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Validación de un método rápido en orina por lC/MS/MS para la búsqueda de compuestos empleados en sumisión química y su aplicación a muestras reales

Validation of a fast screening method in urine by lC/MS/MS for compounds used in drug-facilitated crime (DFC) and its application to real samples

 

Rubio, Nélida Cristina^1*; Márquez, Cecilia²; Confalonieri, Adriana²

¹Laboratorio de Toxicología, San Martín 565, Cipolletti,-Río Negro, Argentina.
²Centro de Alta Tecnología Analítica (CATA), B.Mitre 3690, Munro, Bs.As. Te: 54-11-4509-9000

*cristinarubio2@gmail.com

Recibido: 1 de mayo de 2015
Aceptado: 22 de marzo de 2016

 

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Resumen.

La Oficina de Naciones Unidas contra la Droga y el Delito (UNODC) en 2011 señala que "El delito facilitado por drogas (DFD) es una expresión general que abarca la violación y otras agresiones sexuales, el robo con violencia o intimidación, la extorsión de dinero y los malos tratos deliberados de ancianos o niños bajo la influencia de sustancias sicotrópicas". En este trabajo se validó un método cualitativo y rápido a partir de muestras de orina por LC/MS/MS para 39 compuestos comprendidos en los listados de sumisión química. El objetivo fue alcanzar un límite de detección un 50 % por debajo de la concentración propuesta como "Límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL)" por la UNODC, para poder ser aplicado a muestras reales.

Palabras claves: Delitos facilitados por droga; Sumisión química; LC/MS/MS; Validación

Abstract.

The United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC) in 2011, states that "The Drug-facilitated crime (DFC) is a general term that includes rape or other sexual assault, robbery, money extortion, as well as the deliberate maltreatment of the elderly or children under the influence of psychotropic substances". In this work we validated a qualitative and fast method from urine samples by LC/MS/MS for 39 compounds included in the Drug-facilitated crime lists.

The aim was to reach a detection limit of 50% below the proposed concentration as "minimum required performance limits (MRPL)" by UNODC in order to be applied in real samples.

Keywords: Drug-facilitated crime; DFSA; LC/MS/MS; Validation

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Introducción

En los últimos años los delitos facilitados por drogas (DFP) han tomado notoriedad en los medios y en el ámbito científico se ha incrementado el número de publicaciones científicas como así también las recomendaciones y procedimientos a seguir en la investigación y análisis toxicológico cuando se aborda este tema como consecuencia del aumento de las denuncias en prácticamente todo el mundo (LeBeau 1999; EMCDDA 2008; García-Repetto y col. 2011; UNODC 2011; García-Caballero y col. 2014; Xifró y col. 2014).

La UNODC (2011) establece que: "El delito facilitado por drogas (DFD) es una expresión general que abarca la violación y otras agresiones sexuales, el robo con violencia o intimidación, la extorsión de dinero y los malos tratos deliberados de ancianos o niños bajo la influencia de sustancias sicotrópicas". Dentro de este grupo de delitos la víctima se encuentra incapacitada de rechazar a su atacante y está presente la agresión sexual facilitada por drogas (ASFD) o DFSA (Drug-facilitated sexual assault) según sus siglas en inglés.

En este tipo de delitos el victimario le suministra a la víctima (voluntaria o involuntariamente) en el alimento o bebida alguna sustancia con el objeto de menoscabar su capacidad de decidir. La víctima podrá sentirse relajada, eufórica, desinhibida, con dificultades en el habla y el equilibrio, pudiendo estar somnolienta, inconsciente o incluso llegar a la muerte. A esto debemos sumar que la víctima recuperada tiene afectada en general su memoria. La razón de que muchas de las drogas que se emplean para cometer este tipo de ilícitos afectan la memoria hace que el hecho no se denuncie o se lo haga con retraso.

Las  sustancias  que  mayoritariamente  son encontradas en la comisión de estos delitos (Djezzar 2009; LeBeau 2010; Jones y col. 2012), son el alcohol, otras como el hidrato de cloral, GHB o los z-hipnóticos, las benzo-diacepinas, etc. y raramente son detectadas en medios biológicos, en parte debido a sus cortas vidas medias o porque al momento de la toma de la muestra están por debajo del límite de detección del método a ser empleado. El laboratorio de toxicología forense requiere para la resolución analítica de las muestras a analizar (sangre y orina o cabello en los casos que el incidente sea denunciado con retraso de varios días), de técnicas analíticas sensibles y específicas. Como aconseja la UNODC aquellas técnicas como los inmunoensayos y técnicas enzimáticas que tienen límites de detección muy altos deberían evitarse o bien interpretarse con cautela los resultados negativos. Son recomendados "encarecidamente" (UNODC 2011) los métodos de cromatografía liquida- espectrometría de masas (LC/MS), cromatografía liquida- tándem masas (LC/ MS/MS) y cromatografía gaseosa- tándem masas (CG/MS/MS) por su sensibilidad y selectividad más elevada.

El objetivo de este trabajo fue validar una técnica cualitativa a partir de orina por LC/MS/ MS que cumpla con los niveles de detección recomendados para las sustancias investigadas. Se empleó un método directo de inyección conocido como "diluir e inyectar" ("dilute and shoot") para la mayoría de ellas y para aquellos compuestos que no cumplían con el requerimiento de detección se empleó una extracción líquido-líquido. Se aprovechó, en este caso, una de las ventajas del LC/MS/MS sobre el CG/MS que es su mayor sensibilidad, poder inyectar directamente o previa dilución una muestra de orina sin la necesidad de someterla a un tratamiento térmico que puede afectar a moléculas térmicamente lábiles y sin necesidad de extracciones y/o derivatizaciones previas. Esto hace que se disminuya el tiempo de análisis y según Fitzgerald y col. (2012) también el costo al no necesitarse el empleo de cartuchos de extracción.

Se monitorearon 39 sustancias de las reportadas comúnmente en la bibliografía internacional en casos de ASFD (Djezzar y col. 2009; García-Repetto y col. 2011; European Monitoring Center for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA) 2008; García-Caballero y col. 2014) y se estableció como objetivo fijar el límite de detección del método en un 50 % de la concentración propuesta como "Límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL)" por la UNODC (2011) (LeBeau 2010). En la Tabla 1 se detalla el listado de sustancias buscadas, sus MRPL y la concentración objetivo a alcanzar.

Tabla 1. Clasificación de los compuestos analizados, concentraciones MRPL, concentración objetivo a alcanzar y concentración a la cual son detectadas con el método empleado.

Se empleó una técnica de cromatografía líquida acoplado a tándem espectrometría de masa (LC/MS/MS), utilizando un equipo Agilent Technologies UPLC 1290 Infinity, Triple Quad LC/MS 6460.

El método se validó siguiendo la guía de validación propuesta por el Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX, 2013) para métodos cualitativos de identificación/confirmación y los parámetros validados fueron: carryover, interferencias, efecto matriz (Ionization suppression/enhancement), límite de detección, estabilidad y criterios de identificación según la Guía Alemana de la Sociedad de Toxicología y Química Forense - GTFCh (2009).

Los objetivos propuestos se cumplieron para toda la lista de sustancias ensayadas por dilución e inyección, con excepción de la morfina para lo cual se utilizó un método de extracción líquido-líquido empleado para screening en cromatografía liquida- arreglo de diodos (HPLC/DAD) según Pragst y col. (2004). El método desarrollado se aplicó a cinco muestras provenientes de víctimas que denunciaron haber sido abusadas sexualmente, pero que no recordaban que había sucedido durante los momentos previos al despertar, en lugares y con personas del sexo opuesto, en general desconocidas. No se dispuso del tiempo exacto del momento de la toma de la muestra, pero se estimó mayor a 24 horas de ocurrido el hecho.

Materiales y métodos

Solventes y reactivos

Los solventes usados en la fase móvil y en la extracción fueron: acetonitrilo: Carlo Erba –HPLC-Gold-ultragradiente; agua: ultrapura partiendo de agua grado HPLC ultra pura y obtenida en el purificador Barnstead Easy Pure II; ácido fórmico: Drowil grado HPLC; diclorometano: Panreac Química Sau-España, grado HPLC.

El Tris empleado fue de grado de pureza analítica de Merck Argentina.

Sustancias de referencia

Las sustancias de referencia fueron obtenidasdel Programa Internacional de Aseguramiento de la Calidad (IQAP) organizado por UNODC (United Nations Office on Drugs and Crime) y de Cerillant-US. Todas ellas fueron previamente monitoreadas por HPLC/DAD y CG/MS para constatar su identidad y pureza.

Instrumental y software Equipo: Agilent Technologies UPLC 1290 Infinity, con bomba binaria, ALS con termostatizador, compartimiento de columna y detector Triple Quadrupolo Agilent LC/MS 6460, fuente de ionización ESI con tecnología Jet Steam, y software de adquisición y de análisis de datos Mass Hunter revisión B.06.00

• Compartimiento de columna:
  • Columna: Agilent Eclipse Plus C18 RRHD, 1,8 µm 2,1 x 50 mm
  • Temperatura: 25 °C
  • Filtro pre-columna "1290 Infinity In-line Filter, Agilent"
• Bomba:
  • Fase móvil: A: agua 0,1 % ácido fórmico. B: acetonitrilo 0,1 % ácido fórmico.
  • Flujo: 0,4 mL/min
  • Gradiente:
    • T₀ = 95 % A
    • T₁ = 95 % A
    • T₇ = 70 % A
    • T₈ = 5 % A
    • T₁₀ = 5 % A
    • T_10,50 = 95 % A
• Volumen de inyección: 10 µL con lavado de aguja
• Temperatura del inyector automático: 5°C
• Detector Triple Cuadrupolo:
  • Modo de ionización: ESI (+) (-)
• Parámetros de la fuente:
  • Gas Temp: 350 °C
  • Gas fow: 10 L/min
  • Nebulizer: 40 psi
  • Sheath gas heater: 300 °C
  • Sheath gas fow: 11 L/min
  • V_Cap: 4000 V+ y 4000 V-

En la Tabla 2 se muestran para cada compuesto el ión precursor y el o los iones productos, la energía de colisión (CE), Celda de aceleración (CELL ACC), los tiempos de retención, la ventana de medición y polaridad. La adquisición fue hecha en modo dMRM (dinamic multi reaction monitoring).

Tabla 2. Iones precursores y transiciones (MRM), energías de colisión, celda de aceleración, tiempo de retención, ventana de medición y polaridad de los compuestos analizados

Parámetros de la validación

Se  siguieron  los  lineamientos  de  GTFCh (2009) y SWGTOX (2013).

Interferencias

Se analizaron diez (10) muestras de orina provenientes del staff del laboratorio quienes declararon no haber tomar medicación o haber tomado fármacos que no estaban en el listado de los compuestos a investigar.

Límite de detección (LD): se determinó fortificando en tres días distintos, tres blancos de orina de diferente origen corridos por duplicado, con una mezcla de los compuestos a buscar en seis concentraciones distintas: 0,5 ng/mL, 5,0 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL, 100 ng/mL y 200 ng/mL. Como criterio de LD se consideró aquella señal del analito que fuera igual o superior 3 veces al nivel de ruido de la línea de base cercana al pico, este criterio fue aplicado para todos los iones (transiciones) analizados. Como criterio de identificación (para todas las señales por encima del LD) se aplicaron:

1. El modo dinámico Multiple Reaction Monitoring (dMRM), con selección de un precursor con dos transiciones (Tabla 2) y se adoptaron las siguientes tolerancias expresadas como un porcentaje del ión o transición tomando la media de testigos puros corridos en idénticas condiciones (Tabla 3):

Tabla 3. Tolerancias aceptadas de las intensidades relativas de los iones de diagnóstico.

En el caso de la fuoxetina se empleó un ión precursor con una sola transición.

2. La variación del tiempo de retención comparado con el testigo puro ± 5 %

Efecto matriz

Se valoró el efecto matriz sobre diez muestras de orina inyectadas con el solo tratamiento de una dilución al medio en fase móvil a la concentración propuesta como objetivo a alcanzar de 5 ng/mL en la mayoría de los compuestos a analizar. Se comparó si hubo efecto de disminución o incremento de la ionización (Ionization supresion or enhancement) con una mezcla de testigos puros diluidos al medio con fase móvil a igual concentración. Se obtuvieron las medias de las diez áreas de las orinas fortificadas a 5 ng/mL (Área 2) y las áreas medias de los testigos puros inyectados por triplicados a 5 ng/mL (Área 1), se estimó el efecto matriz de supresión /aumento aplicando la fórmula:

(%) EFECTO MATRIZ= (ÁREA _{media 2} / ÁREA _{media 1} -1) x 100

Estabilidad

Congelado/descongelado: tres muestras de orinas blancos fortificadas a una concentración de 10 ng/mL con los compuestos a investigar es analizada por triplicado inmediatamente (tiempo 0) y luego de dos secuencias de congelado y descongelado de la muestra de orina a 24 hs y 48 hs. Se compararon las áreas a las 24 hs y 48 hs con las áreas obtenidas a tiempo 0. El criterio seguido para la selección de la concentración a ensayar de 10 ng/mL fue por ser, en general el máximo límite de detección propuesto para la mayoría de las sustancias del listado y además puede ser detectado el analito hasta con una pérdida del 50 %.

Permanencia en el vial de inyección en la bandeja del inyector automático durante 24 horas de las primeras muestras analizadas en el punto anterior.

Carryover

Se analiza la existencia de carryover inyectando muestras de orina blanco inmediatamente luego de inyectar mezclas de testigos de las sustancias analizadas. Las concentraciones empleadas para determinar la existencia de carryover fueron 20 ng/mL, 100 ng/mL y 200 ng/mL.

Muestras de orina

Diez muestras de orina blanco obtenidas del staff del laboratorio.

Muestras de orina blanco fortificadas con la mezcla de testigos a seis diferentes concentraciones. 0,5 ng/mL, 5 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL, 100 ng/mL y 200 ng/mL. Cinco (5) muestras de orina de víctimas de agresión sexual.

Procedimiento

Se emplearon dos métodos de preparación de las muestras de orina:

• Dilución-inyección: un (1) mL de orina se centrifugó a 10000 rpm durante 5 minutos. Se tomó 0,5 mL del sobrenadante y se le agregó 0,5 mL de fase móvil (0,1 % de ácido fórmico en agua), se pasó por filtros de celulosa 13/20 de 0,2 µm marca Agilent. El filtrado fue colocado en insertos marca Agilent para su inyección.
• Extracción líquido-líquido de orina con diclorometano (Pragst y col. 2004): 0,5 ml de orina se colocaron en un tubo Eppendorf, se le agregó 0,1 mL de solución Tris (24,3 g en 1 L de H₂O, pH 9,0) y 0,4 mL de diclorometano. Se agitó en vortex por 1 minuto y se centrifugó por 5 minutos a 10000 rpm. Se separó el diclorometano y se evaporó a sequedad en corriente de nitrógeno. El residuo se disolvió en 0,2 mL de fase móvil, se filtró y el filtrado se colocó en insertos marca Agilent para su inyección.

Resultados

Como se muestra en la Tabla 1 la mayoría de los compuestos tienen un límite de detección entre 2 y 20 veces por debajo de 10 ng/mL, valor fijado por el MRPL. La excepción fue la morfina que no alcanzó el límite de detección deseado de 5 ng/mL. Su límite detección diluyendo la muestra con fase móvil 1:1 se encontró a una concentración de 40 ng/mL. En estas condiciones se observó un efecto matriz de supresión de la señal de la morfina cercano al 100 %, habiendo sido este efecto ya reportado por otros autores (Fitzgerald y col. 2012). El empleo de la extracción líquido-líquido con diclorometano permitió llegar al límite de detección deseado de 5 ng/mL.

El método cumplió los criterios de identificación para todos los compuestos ensayados, con excepción de la fuoxetina en la que se investigó solo un ión precursor y una transición, no reuniendo los requisitos para su identificación por este método. Los hallazgos positivos deberán ser confirmados. No se observó a la concentración de 0,5 ng/ mL señales de interferencias con los compuestos analizados.

La metodología de dilución e inyección genera un importante efecto matriz, la cual se observó en la mayoría de las sustancias investigadas. La buena sensibilidad del instrumental permitió trabajar con este método. Los valores hallados de efecto matriz de disminución/aumento de la señal están en un rango que van desde -100 a +260, con algunas excepciones fuera de este rango, la benzoilecgonina (+430) y la norketamina (+850), no atribuidas a interferencias en las muestras de orina blanco analizadas. Peters y col. (2012) mencionan diversos rangos de disminución/aumento de la señal debidos al efecto matriz en orina y otras muestras biológicas.

Los compuestos investigados resultaron ser estables cuando se congelan y descongelan a las 24 y 48 hs. Se tuvieron pérdidas no mayores a un 15 %, que están por debajo del límite de detección propuesto para cada sustancia. No se observaron variaciones significativas cuando se dejaron en la bandeja del inyector, siendo importante señalar que el inyector de marca Agilent es refrigerado.

Se observó carryover a concentraciones de 100 y 200 ng/mL que desaparecieron con una segunda inyección de muestra blanco de orina. No se observó carryover a 20 ng/mL. En las muestras de orina analizadas, provenientes de víctimas que sufrieron algún tipo de agresión sexual, se detectó en todas ellas alprazolam y en dos cocaína, benzoilecgonina y metilecgonina (Figura 1). Se investigó además en este tipo de muestras la existencia de etanol por cromatografía gaseosa detector de llamas (GC-FID), que no se detalla por realizarse con otra tecnología.

A) EME: metilecgonina

B) BEG: benzoilecgonina

C) COC: cocaína

D) ALP: alprazolám

Figura 1. Cromatogramas de la orina de una víctima de sumisión química.

Discusión

El método desarrollado cumple con todos los puntos de la validación propuestos en la guía de validación de Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX, 2013) para métodos cualitativos de identificación/confirmación. Resulta ser un método rápido, que requiere bajo volumen de muestra y no tiene tratamiento previo de la misma, lo que disminuye el costo del empleo de cartuchos de extracción y el tiempo de una extracción líquido-líquido. El tiempo útil de la columna puede verse disminuido al inyectar la muestra sin previo tratamiento, pero el empleo de un filtro pre-columna o un guarda columna puede contrarrestar este proceso, discutido por Fitzgerald y col. (2012).

Dado que se utilizó una columna de resolución rápida de 1,8 µm de tamaño de partícula y de 5 cm de largo, se logró una buena separación de los compuestos investigados con un tiempo de análisis no mayor a 8,5 minutos (Figura 2) y un límite de detección por debajo de los sugeridos por la UNODC para muestras de orina provenientes de causas de sumisión química.

 

Figura 2. Cromatograma de los testigos en concentración de 20 ng/mL.

El método permite analizar 39 analitos en menos de 9 minutos. Es posible seguir agregando otros compuestos a esta lista y por sus exigencias en cuanto a bajos límites de detección, este método puede ser empleado en toxicología post-mortem y en toxicología clínica. En estos casos como es de esperar mayores concentraciones, puede iniciarse el análisis empleando diluciones mayores que disminuirían el efecto matriz y la acción del carryover.

El hallazgo de benzodiacepinas en muestras de orina de víctimas que habían denunciado abuso sexual, que previamente arrojaron resultados negativos por la técnica de CG/MS y HPLC/DAD corrobora la importancia de avalar la sugerencia dada en el manual de UNO-DC (2011) sobre la necesidad de emplear técnicas por tándem-masa como la acá empleada y trabajar en este tipo de muestras con los "Límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL)". Otros autores han reportado similares resultados cuando no se emplean técnicas de cromatografía tándem- masa (Tominaga y col. 2015).

En las muestras de orina no es raro encontrar concentraciones superiores a 100 ng/ mL por lo que sería de buena práctica inyectar un blanco luego de una muestra de orina para asegurar no arrastrar compuestos a la siguiente corrida.

Muchos de los compuestos analizados son eliminados como glucurónidos, el empleo de enzimas β-glucuronidasas previo a la dilución e inyección de la muestra puede favorecer la detección de los analitos a menores concentraciones.

En estudios preliminares se han obtenido buenos resultados en otras matrices biológicas como sangre, humor vítreo y bilis, de uso frecuente en toxicología forense post mortem.

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