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Acta toxicológica argentina

On-line version ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. vol.22 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires Sept. 2014

 

ARTÍCULOS

Optimización en la recuperación de inmunoglobulinas, como molécula entera y fragmento F(ab´)2, en la producción de antivenenos

Optimization in the immunoglobulins recovery, as whole molecule and F(ab´)2 fragment, in the antivenim production

 

Litwin, Silvana1*; Isabettini, Alberto Oscar1; Calderón, Leandro2; Varni, Liliana Mónica1

1Servicio Sueros Terapéuticos. Instituto Nacional de Producción de Biológicos - Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán”. Vélez Sarsfield 563. CP 1281. Ciudad Autónoma de Buenos Aires.Argentina.
2Laboratorio de Control de Biológicos. Instituto Nacional de Producción de Biológicos - Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán”. Vélez Sarsfield 563. CP 1281. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina.

Recibido: 22 de noviembre de 2013
Aceptado: 14 de diciembre de 2013

 


Resumen. En la actualidad se utilizan, principalmente, dos métodos de purificación de anticuerpos a partir de plasmas equinos hiperinmunes para la producción de antivenenos a nivel industrial, obteniéndose preparaciones enriquecidas en moléculas de inmunoglobulinas G ó fragmentos F(ab´)2. Con ambos métodos, luego de la precipitación, se observa una importante pérdida de capacidad neutralizante en comparación con la capacidad neutralizante de los plasmas de partida. En este trabajo, se realizó el fraccionamiento de plasmas equinos hiperinmunes utilizando ácido caprílico con y sin digestión enzimática con pepsina. El objetivo del trabajo fue dar a conocer la proporción de recuperación de la capacidad neutralizante luego del fraccionamiento; resultando ésta menor cuando el plasma se trató enzimáticamente. Adicionalmente, se propuso establecer cuál sería la etapa responsable de la diferencia en la recuperación de anticuerpos entre una metodología y otra.
Cuando se purificaron las inmunoglobulinas enteras, se recuperó aproximadamente un 53% de la capacidad neutralizante mientras que cuando la muestra se purificó luego de ser tratada enzimáticamente, se obtuvo alrededor del 30% de esa actividad. Una relación de similar magnitud se verifica en la recuperación de la masa de proteínas solubles luego de remover los contaminantes, entre una metodología y otra. La insolubilización del fragmento Fc generado durante la digestión sería el responsable de esa pérdida adicional de proteína y capacidad neutralizante.

Palabras clave: Antiveneno; Recuperación; Ácido caprílico; Inmunoglobulina

Abstract. Today two methods are mainly used for the purification of antibodies from hyperimmune equine plasma at industrial level obtaining enriched preparations of immunoglobulin G (IgG) molecules or F(ab´)2 fragments.
In both methods, after the precipitation, an important loss in the neutralizing capability was observed compared to the one of the original plasma. In this work, we performed the fractionation of hyperimmune equine plasma using caprylic acid, with and without enzymatic digestion with pepsin. The aim was to explain the percentage of recovery of the neutralizing capability after the fractionation; which resulted minor when the plasma was enzymatically treated. Additionally, we intended to establish which stage, in the purification process, was the responsible for the difference in the antibody recovery between one methodology and the other. When entire immunoglobulins were purified, approximately 53% of the neutralizing capacity was recovered, but when the sample was purified after the enzymatic treatment, around the 30% of the activity was obtained.
A ratio of similar magnitude is verified on the recovery of the soluble protein mass after the removal of contaminants, between the two methods.
The insolubilization of the fragment Fc generated during digestion would be responsible for the additional loss of protein and neutralizing capacity.

Key words: Antivenom; Recovery; Caprylic acid; Immunoglobulin


 

Introducción

En ciertas regiones del mundo, los accidentes provocados por la mordedura de serpientes venenosas son muy frecuentes y causan un alto número de muertes y discapacidades físicas (Theakston y col. 2003).

Desde hace más de un siglo, la utilización de antivenenos se ha constituido como el único tratamiento efectivo contra las mordeduras de serpientes y otros animales venenosos (Calmette 1894; Chaippaux y Goyffon 1998; Theakston y col. 2003).

El animal de elección para la producción de antivenenos ofídicos y aracnídicos fue y es el caballo. En estos animales, las inmunoglobulinas G que se observan mayormente en animales hiperinmunizados son del isotipo IgG(T), las cuales están altamente glicosiladas y presentan más inmunogenicidad que otros isotipos (Theakston y col. 2003; Sjostrom y col. 1994).

En sus inicios, para los tratamientos contra mordeduras de serpientes, se utilizaba el suero completo proveniente de equinos hiperinmunes (Calmette 1894). Este suero era eficaz en su capacidad terapéutica pero generaba un alto número de reacciones adversas, tales como reacciones de hipersensibilidad inmediata (anafilaxia) en individuos alérgicos e hipersensibilidad tardía (enfermedad del suero) así como reacciones anafilactoideas debido a la alta concentración de proteínas heterólogas.

Años más adelante, con el objeto de disminuir estas reacciones, el suero fue sufriendo otro tipo de procesos con los cuales se lograba la eliminación de albúmina, globulinas no inmunes y otras proteínas del suero, quedando así, como agente terapéutico la molécula de inmunoglobulina G (IgG) purificada. Más recientemente, se dio a conocer que estas inmunoglobulinas podían ser tratadas química o enzimáticamente con el objeto de disminuir la ocurrencia de reacciones adversas (de Roodt y col. 2009).

La digestión enzimática puede realizarse con la utilización de papaína o pepsina. Con la primera se obtienen fragmentos Fab mientras que con la segunda, se obtienen fragmentos F(ab´)2. La pepsina es una enzima de 35 kDa que preferentemente cliva las uniones C-terminal de Phe, Leu y Glu. Su actividad óptima se encuentra en valores de pH de 2 a 4, y es irreversiblemente inactivada a pHs mayores de 6 (Harlow y Lane 1988).

Uno de los métodos de fraccionamiento más utilizados es el basado en los desarrollos de Pope (1938; 1939 a; 1939 b) y Harms (1948) en los cuales se logra la obtención de fragmentos F(ab´)2 por digestión enzimática de las IgG y su posterior fraccionamiento del plasma equino hiperinmune, utilizando sulfato de amonio.

Otro método utilizado para el fraccionamiento de plasma equino hiperinmune, más recientemente adoptado por algunos países, es el de la precipitación diferencial de proteínas plasmáticas no inmunoglobulínicas mediante el agregado de ácidos grasos de cadena corta (Steinbush y Adruan 1969), siendo el ácido caprílico el de elección. Por esta técnica se obtienen, a partir de plasma equino hiperinmune, moléculas de IgG de alta pureza.

Algunos autores han estudiado la optimización de las condiciones físico-químicas (pH, concentración de ácido caprílico agregado y tiempo de agitación) durante la etapa de precipitación del plasma equino hiperinmune, de manera de obtener un filtrado altamente enriquecido en inmunoglobulinas (Rojas y col. 1994; Nudel y col. 2012). Morais y Massaldi (2012) han reportado que el efecto del ácido caprílico es debido a una interacción directa, a través de sitios específicos, con la proteína que precipita. Se genera así una superficie altamente hidrofóbica en la proteína, disminuyendo la interacción con el agua del medio y la solvatación que lo mantiene soluble. Por esto, se produce un aumento de la interacción proteína-proteína, causando asociación y precipitación de los complejos macromoleculares.

En comparación con los antivenenos obtenidos mediante precipitación con sulfato de amonio, se ha observado que aquellos fraccionados con ácido caprílico fueron superiores en términos de recuperación, relación albúmina/globulina y potencia neutralizante contra varias actividades del veneno a la vez que presentaron menor turbidez y cantidad de agregados proteicos (Rojas y col. 1994).

Si bien el fraccionamiento de antivenenos con ácido caprílico en comparación con la precipitación salina, presenta ventajas tanto en la recuperación de las inmunoglobulinas de interés, como en los bajos costos y tiempos de trabajo, tiene en su contra que, en general, el agente terapéutico purificado es una inmunoglobulina G completa (de Roodt y col. 2010).

La presencia del fragmento Fc ha sido señalada como una importante causa de reacciones adversas, mediante reacciones de hipersensibilidad de tipo I y activación del complemento (Morais y Massaldi 2009).

En el presente trabajo nuestro grupo tiene como objetivo comparar, en términos de porcentaje de recuperación de masa proteica y capacidad neutralizante, antivenenos obtenidos por precipitación con ácido caprílico, conteniendo moléculas de IgG entera y antivenenos obtenidos como resultado de combinar la técnica de precipitación de plasma equino hiperinmune con ácido octanoico y la digestión enzimática de las moléculas de IgG con pepsina para obtener fragmentos F(ab´)2.

Materiales y métodos

Equinos. Para el plan de inmunización se utilizaron diez equinos mestizos tipo doble propósito de 300 a 500 kg. de peso, en buen estado de salud ubicados en el predio del Servicio de Actividades Agropecuarias del Instituto Nacional de Producción de Biológicos (INPB) de la Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS)“Dr. Carlos G. Malbrán”, sito en la localidad de Marcos Paz, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

Venenos. Se utilizaron venenos de B. alternatus y B. neuwiedii obtenidos a partir de especímenes sanos provistos por el Serpentario del Instituto Nacional de Producción de Biológicos, ANLIS, “Dr. Carlos G. Malbrán”.

Los venenos fueros obtenidos por extracción manual, inmediatamente secados al vacío y almacenados a 4ºC hasta su uso. La potencia letal (DL50) fue determinada utilizando el método de Probbit (Farmacopeia Brasileira 2006).

Esquema de inmunización. Los equinos utilizados ya presentaban memoria hacia los venenos de modo que el plan de inmunización consistió en la inoculación de boosters. Los mismos fueron inoculados por vía subcutánea (s.c.) los días 1, 15, 30, 45 y 55 con 1,0 mg (la primera dosis), 3,0 mg (la segunda y tercer dosis) y 6,0 mg (las dosis restantes) de una mezcla de venenos en diferentes puntos en el lomo. Durante el protocolo de inmunización, el veneno fue inoculado con Adyuvante de Freund Incompleto (día 1) o sólo con NaCl 0,15 M (en los días restantes).

Control de la evolución de la respuesta inmune. Con el objeto de evaluar la evolución de la respuesta inmune, el pool constituido por las muestras individuales fue testeado en ratones CF-1 de 18-20 g, enfrentando diferentes volúmenes del suero hiperinmune a controlar contra 5 DL50 del veneno. El sistema veneno - antiveneno fue incubado a 37 ºC durante 30 minutos y posteriormente inoculado por vía intraperitoneal (i.p.).

Para el manejo de los animales se siguieron los lineamientos éticos sugeridos por el National Research Council (2002).

Obtención del plasma hiperinmune. La sangre equina fue obtenida por punción de la vena yugular y recolectada en frascos de vidrio conteniendo 10 % v/v Citrato de Sodio al 20 %. Se dejó decantar el paquete globular y mediante la utilización de una bomba se extrajo el plasma hiperinmune que se colocó en un frasco acondicionado. Se agregaron, como conservante, partes iguales de fenol - éter en una relación de 9 ml por litro de plasma.

Posteriormente, el plasma fue fraccionado para realizar los diferentes métodos de fraccionamiento y purificación de inmunoglobulinas.

Purificación de Inmunoglobulinas IgG. Inmunoglobulinas enteras fueron purificadas por fraccionamiento con ácido caprílico usando técnicas convencionales (Rojas y col. 1994), con modificaciones.

Brevemente, el plasma fue diluido a la tercera parte con NaCl 0,15 M, se ajustaron el pH y la temperatura a 4,8 y 30 ºC, respectivamente. El ácido caprílico (ICN) se adicionó lentamente y con agitación vigorosa hasta completar un volumen equivalente al 5% del volumen del plasma original. Una vez terminada la adición se mantuvo en agitador en las mismas condiciones durante 1 hora.

La masa insoluble fue removida utilizando papel de filtro tipo Whatman. La solución filtrada se diafiltró contra PBS pH 7,2 y se concentró utilizando un cassette Pellicon 2 de 10 KDa, marca Millipore. Se agregaron Thimerosal 1/10000 y fenol 1/1000 como conservantes.

Al antiveneno obtenido se le realizaron determinaciones de proteínas y potencia neutralizante.

Purificación de los fragmentos F(ab´) 2 de inmunoglobulinas. Los fragmentos F(ab´)2 fueron purificados a partir del plasma de acuerdo a lo descripto, adicionando un paso de digestión enzimática con pepsina.

Brevemente, el plasma fue diluido a la tercera parte con solución fisiológica. La fracción F(ab´)2 se obtuvo por digestión enzimática con pepsina 1/10000 (Parafarm) a pH 3,2, incubando durante 30 minutos a 30ºC. Posteriormente, el pH se ajusto a 6,5 por el agregado de NaOH 0,75 N, se mantuvo 15 minutos en estas condiciones y posteriormente se volvieron a ajustar el pH y la temperatura a 4,8 y 30 ºC respectivamente. Se adicionó ácido caprílico (ICN) lentamente y con agitación vigorosa hasta completar un volumen equivalente al 5 % del plasma. Una vez terminada la adición, se mantuvo la agitación en las mismas condiciones durante 1 hora.

El precipitado obtenido se filtró por papel de filtro tipo Whatman. La solución filtrada se diafiltró contra buffer PBS pH 7,2 y se concentró utilizando un cassette Pellicon 2 de 10 kDa, marca Millipore. Se agregaron Thimerosal 1/10000 y fenol 1/1000 como conservantes.

Al antiveneno obtenido se le realizaron determinaciones de proteínas y potencia neutralizante.

Diafiltración. Se utilizó un equipo de filtración tangencial marca Millipore modelo Pellicon 2 de acero inoxidable con cassettes de 0,5 m2 de área y cut off de10 kDa. Como unidad impulsora se utilizó una bomba peristáltica modelo BT, marca Masterflex con tubuladuras de silicona tipo Pharmed BT 86.

Determinación de proteínas. Las proteínas de los antivenenos fueron medidas con el método de Biuret usando el kit Proti II (Wiener).

Neutralización de la potencia letal de los antivenenos. Ratones CF-1 de 18-20 g fueron enfrentados a diferentes volúmenes de cada antiveneno contra 5 DL50 de cada veneno. El sistema veneno - antiveneno fue incubado a 37 ºC durante 30 minutos y posteriormente inoculado por vía intraperitoneal (i.p.).

A las 48 hs se registraron las muertes y se determinó la dosis efectiva 50% (expresada como la cantidad de veneno en microgramos que es neutralizado por 1 mililitro de antiveneno) mediante técnicas convencionales (WHO 1981; Theakston y Reid 1983; Farmacopeia Brasileira 2006).

Estudios de especificidad. Se realizaron por doble inmunodifusión en geles de agarosa enfrentando el antiveneno con anti IgG equina o anti suero total equino usando técnicas clásicas (Ministerio de Saúde 1996).

Estudios de pureza. Se realizaron por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Se sembraron 25 µg de cada muestra en geles al 7,5% de acrilamida / bis acrilamida siguiendo técnicas convencionales (Laemmli 1970).

Recuperación de la capacidad neutralizante. Se definió como recuperación de la capacidad neutralizante a la masa de veneno neutralizada por el antiveneno purificado respecto a la masa del mismo veneno neutralizado por el suero de origen.

Se determinó la potencia neutralizante por unidad de volumen del plasma equino hiperinmune y del antiveneno purificado. El porcentaje aproximado de recuperación de la capacidad neutralizante se expresó con la siguiente ecuación:

Si bien el material de origen para el fraccionamiento es plasma equino, la titulación se realiza sobre una muestra de suero obtenida junto al plasma equino a utilizar.

Recuperación de la masa de proteínas. Se definió como recuperación de la masa de proteínas a los gramos de proteínas que permanecen en solución después de separar por precipitación y filtración aquellas proteínas que se insolubilizaron en presencia de ácido caprílico en esas condiciones. Se expresó como porcentaje respecto al total de proteínas.

Para poder comparar el porcentaje de recuperación de proteínas en cada metodología utilizada, se establece que a la concentración de proteínas de la muestra de IgG se la multiplique por 2/3 para descontar del valor de concentración proteica la influencia del fragmento Fc, de manera que esa diferencia de concentración represente las diferencias en el número de moléculas. El porcentaje de recuperación de la masa de proteínas se expresa con la siguiente ecuación:

Resultados

Las potencias letales aplicadas por vía intraperitoneal de los venenos estudiados fueron 53 µg para el veneno de B. alternatus y 57 µg para el veneno B. neuwiedii.

El estudio de especificidad mostró una banda de precipitación cuando el veneno fue enfrentado con el suero anti IgG equina completa o el anti suero total equino, mostrando la pureza de los antivenenos obtenidos (Figura 1).


Figura 1. Estudio de especificidad del antiveneno por Doble Inmunoprecipitación en agarosa al 0,8 %. Se sembraron 15 µl de cada muestra por pocillo. Se dejó difundir durante 48 hs. La tinción se realizó con Negro amido.

Surge del análisis electroforético que en los antivenenos enriquecidos en moléculas IgG enteras, aparece una banda de aproximadamente 150 kDa, la cual corresponde al peso molecular de la IgG. En los antivenenos obtenidos por precipitación por ácido caprílico y corte enzimático con pepsina, se ve la aparición de una única banda en el orden de los 100 kDa correspondiente a la masa molecular de la fracción F(ab´)2 (Figura 2).


Figura 2. SDS-PAGE al 7,5 % de acrilamida-bisacrilamida en condiciones no reductoras. En cada calle se sembraron 25 µg de proteína. PM: peso molecular; IgG: inmunoglobulina G; F(ab´)2: fragmento F(ab´)2.

En la Tabla 1 se muestra el porcentaje de recuperación de la masa de proteínas totales que quedaron en solución y la actividad neutralizante del antiveneno (expresado como la masa de veneno neutralizado por el antiveneno) luego del proceso de purificación (con o sin tratamiento enzimático), con respecto a la masa de proteínas y la actividad neutralizante presentes en el plasma sin purificar.

Tabla 1. Porcentaje de recuperación de masa proteica y capacidad neutralizante de antivenenos conteniendo IgG entera o fragmentos F(ab´)2. Los resultados están expresados como la media ± desvío estándard de los porcentajes de recuperación de masa proteica y capacidad neutralizante.

Se observó que, tanto en la masa de proteínas como en la actividad neutralizante, se obtiene una recuperación notoriamente menor cuando se obtiene el fragmento F(ab´)2 en comparación con los antivenenos conteniendo moléculas de IgG enteras. En este punto, cabe aclarar que los valores de las masas proteicas obtenidas luego de la digestión enzimática y la posterior precipitación, fueron corregidos de manera tal de no considerar al fragmento Fc, el cual precipita.

De estos resultados surge que prácticamente toda la pérdida de la capacidad neutralizante al tratar enzimáticamente las moléculas de IgG se explicaría por la generación de un precipitado adicional correspondiente al fragmento Fc cuando se precipitan los contaminantes luego del tratamiento con pepsina.

Al realizar la relación IgG / F(ab´)2 se observa que los valores obtenidos son muy similares, tanto para la masa de proteínas obtenida (1,84) como para la recuperación de la actividad neutralizante contra B. alternatus y B. neuwiedii (1,97 y 1,92 respectivamente).

Estos resultados muestran la relación que existiría entre la pérdida de proteínas activas en solución y la pérdida de la actividad neutralizante del antiveneno.

Entre ambas metodologías, la pérdida de proteínas sería responsable del 93 % de la pérdida de la capacidad neutralizante para el veneno de B. alternatus y del 96 % para el veneno de B. neuwiedii.

Discusión

Una de las metodologías más utilizadas para la obtención de antivenenos es la purificación de los anticuerpos del plasma equino hiperinmune utilizando como agente precipitante el ácido caprílico. Esta técnica tiene como fundamento la remoción de las proteínas plasmáticas insolubles en ácido caprílico a pH 4,8.

Cuando se purifica plasma equino a nivel industrial uno de los inconvenientes es la dificultad del proceso de filtración y la alta contaminación de la masa insoluble. La filtración se ve dificultada porque el precipitado tiene características de gran superficie y alta viscosidad, mientras que los fenómenos de contaminación de la masa insoluble se deben a dos factores principales: a) el arrastre mecánico, fenómeno de coprecipitación por el cual las impurezas solubles precipitan junto con las insolubles y b) la adsorción, fenómeno de post- precipitación por el cual las moléculas solubles se desplazan hacia el precipitado una vez que éste se ha formado. Es decir que a causa de ambos factores, se produciría el desplazamiento de los anticuerpos en solución hacia el precipitado.

Esto estaría dado porque las proteínas plasmáticas en solución se presentan como coloides hidrofílicos que, cuando pierden su solubilidad precipitan en forma de masa amorfa, de gran superficie y alta retención de aguas madres (Kolthoff 1965).

Cuando se purificaron inmunoglobulinas G enteras, la recuperación fue aproximadamente del 53 % de la capacidad neutralizante mientras que la recuperación fue de alrededor del 30 % cuando se obtuvo el fragmento F(ab´)2.

Esto significa que si un volumen de plasma equino hiperinmune neutraliza 100 µg de un veneno determinado, ese mismo plasma, eliminadas las impurezas neutralizará 53 µg de veneno y si el plasma es tratado enzimáticamente neutralizará alrededor de 30 µg de veneno, considerando que el veneno contra al cual se los compara es el mismo.

Al calcular la recuperación de la masa de proteínas vemos que en el caso de la molécula IgG es de aproximadamente el 34%, mientras que cuando se recupera el fragmento F(ab´)2 , el porcentaje es de alrededor del 18,5.

Algunos autores responsabililizan a las condiciones físico - químicas usadas durante la digestión enzimática como la causante del menor grado de recuperación de la capacidad neutralizante. Sin embargo, de acuerdo a estos valores, la pérdida de proteína ocurrida durante la etapa de filtración es de similar magnitud a la pérdida de la capacidad neutralizante, lo que podría sugerir que esa etapa sería la responsable de aproximadamente el 90 % de esta disminución. Esa pérdida adicional de proteínas cuando se purifican los anticuerpos tratados enzimáticamente radicaría en una mayor masa precipitada. Esa masa adicional correspondería al fragmento Fc generado durante la digestión e insoluble en ácido caprílico a pH 4,8.

Esta mayor cantidad de masa precipitada, debido a sus características de gran superficie, alta viscosidad y alta retención, produciría el arrastre de parte de las moléculas de inmunoglobulinas, llevando a una disminución de los valores de actividad neutralizante.

En trabajos anteriores encontramos que un aumento en la dilución del plasma antes de purificar permite recuperar mayor cantidad de anticuerpos. Sin embargo este aumento no es proporcional al grado de dilución (Datos no mostrados). Eso explicaría que la pérdida de anticuerpos no es debida solamente al agua incluida en la masa insoluble por atrapamiento mecánico sino que además, puede haber factores de adsorción en superficie, fenómeno éste que no se modificaría con la dilución.

En resumen, conociendo que la etapa de la precipitación y filtración es la “etapa crítica” causante de la pérdida de masa proteica activa y, por ende, de la capacidad neutralizante, sería posible obtener antivenenos conteniendo anticuerpos F(ab´)2 casi con el mismo grado de recuperación que la obtenida cuando se purifican moléculas de IgG a partir de plasmas equinos hiperinmunes. Para ello, se deben ajustar algunos parámetros durante esa etapa tales como diluir fuertemente el plasma antes de su fraccionamiento, disponer de la mayor superficie filtrante posible y/o incorporar adyuvantes para la filtración que disminuyan la superficie de la masa insoluble.

La obtención de un buen rendimiento de la actividad neutralizante luego de la purificación de plasmas equinos hiperinmunes, sumado a la simplicidad de la técnica de precipitación por ácido caprílico, la ventaja de lograr una molécula de F(ab´)2 libre del fragmento Fc y la sencillez al momento de validar procesos, haría que esta combinación de tratamiento enzimático con pepsina y posterior precipitación con ácido caprílico sea el método de elección al momento de realizar la producción industrial de antivenenos para uso humano y veterinario.

Agradecimientos: a la Lic. Lucía Ávila por la realización de los SDS-PAGE y al personal técnico del Servicio Sueros Terapéuticos por su colaboración en el presente trabajo.

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