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Acta toxicológica argentina

On-line version ISSN 1851-3743

Acta toxicol. argent. vol.23 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires Sept. 2015

 

COMUNICACIONES BREVES

Fermentação em estado sólido de Aspergillus parasiticus e produção de aflatoxinas

Solid state fermentation of Aspergillus parasiticus and aflatoxin production

 

Domingues, Jéssica Mari*; Carneiro Gomes, Eliane; Brand, Debora; Wagner, Ricardo

Universidade Federal do Paraná. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, UFPR. Av. Pref. Lothário Meissner, Av. Pref. Lothário Meissner, 632; 80.210-170, Curitiba, PR, Brasil
*jm-domingues@hotmail.com

Recibido: 15 de diciembre de 2014
Aceptado: 30 de julio de 2015

 


Resumo. Aflatoxinas são metabólitos secundários de fungos com grande potencial carcinogênico, produzidos principalmente por Apergillus flavus e Aspergillus parasiticus. Em vista da ampla variedade de alimentos em que se encontram essas micotoxinas, o presente estudo teve como objetivo determinar condições de cultivo para o Aspergillus parasiticus e produção das quatro principais aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2) considerando diferentes substratos conhecidos pela contaminação por estas micotoxinas, entre eles arroz branco, arroz cateto, amendoim, milho e farinha de trigo integral, e diferentes valores de umidade e pH. Ao analisar por cromatrografia em camada delgada os extratos dos diferentes substratos, verificou-se a produção de aflatoxinas em todos os alimentos, porém na cromatografia líquida de alta eficiência foi possível perceber a maior produção de aflatoxinas no arroz cateto e na farinha de trigo integral. Para a continuidade do trabalho, utilizou-se o arroz cateto e então preparou- se diferentes meios sólidos com valores de pH entre 3,5 e 7,5 e umidade entre 42 % e 62 %. Ao analisar por CLAE, todas as amostras apresentaram produção de AF, porém as amostras com o maior valor de água agregada (62%) apresentaram maior produção enquanto a variação de pH não apresentou influência nesta produção.

Palavras-chave: Aspergillus parasiticus; Aflatoxinas; Fermentação estado sólido; Alimentos.

Abstract. Aflatoxins are secondary metabolites of fungi with great carcinogenic potencial, mainly produced by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. In order of the wide variety of foods where mycotoxins are found in, this study aimed to determine growth conditions for Aspergillus parasiticus and production of four major aflatoxins (AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2) considering different substrates known for contamination by these aflatoxins, including white rice, cathetus rice, peanuts, maize and whole wheat flour, and different pH and humidity values. When extracts of different substrates were analyzed by thin layer chromatography, it has been verified the production of aflatoxins in all foods; however, when high performance liquid chromatography (HPLC) analysis was performed, the greater production of aflatoxins was observed in cathetus rice and whole-wheat flour. Cathetus rice was then selected to continue the study and different solid medium with pH values between 3.5 and 7.5 and humidity percentages between 42 % and 62 % were prepared. When analyzed by HPLC, all samples showed production of aflatoxins, but the samples with higher humidity value (62%) showed greatest production while the pH changes had no effect on this production.

Keywords: Aspergillus parasiticus; Aflatoxins; Solid state fermentation; Food.


 

Introdução

Aflatoxinas (AF) são metabólitos secundários produzidos por fungos e que interferem no funcionamento do sistema imunológico, além de apresentarem o maior potencial carcinogênico natural conhecido em animais e humanos (Kumar et al. 2008). Durante muito tempo acreditou- se que apenas Aspergillus seção flavi eram produtores de AF, porém atualmente, mesmo sabendo que estes são os maiores produtores, outros gêneros também foram descritos como produtores desta micotoxina (Frisvad et al. 2005).

Dentro da seção Flavi, os maiores produtores de AF são as espécies A. flavuse A. parasiticus. São relatadas aproximadamente 20 formas de aflatoxinas, entretanto o A. parasiticus é especialmente conhecido por apresentar a maior quantidade de cepas capazes de produzir altas concentrações das principais formas que são AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2, sendo que a AFB1 é geralmente encontrada em grande quantidade como contaminante em alimentos (Samapundo et al. 2007; Lozano-Ojalvo et al. 2013). O gênero Aspergillus produz outras micotoxinas além das AF, como o A. flavus, que produz o ácido ciclopiazônico, uma potente neurotoxina (Reis et al. 2014).

Para a identificação desta seção de fungos, comumente são realizadas análises bioquímicas e morfológicas. Para a diferenciação entre A. flavus e A. parasiticus, primeiramente são analisados os conídios, para os quais A. flavus apresenta paredes finas, de leve a moderadamente rugosas e com uma forma esférica a elíptica. Os conídios de A. parasiticus são mais esféricos e crescem em projeção de espinhos. Quando cultivados em Czapek-Dox o A. flavus apresenta cor amarelo esverdeado enquanto o A. parasiticus apresenta cor verde escuro (Rodrigues et al. 2009).

Para as aflatoxinas existem dois principais fatores que juntos favorecem a produção da mesma, a temperatura e umidade. O gênero Aspergillus possui a capacidade de crescer em várias condições climáticas, favorecendo a produção de micotoxinas, porém grãos armazenados em temperaturas quentes e com alta umidade apresentam maior potencial de contaminação (Richard 2007).

Entre os alimentos passíveis de crescimento de fungos produtores de AF, estão milho, arroz e outros. A produção de micotoxinas pode não afetar o rendimento da colheita, como no amendoim, porém a ingestão destes alimentos contaminados apresenta riscos à saúde de várias espécies animais, além dos humanos, embora estes efeitos variem de acordo com idade, sexo e condições nutricionais (Binder 2007; Kumar et al. 2008).

Os estudo de crescimento fúngico em ágar já é realizado há muito tempo e novos estudos tem utilizado a fermentação em estado sólido e com múltiplas finalidades, como a produção de metabólitos. Este processo envolve uma matriz sólida com ausência ou baixas quantidades de água livre, exigindo apenas uma quantidade de água suficiente para o crescimento e metabolismo do microorganismo a ser cultivado e, devido a isso, fungos e leveduras são os microorganismos mais adequados para este processo (Pandey 2003; Singhania et al. 2009).

Existem vários aspectos importantes no processo de fermentação em estado sólido, entre eles está a seleção do substrato, o qual deve oferecer suporte físico e nutrientes para o microorganismo. Quando o objetivo desta fermentação é a obtenção de um produto especifico deve-se testar diferentes substratos para definir o mais adequado. Umidade, pH e temperatura de incubação também são parâmetros importantes que devem ser analisados para a fermentação em estado sólido (Bellon -Maurel et al. 2003; Pandey 2003).

Sabendo-se da ampla variedade de condições existentes para a produção de aflatoxinas, o presente trabalho teve como objetivo verificar o substrato adequado para a produção de AF em meio sólido por A. parasiticus e analisar a influência do pH e umidade sobre esta produção.

Métodos

A cepa utilizada foi Aspergillus parasiticus NRRL 2999, obtida através do site www.nrrl.ncaer.usda.gov. Para o crescimento da cepa, transferiu-se o fungo liofilizado para um frasco erlenmeyer contendo 5 mL de caldo batata dextrose com pH 4,91 e incubou-se a 24 ºC em um agitador orbital a 150 rpm durante 1 dia. Para a ativação do fungo, realizou-se repique da cepa original para tubos de ensaio contendo ágar batata dextrose que foram incubados a 28 ºC durante 4 dias em estufa. Adicionouse 1 mL de caldo batata dextrose no tubo de ensaio com o cultivo, raspou-se os esporos e transferiu-se 800 μL do caldo com os esporos para um frasco erlenmeyer contendo 9 mL de caldo que foi incubado a 28 ºC em um agitador orbital a 150 rpm durante 24 horas. Após o período de incubação, transferiu-se 3 mL do caldo para um erlenmeyer com 30 mL de ágar batata dextrose e incubou-se na estufa a 28 ºC durante 7 dias. Adicionou-se ao frasco 20 mL de solução tween 80 a 0,5 % (v/v), 10 pérolas de vidro e uma barra magnética e deixou-se o frasco durante 10 minutos sob agitação magnética para a recuperação dos esporos, obtendo- se assim a suspensão de esporos utilizada como inóculo.

A análise morfológica foi realizada por cultivo entre lâmina e lamínula com 200 μL de ágar batata dextrose e 20 μL de inóculo, após o período de incubação de 3 dias a 28 ºC na estufa, visualizou-se o cultivo em microscópio óptico. Para se avaliar o substrato de crescimento fúngico utilizou-se os seguintes alimentos: amendoim, milho, arroz branco, arroz cateto e farinha de trigo integral com umidades específicas para cada substrato (tabela 1) e então transferiu- se 1 mL do inóculo para cada substrato. Incubou-se a 28 ºC por 5 dias e posteriormente analisou-se a produção de AF por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

Tabela 1. Meios sólidos testados para a produção de aflatoxinas com seus respectivos teores de água agregada.

Depois de estabelecido o melhor substrato para a fermentação em estado sólido, preparou- se meios com o substrato escolhido em diferentes valores de pH entre 3,5 e 7,5 ajustados com ácido sulfúrico 0,1 M e hidróxido de sódio 0,5 M e diferentes umidades (água agregada) entre 42 % e 62 % conforme a tabela 2. Os meios foram incubados a 28 ºC durante 5 dias. Após o período de incubação, verificou-se o pH das culturas e posteriormente a produção de AF foi analisada por CCD e CLAE.

Tabela 2. Substrato escolhido (arroz cateto) com diferentes valores de pH e água agregada

Para a extração das aflatoxinas adicionou-se 10 mL de clorofórmio no cultivo e agitou-se por 5 minutos. Filtrou-se o clorofórmio em papel filtro e então repetiu-se o procedimento, o clorofórmio foi evaporado. Para a limpeza solubilizou- se o resíduo com 10 mL de metanol ao qual adicionou-se 5 mL de hexano e 5 mL cloreto de sódio 4 %, agitou-se e o hexano foi descartado. Adicionou-se 10 mL de clorofórmio e água, agitou-se e então filtrou-se a camada clorofórmica. Evaporou-se o clorofórmio, adicionou-se 1 mL de acetonitrila nas amostras para analisá-las por CLAE.

Para a análise dos substratos em cromatografia em camada delgada utilizou-se como fase estacionária placas de sílica gel G com indicador de fluorescência (Merck) e como fase móvel clorofórmio:acetona 9:1 (v/v) com corrida de 10 cm.

A CLAE foi realizada em equipamento Varian Prostar, coluna Microsorb-MV C18 (4,6 mm x 250 mm x 5 μm). Os solvente utilizados foram Merck, e como fase móvel utilizou-se água:- metanol:acetonitrila (5:4:1). O fluxo foi 0,8 mL/ min e o volume de injeção foi 10 μL. A temperatura durante as análises foi 21 ºC e o detector foi o fluorescência com λex=365 nm e λem= 455 nm.

Resultados e discussão

A análise morfológica do crescimento fúngico entre lâmina e lamínula da cepa de Aspergillus parasiticus apresentou conídios verde escuro, esféricos e em projeção em forma de espinhos, diferentemente da descrição de literatura da cepa de Aspergillus flavus que possui conídios com paredes finas, moderadamente rugosas e com forma esférica a elíptica. Sabendo que a cepa utilizada é Aspergillus parasiticus se confirmam as estruturas reprodutivas da mesma (figura 1).


Figura 1. Crescimento de Aspergillus parasiticus entre lâmina e lamínula. Em (A) aumento de 40x e em (B) aumento de 100x.

Para a escolha do substrato adequado para a produção de aflatoxinas optou-se pela análise destas micotoxinas em CCD, onde foi possível perceber que ocorre uma melhor produção das 4 principais AF em arroz cateto, arroz branco e farinha de trigo integral, porém houve produção em todos os substratos. Ao analisar por CLAE verificou-se novamente a produção de AF em todos os substratos, porém o arroz cateto e a farinha de trigo integral apresentaram uma boa produção com menos substâncias provenientes da matriz. Para a continuidade do trabalho, optou-se pelo arroz cateto como meio de produção por apresentar maior facilidade de trabalho que a farinha.

Para a avaliação da influência qualitativa do pH e umidade para o crescimento e produção de aflatoxinas escolheu-se acompanhar a produção por CCD, onde verificou-se que ocorre produção de aflatoxinas em todas as amostras, independente do pH e da água agregada ao meio, portanto estes fatores não apresentaram influência qualitativa sobre a produção de AF. Ao verificar o pH dos cultivos após o período de incubação percebeu-se que todos os cultivos apresentaram pH próximo a 5 conforme a tabela 3.

Tabela 3. Valores de pH das culturas após período de incubação a 28 ºC durante 5 dias.

Para analisar a influência quantitativa do pH e água agregada sobre a produção de AF, analisou- se as amostras em CLAE, onde foi possível perceber que as amostras 3, 6 e 9 que apresentavam a maior umidade (62 %) apresentaram maior produção de AF que as outras amostras conforme a figura 2.


Figura 2. Influência pH e umidade na produção de AF.

Conforme Mateles e Adye (1965) constataram, o valor de pH parece não apresentar grande influência sobre a produção de aflatoxinas, pois após a produção das mesmas, todos os cultivos alcançaram valores próximos de pH. Ao analisar por CLAE, a produção de AF dentro da mesma faixa de pH apresentou uma grande variação de acordo com a umidade, mas a mesma faixa de umidade não apresentou uma grande variação conforme a alteração de pH.

Conclusão

Os substratos testados neste trabalho para o crescimento fúngico são alimentos citados na literatura como produtos passíveis de contaminação por aflatoxinas. Ao analisar os diferentes substratos para a fermentação em estado sólido, observou-se a produção de aflatoxinas em todos os alimentos testados, porém houve uma maior produção com menos interferentes provenientes da matriz sólida no arroz cateto e na farinha de trigo integral. O crescimento de A. parasiticus ocorreu em todas as diferentes condições de pH e umidade testadas e mesmo não sendo condições adequadas produziu-se aflatoxinas. Sabe-se que na fermentação em estado sólido, a água livre no processo é ausente ou em volumes baixos, mas é necessária uma umidade suficiente para sustentar o crescimento e metabolismo do microrganismo. Quando em condições de umidade mais elevadas a produção de AF foi maior, porém a variação de pH não interferiu de forma quantitativa nessa produção. Desta maneira o método de fermentação em estado sólido mostrou-se eficaz para o crescimento fúngico e produção de AF. Através deste método o isolamento das AFé mais simples, pois não se tem os interferentes do cultivo submerso em meio líquido.

Referências

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