SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.22 número2Análise preliminar da citotoxicidade dos aditivos alimentares urucum e cúrcumaOptimización en la recuperación de inmunoglobulinas, como molécula entera y fragmento F(ab´)2, en la producción de antivenenos índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

Compartir


Acta toxicológica argentina

versión On-line ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. vol.22 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires set. 2014

 

ARTÍCULOS

Avaliação da atividade citotóxica e potencial antiparasitário in vitro do a-pineno e carvacrol

Cytotoxic and antiparasitic in vitro activities of a-pinene and carvacrol

 

Sobral-Souza, Celestina E.1; Leite, Nadghia F.1; Brito, Dara I.V.1; Lavor Anne K.L.S.1; Alencar, Liscássia B.B.1; Albuquerque, Rosimeire S.1; Ferreira, João Victor A.1; Freitas, Maria A.1; Matias, Edinardo F.F.1; Andrade, Jacqueline C.1; Tintino, Saulo R.1; Morais-Braga, Maria F.B.1; Vega, Celeste.2; Coutinho, Henrique D.M.1*

1Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular da Universidade Regional do Cariri.
2Centro para el Desarrollo de la Investigación Científica (CEDIC), Fundación Moisés Bertoni/Laboratorios Díaz Gill. Asunción-Paraguay.

*hdmcoutinho@gmail.com

Recibido: 3 de abril de 2013
Aceptado: 9 de noviembre de 2013

 


Resumo. A leishmaniose e a doença de Chagas tem sido um grande desafio, no que diz respeito à sua terapêutica. Devido à grande dificuldade de encontrar fármacos que garantam uma ação terapêutica eficiente e menos agressora à espécie humana, diferentes produtos naturais vêm sendo testados. Muitas espécies vegetais foram investigadas quanto à sua ação leishmanicida e tripanocida na expectativa de que seus compostos metabólicos possuam atividade antiparasitária e ausência ou baixa citotoxicidade. Neste estudo sobre bioatividade do a-pineno e carvacrol, avaliaram-se os potenciais leishmanicida e tripanocida. O carvacrol apresentou um percentual de inibição de 38,34% e 74,12% para as formas promastigotas e epimastigotas respectivamente, na concentração de 100µg/mL, apresentando uma citotoxicidade de 21,62%. O a-pineno apresentou 100% e 5,30% de inibição para as formas epimastigota e promastigota na concentração de 100 µg/mL, com citotoxicidade de 87,88%.

Palavras-chave: Atividade leishmanicida; Atividade tripanocida; Citotoxicidade; a-pineno.

Abstract. Leishmaniasis and Chagas Disease represent a great challenge against the modern therapeutics. Due the high difficult to find new drugs with therapeutic efficacy and low toxicity, several natural products had been screened. Many species of plants were investigated about their leishmanicidal and trypanocidal activities. Some phytocompounds are the a-pinene and carvacrol. In this work, we evaluated the bioactivities of a-pinene and carvacrol against Trypanosoma cruzi and Leishmania braziliensis cell lines. The carvacrol inhibited 38,34% and 74,12% of the promatigote and epimastigote forms, respectively at 100 µg/mL, showing a low cytotoxic activity (21,62%). The O a-pinene inhibited 100% and 5,30% against the epimastigote and promastigote forms respectively, at 100 µg/mL, showing a higher cytotoxic activity (87,88%).

Keywords: Leishmanicidal activity; Trypanocidal activity; Cytotoxic activity; a-pinene.


 

Introdução

Doenças parasitárias são de elevada incidência em países em desenvolvimento, a leishmaniose e doença de Chagas tem sido um grande desafio, no que diz respeito à sua terapêutica, pois além de tais doenças não despertarem o interesse das indústrias farmacêuticas, as drogas existentes para seus tratamentos apresentam elevada toxicidade (WHO 2003; MS 2010).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a tripanossomíase e a leishmaniose, estão entre as doenças infecto-parasitárias que mais preocupam os órgãos de saúde pública, pela frequência, e principalmente pelas dificuldades terapêuticas, deformidades e sequelas que podem acarretar (WHO 2004).

As leishmanioses são um grupo de doenças, causadas por protozoários parasitas pertencentes ao gênero Leishmania (Ordem Kinetoplastida, Trypanosomatidae). São transmitidos ao homem e a outros mamíferos através da picada da fêmea do inseto Lutzomyia spp na América do Sul, enquanto que no Velho mundo, a transmissão é feita através de mosquitos de gênero Phlebotomus. A doença se apresenta de diversas formas clinicas, podendo acometer a pele, as mucosas e as vísceras. No Brasil, existem sete espécies distintas do parasito sendo que, destas, seis (L. braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, L. lansoni, L. shawii, L. naiffi) são responsáveis pela leishmaniose cutânea e mucocutânea (LMC) - sendo essas formas compreendidas como Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) - e uma espécie (L. chagasi) responsável pela leishmaniose visceral (Genaro e Reis 2005; Morais-Braga et al. 2013; Santos et al. 2013).

A doença de Chagas afeta principalmente pessoas pobres nos países em desenvolvimento, devido às condições saneamento básico e higienização. Pouco tem sido investido em diagnóstico e tratamento - apesar de uma intensa pesquisa sobre a doença (Morais-Braga et al. 2013; Santos et al. 2013). Estima-se que cerca de 10 milhões de pessoas estão infectadas com Chagas nas Américas, 2 milhões delas só no Brasil. Mais de 10.000 morrem a cada ano como resultado. A vigilância constante é necessária para lidar com a doença de Chagas: controle do vetor, a melhoria da habitação, acessíveis cuidados médicos, sangue-seleção de programas, e no tratamento de indivíduos já infectados (WHO 2010). A transmissão da doença de Chagas por rotas alternativas, como a ingestão de alimentos contaminados, vem ganhando espaço como preocupação em saúde pública (IOC 2011).

Devido à grande dificuldade de encontrar fármacos que garantam uma ação terapêutica eficiente e menos tóxica ao hospedeiro, diferentes produtos naturais vêm sendo estudados. Muitas espécies vegetais foram investigadas quanto à sua ação leishmanicida e tripanocida (Ruiz et al. 2004; Mesquita et al. 2005) na expectativa de que seus compostos metabólicos possuam atividade antiparasitária e ausência ou baixa citotoxicidade. Substâncias isoladas também são objetos de estudo de pesquisadores que buscam descobrir novos agentes terapêuticos para o tratamento destas doenças (Coro et al. 2005; Saraiva et al. 2005; Roldos et al. 2008).

O carvacrol é um dos componentes mais comuns de óleos essenciais, tendo sido aprovado como um seguro aditivo alimentar nos EUA e Europa (CEC 1999; CFSAN 2006). O carvacrol é eficaz contra bactérias, leveduras, fungos, insetos e ácaros (Dorman e Deans 2000; Bem Chami et al. 2005; Arfa et al. 2006; Jeong et al. 2008; Kordali et al. 2008).

O a-pineno, presente em alguns óleos essenciais, apresenta atividade larvicida, detergente, inseticida (Simas et al. 2004), assim como propriedades atrativas para insetos. Este estudo foi realizado com o objetivo de avaliar o potencial antiparasitário in vitro de terpenóides componentes de óleos essenciais, o a-pineno e carvacrol, contra as formas epimastigota e promastigota de T. cruzi e L. brasiliensis, bem como verificar sua citotoxicidade em células de mamíferos.

Materiais e métodos

Linhagens celulares utilizadas

Nos testes in vitro de T. cruzi, foi utilizado o clone CL-B5 (Le Senne et al. 2002). Os parasitas, transfectados de forma estável com o gene para a ß-galactosidase de Escherichia coli (lacZ), foram fornecidos pelo Dr. F. Buckner através do Instituto Conmemorativo Gorgas (Panama). As formas epimastigotas foram cultivadas a 28ºC em Meio de cultura Liver Infusion Tryptose Broth (Difco, Detroit, MI), suplementado com Soro Fetal Bovino 10% (SFB) (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina (Ern, S.A., Barcelona, Spain) e estreptomicina (Reig Jofr´e S.A., Barcelona, Spain) (Roldos et al. 2008). As células foram coletadas para os testes na fase exponencial de seu crescimento.

Culturas de Leishmania spp. foram obtidas do Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Asunción, Paraguay - IICS e identificadas por análise isoenzimática. A manutenção das linhagens, forma de cultivo e isolamento das formas promastigotas de Leishmania spp. Seguiram os procedimentos descritos por Roldos et al. (2008). Os ensaios de inibição das formas promastigotas foram realizados utilizando a linhagem de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), cultivada a 22°C em meio Schneider’s Drosophila, suplementado com SFB 20 %.

Os ensaios de citotoxicidade utilizaram a linhagem de fibroblastos NCTC929, cultivada em Minimal Essential Medium (Sigma). O meio de cultura foi suplementado com SFB inativada por calor (10 %), penicilina G (100 U/ml) e estreptomicina (100 mg/ml). As culturas foram mantidas a 37ºC em atmosfera úmida com 5 % de CO2. A viabilidade destas linhagens foi avaliada através do uso da resazurina como método colorimétrico (Martins et al. 2009).

Reagentes

Resazurina sódica foi obtida da Sigma-Aldrich (St Louis, MO) e estocada a 4ºC ao abrigo da luz. A solução de resazurina foi preparada com tampão fosfato 1 %, pH 7 e esterilizada por filtração antes de ser utilizada. O Clorofenol vermelho-ß-D-galactopiranosídio (CPRG; Roche, Indianapolis, IN) foi dissolvido em uma solução de Triton X-100 0,9 % (pH 7,4). Penicilina G (Ern, S.A., Barcelona, Spain), estreptomicina (Reig Jofre S.A., Barcelona, Spain) e Dimetilsulfóxido (DMSO) também foram utilizados.

Teste de atividade antiepimastigota

O teste foi realizado em microplacas com 96 cavidades, com culturas na fase exponencial. Epimastigotas foram inoculados em uma concentração de 1 x 105 mL-1 em 200 µl de Liver Tryptose Broth (LT) medium. As placas foram então incubadas com as drogas nas concentrações de 100 e 500 µg/ml a 28°C por 72 h. Após este tempo, foram adicionados 50 µl da solução de CPRG, de forma a atingir uma concentração final de 200 µM. As placas foram incubadas por um tempo adicional de 6 h a 37ºC e foram submetidas a visualização sob 595 nm. Cada experimento foi realizado duas vezes e de forma independente, tendo sido cada concentração testada em triplicata em cada experimento. A eficiência de cada composto foi estimada através do cálculo do percentual de atividade anti-epimastigota (AE%).

Teste de atividade anti-promastigota

Culturas de formas promastigotas de L. braziliensis foram cultivadas até uma concentração de 106 células/ml e então transferidas para o teste. Os compostos foram dissolvidos em DMSO até as concentrações a serem testadas e foram transferidos para as microplacas. Cada ensaio foi realizado em triplicata. A atividade dos compostos foi avaliada após 72h por contagem direta das células após diluições seriais e comparadas com um controle não tratado.

Teste de citotoxicidade

Fibroblastos NCTC929 foram plaqueados em microplacas de 96 cavidades a uma concentração final de 3 x 104 células/cavidade. As células foram cultivadas a 37°C em atmosfera com 5 % de CO2. Após isso, o meio de cultura foi removido e os compostos foram adicionados a 200 µl, sendo realizado um novo cultivo por 24 h. Após esta incubação, 20 µl de uma solução de resazurina 2 mM foi adicionada em cada cavidade. As placas foram incubadas por 3 h e a redução da resazurina foi determinada através de dupla absorbância nos comprimentos de onda de 490 e 595 nm. O valor do controle (branco) foi subtraído. Cada concentração foi testada em triplicata.

Resultados

De acordo com os resultados da tabela 1, o a-pineno apresentou uma baixa citotoxicidade na concentração de 50 µg/ml, já o carvacrol não demonstrou citotoxicidade na mesma concentração.

Tabela 1. Atividade antiepimastigota T. cruzi, atividade antipromastigota L. brasiliensis e citotoxicidade.

Na avaliação da atividade antiparasitária, a-pineno apresentou 100 % de inibição em L. braziliensis na concentração de 100 µg/ml, dado importante visto que uma inibição neste nível é considerada clinicamente relevante. Em relação a T.cruzi a inibição foi de 5,30 % apresentando uma citotoxicidade de 87,88 %.

Já o carvacrol apresentou 38,34 % e 74,12 % de inibição em T. cruzi e L. braziliensis respectivamente, em 100 µg/ml.

Discussão

O parâmetro mais utilizado para avaliar a citotoxicidade é a viabilidade celular, que pode ser evidenciada pela técnica de corantes vitais como o vermelho neutro, que possibilita a distinção entre células vivas e danificadas ou mortas (Sülsen et al. 2007). Neste estudo, a verificação da viabilidade celular foi realizada usando o corante resazurina.

Segundo o Órgão Internacional de Padronização (International Standard Organization), ISO 10993, o ensaio de citotoxicidade in vitro é o primeiro teste para avaliar os efeitos tóxicos em modelos animais, depois de comprovada a sua não toxicidade o estudo pode ter continuidade realizando-se os ensaios necessários em animais de laboratório (Rogero et al. 2003).

Os resultados mostraram que o carvacrol não apresentou citotoxicidade na concentração de 50 µg/ml, para essa mesma concentração o a-pineno demonstrou uma baixa citotoxicidade e uma eliminação de 91,76 % da forma epimastigota. Contudo, mais estudos com o carvacrol, principalmente ampliando as faixas de concentrações testadas são necessários antes de realizar testes in vivo.

Atualmente as drogas utilizadas para parasitos como T. cruzi e L. braziliensis apresenta uma alta toxicidade porque metabólitos produzidos comprometem tecidos do hospedeiro devido a sua alta reatividade (Dias et al. 2009).

Os resultados obtidos indicam que o a-pineno e o carvacrol foram eficazes contra as cepas de parasitos testadas apresentando uma fonte alternativa de produtos naturais com atividade contra L. brasiliensis. Em se tratando da citotoxicidade novos testes devem ser realizados já que os níveis foram elevados, viabilizando futuros ensaios in vivo.

Referências

1. Ben Arfa A., Combes S., Preziosi-Belloy L., Gontard N., Chalier P. Antimicrobial activity of carvacrol related to its chemical structure. Lett Appl Microbiol. 2006;43:149-154.         [ Links ]

2. Center for Food Safety and Applied Nutrition. 2006. EAFUS: a Food Additive Database. Washington, DC: US Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition, 2006.         [ Links ]

3. Chami N., Bennis S., Chami F., Aboussekhra A., Remmal A. Study of anticandidal activity of carvacrol and eugenol in vitro and in vivo. Oral Microbiol Immunol. 2005;20:106-111. Commission of the European Communities.         [ Links ]

4. Commission Decision of 23 February 1999 Adopting a Register of Flavouring Substances Used in or on Foodstuffs Drawn Up in Application of Regulation (EC) No. 2232-2296,1999.         [ Links ]

5. Coro J., Pérez R., Rodríguez H., Suárez M., Veja C., Rolón M., Montero D., Nogalc J.J., Gomez-Barrio A. Synthesis and antiprotozoan evaluation of new alkyl-linked bis(2-thioxo-[1,3,5]thiadiazinan-3-yl) carboxylic acids. Bioorganic & Medicinal Chemi. 2005;13:3413-3421.

6. Dias L.C., Dessoy M.A., Silva J.J.N., Thiemann O.H., Oliva G., Andricopulo A.D. Chemotherapy of Chagas’ Disease: State of the art and perspectives for the development of new drugs. Quim Nova. 2009;32:2444-2457.         [ Links ]

7. Dorman H.J.D., Deans S.G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol. 2000;88:308-316.         [ Links ]

8. Genaro O., Reis A.B. Leishmaniose Tegumentar Americana. In: Neves D. P., editor. Parasitologia Humana. São Paulo: Atheneu; 2005, p. 47-66.         [ Links ]

9. Instituto Oswaldo Cruz (IOC). Desafios contemporâneos da doença de Chagas na Amazônia. on-line Acessado em 23/novembro/2011.Disponível em: http://www.fiocruz.br/ioc/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=1341&sid=32        [ Links ]

10. Jeong E.Y., Lim J.H., Kim H.G., Lee H.S. Acaricidal activity of Thymus vulgaris oil and its main components against Tyrophagus putrescentiae, a stored food mite. J Food Prot. 2008;71:351-355.         [ Links ]

11. Kordali S., Cakir A., Ozer H., Cakmakci R., Kesdek M., Mete, E. Antifungal, phytotoxic and insecticidal properties of essential oil isolated from Turkish Origanum acutidens and its three components, carvacrol, thymol and p-cymene. Bioresour Technol. 2008;99:8788-8795.         [ Links ]

12. Le Senne A., Muelas-Serrano S., Fernandez-Portillo C., Escario J.Á., Gómez-Barrio A. Biological characterization of a beta-galactosidase expressing clone of Trypanosoma cruzi CL strain. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002;97:1101-1105.         [ Links ]

13. Martins M.D., Marques M.M., Bussadori S.K., Mesquita-Ferrari R.A., Pavesi V.C.S., Wadt N.S., Fernandes K.P. Citotoxicidade in vitro de extratos de arnica brasileira (Solidago microglossa) e arnica paulista (Porophyllum ruderale). ConScientiae Saúde. 2009;8:99-104.         [ Links ]

14. Mesquita M.L. de, Desrivot J., Bories C., Fournet A., Paula J.E., Grellier P., Espindola L.S. Antileishmanial and trypanocidal activity of Brazilian Cerrado plants. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100(7):783-787.         [ Links ]

15. Ministério da Saúde do Brasil. Doenças negligenciadas: estratégias do Ministério da Saúde. Texto de difusão técnico-científico do Ministério da Saúde. Rev. Saúde Pública. 2010; 44:200-202.         [ Links ]

16. Morais-Braga M.F.B., Souza T.M., Santos K.K.A., Guedes G.M.M., Andrade J.C., Vega C., Rolón M., Costa J.G.M., Saraiva A.A.F., Coutinho H.D.M. Phenol composition, cytotoxic and anti-kinetoplastidae activities of Lygodium venustum SW. (Lygodiaceae). Experimental Parasitology, 2013;134:178-182.         [ Links ]

17. Rogero S.O., Lugão A.B., Ikeda T.I., Cruz A.S. Teste in vitro de Citotoxicidade: Estudo Comparativo entre duas Metodologias. Materials Research, 2003;6:317-20.         [ Links ]

18. Roldos V., Nakayama H. Rolón M., Montero-Torres A., Trucco F., Torres S. Veja, C., Marrero-Ponce Y., Heguaburu V., Yaluff G., Gómez-Barrio A., Sanabria L., Ferreira M.E., Arias A.R., Pandolfi E. Activity of a hydroxybibenzyl bryophyte constituent against Leishmania spp. and Trypanosoma cruzi: In silico, in vitro and in vivo activity studies. J Med Chem. 2008;43:1797-1807.         [ Links ]

19. Ruiz P.G., Garavito G., Acebey C.L., Arteaga L., Pinzon R., Gimenez T.A. Actividad Leishmanicida y Tripanocida de algunas plantas reportadas como medicinales en Colombia. Biofarbo. 2004;13:27-32.         [ Links ]

20. Santos K.K.A., Rolón M., Vega C., Rojas de Arias A., Costa J.G.M., Coutinho H.D.M. Atividade leishmanicida in vitro de Eugenia uniflora e Momordica charantia. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. 2013;34:47-50.         [ Links ]

21. Saraiva J., Vega C., Rolon M., Silva R., Silva M., Donato P., Bastos J., Gomez-Bairro A., Albuquerque S. In vitro and in vivo activity of lignan lactones derivatives against Trypanosoma cruzi. Parasitology Res. 2007;100:791-795.         [ Links ]

22. Simas N.K., Lima E.C., Conceição S.R., Kuster R.M., Oliveira-Filho A.M. Produtos naturais para o controle da transmissão da dengue - atividade larvicida de Myroxylon balsamum (óleo vermelho) e de terpenóides e fenilpropanóides. Quim Nova. 2004;27:46-49.         [ Links ]

23. Sülsen V.P., Cazorla S.I., Frank F.M., Redko F.C., Anesini C.A., Coussio D.J., Malchiodi E.L., Martino V.S., Muschietti L.V. Trypanocidal and Leishmanicidal Activities of Flavonoids from Argentine Medicinal Plants. Am J Trop Med Hyg. 2007;77:654-659.         [ Links ]

24. World Health Organization (WHO). 2004. Communicable Disease Surveillance and Responce. on-line. Acessado em 20 janeiro de 2004. Disponível em: http://www.who.int/emc/diseases/leish/leisgeo1.html.         [ Links ]

25. World Health Organization (WHO). International Workshop, Intensified control of neglected diseases, Summary Report, 10-12 on-line. Acessado em 09 Dezembro de 2003. Disponível em: http://whqlibdoc.who.int/hq/2004/WHO_CDS_CPE_CEE_2004.45.pdf

26. World Health Organization (WHO). Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases. on-line. Acesso em: 20 de julho 2010. Disponível em: http://www.who.int/neglected_diseases/2010report/NTD_2010report_embargoed.pdf         [ Links ]

Creative Commons License Todo el contenido de esta revista, excepto dónde está identificado, está bajo una Licencia Creative Commons