investigaciones sobre aspectos ecotoxicológicos y de un monitoreo más prolongado en el tiempo para estos ambientes, incluyendo, por ejemplo, otros tipos de biomarcadores, así como otras posibles especies representativas de la región.

Finalmente, el presente trabajo permitió ampliar el conocimiento sobre esta especie y sus efectos poblacionales por habitar ambientes antropizados. Además, los estudios con una especie como B. arenarum, la cual presenta una amplia distribución y es registrada en una variedad de ambientes, brindarían una herramienta eficaz para medir la calidad de distintos ambientes.

Agradecimientos: este trabajo fue realizado con el financiamiento del programa PPI 18/C416 de la Secretaría de Ciencia y Técnica (SECyT) de la Universidad Nacional de Río Cuarto.

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