ARTÍCULOS ORIGINALES

Validación de un método para cuantificar ácido-11-nor-9-carboxi-Δ_⁹- tetrahidrocannabinol en orina por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas previa extracción en fase sólida

Validation of a method for quantify 11-nor-9-carboxy-Δ_⁹-tetrahydrocannabinol in human urine using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry

 

Fernández, Nicolas; Vigo, Mercedes; Olivera, N. Monica; Ridolfi, Adriana S.; Quiroga, Patricia N.*

Universidad de Buenos Aires - CENATOXA, Cátedra de Toxicología y Química Legal, Facultad de Farmacia y Bioquímica. Junín 956, 7mo piso (C1113AAD), CABA, Bs. As. Argentina.
*pquiroga@ffyb.uba.ar

Recibido: 1 de diciembre de 2015
Aceptado: 11 de octubre de 2016

---

Resumen.

El cannabis es una de las drogas ilegales más usadas a nivel mundial. Su consumo se relaciona con diferentes hechos en el ámbito forense, laboral, deportivo y clínico. Para su detección se utilizan métodos con diferentes fundamentos y alcances (inmunológicos, cromatográficos). En este trabajo se describe un método preciso, reproducible y validado, para la cuantificación del principal metabolito urinario del Δ_⁹-tetrahidrocannabinol, el ácido-11-nor-9-carboxi- Δ _⁹-tetrahidrocannabinol (THC-COOH), por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas (GC-MS). Se efectuó una extracción en fase sólida (SPE) a partir de la orina, previa hidrólisis alcalina. Se utilizó el análogo deuterado (THC-COOH D3) como estándar interno. El análisis por GC-MS se realizó en modo SIM. La curva de calibración fue lineal en el rango de trabajo (10-100 ng/ml, r > 0,999) y el límite de cuantificación fue de 10 ng/ml. La recuperación absoluta estuvo comprendida entre el 91,0 y 99,0 %. La precisión intra e inter ensayo fue de 1,06 a 1,26 y 3,59 a 9,80 %, respectivamente. El método fue aplicado a muestras reales, positivas por test inmunológico, resultando ser muy útil y fiable en el análisis de rutina de THC-COOH en orina humana con fines toxicológicos.

Palabras clave: Ácido-11-nor-9-carboxi-Δ_⁹-tetrahidrocannabinol; Orina; Cromatografía gaseosa - espectrometría de masas; Validación.

Abstract.

Cannabis is one of the most widely used illegal drug in the world. Its consumption is related to different forensic, work, sports and clinical events. In order to determinate the presence of cannabis, different methods with distinct fundamentals and scopes (immunoassay and chromatography) are applied. This report described an accurate, reproducible, and validated gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method for the quantitation of 11-nor-9-carboxy- Δ⁹-tetrahydrocannabinol (THCCOOH), the major metabolite of Δ⁹-tetrahydrocannabinol in urine. A solid phase extraction (SPE), previous alkaline hydrolysis, was performed on the urine sample. Its deuterated analog (THC-COOH D3) was used as internal standard. The GC-MS analysis made by selected ion monitoring (SIM). Calibration curve was linear over the specified range (10 -100 ng/ml; r > 0.999) and limit of quantitation was 10 ng/ml. Absolute recoveries ranged from 91.0 to 99.0. Intra-assay and inter assay precision ranged from 1.06 to 1.26 and 3.59 to 9.80 %, respectively. The method has been applied to real samples, positive to immunological screening test, resulting to be very useful and reliable in routine analysis of THC-COOH in human urine for toxicological purposes.

Keywords: 11-nor-9-carboxy- Δ⁹-tetrahydrocannabinol; Urine; Gas chromatography - mass spectrometry; Validation.

---

Introducción

El cannabis (marihuana, Δ⁹-tetrahydrocannabinol, THC), presente en la historia de la humanidad desde hace milenios, es actualmente una de las drogas ilegales más usada en el mundo (SAMHSA Results from the 2013). El cannabis es capaz de producir alteraciones en la percepción, la memoria, la función cognitiva, la coordinación motora, entre otros efectos a nivel psicomotor (Ashton 1999, Curran y col. 2002, Chang y col. 2006, Ramaekers y col. 2006, Asbridge y col. 2012) de gran relevancia en el ámbito forense (Hamilton Police 2011, Navarro Escayola y Vega Vega 2013), laboral (Kaestner y Grossman 1998, Wadsworth y col. 2006), clínico (NIDA 2011, Bui y col. 2015), del deporte (Campos y col. 2003) y en casos de conducción bajo la influencia de drogas (Hartman y Huestis 2013). Esos escenarios dieron origen a un incremento en la demanda de métodos sensibles, rápidos y fiables para detectar, confirmar y cuantificar el cannabis en muestras biológicas. Para el diagnóstico de consumo, la orina sigue siendo aún el fluido biológico más frecuentemente empleado. Entre la gran diversidad de métodos analíticos utilizados para investigar el ácido-11-nor-9-carboxi- Δ ⁹-tetrahidrocannabinol (THC-COOH), principal metabolito urinario del Δ9-tetrahidrocannabinol (THC), se encuentran: test inmunológicos y métodos cromatográficos (Baker y col. 1984, Joern 1987, Buddha y col.1987, Congost y col. 1988, Kim y col. 2013, Carobini y col. 2014). En el caso particular del Δ⁹-tetrahidrocannabinol, Substance Abuse and Mental Health Services Administration de Estados Unidos (SAMHSA), recomienda como método inicial un screening inmunológico, con punto de corte de 50 ng/ml para metabolitos del THC y confirmar por GC-MS toda muestra identificada como positiva, con un punto de corte de 15 ng/ml para el THC-COOH (SAMHSA 2008). En el presente trabajo, se describe la validación de un método sensible y específico para cuantificar THC-COOH en orina por cromatografía gaseosa - espectrometría de masas (GC-MS), previa hidrólisis alcalina, extracción en fase sólida y posterior derivatización con N-metil- N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA). El presente método puede ser utilizado de forma rutinaria en toxicología clínica, laboral, forense y doping para establecer con certeza la presencia y concentración de THC-COOH en orina.

Materiales y métodos

Reactivos y estándares

El metanol, el hidróxido de sodio, el acetonitrilo, el hexano, el acetato de etilo, el ácido acético glacial y el ácido clorhídrico fueron todos de calidad para análisis y provistos por Merck Química Argentina (Buenos Aires, Argentina). Los estándares líquidos del ácido-11-nor-9- carboxi-Δ⁹-tetrahidrocanabinol (THC-COOH) y su análogo deuterado (THC-COOH-D₃) a una concentración de 100 μg/ml, fueron provistos por Cerilliant (Round Rock, TX, EEUU). Las columnas de fase reversa e intercambio iónico para extracción en fase sólida (SPE) fueron las Clean Screen^® [CSTHC 503 (500 mg/ ³ ml)], provistas por UCT Inc. (Bristol, PA, EEUU). El agente derivatizante N-metil- N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA) fue provisto por Pierce (EEUU).

La solución de trabajo de THC-COOH y el estándar interno (SI) de THC-COOH-D₃, se prepararon por dilución directa con metanol de cada solución stock [THC-COOH: 100 μg/ml y THC-COOH-D₃: 100 μg/ml] a una concentración de 1 μg/ml. Todas las soluciones fueron almacenadas a -20 °C en viales color caramelo, protegidas de la luz.

Curva de calibración

Fue preparada diariamente, fortificando blancos de orina con THC-COOH para obtener calibradores a una concentración final de 10; 15; 30; 50; 75 y 100 ng/ml. A cada punto se adicionó el SI (THC-COOH-D₃) para lograr una concentración final de 20 ng/ml.

Equipamiento

La validación y cuantificación se realizó con un cromatógrafo gaseoso Hewlett-Packard (HP6890N, Palo Alto, California, EEUU) equipado con inyector automático HP6890, acoplado a un detector de masas MSD5973 Network (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EEUU) y con una columna capilar HP- 5MS (5 % fenil-metilpolisiloxano, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) provista por J&W Scientific, (Folsom, CA, EEUU).

Muestras biológicas

En la optimización y validación del método, se utilizaron orinas de micción espontánea, de voluntarios no expuestos a THC, del staff del laboratorio. Para la verificación del método desarrollado, se procesaron orinas de individuos expuestos a THC, que concurrieron al Laboratorio de Asesoramiento Toxicológico Analítico (CENATOXA) con la correspondiente solicitud de confirmación por GC-MS de resultados de screening positivos de THC en orina.

Extracción en fase sólida (SPE)

La extracción de las muestras se realizó usando el protocolo para THC-COOH en orina del manual de aplicaciones SPE (United Chemical Technologies Inc. 2009), con las siguientes modificaciones en los pasos que se detallan a continuación:

• Columna utilizada, Clean Screen^® [CSTHC 503 (500 mg/ 3 ml)]

• Preparación de muestra e hidrólisis: volumen de orina 5 ml y de hidróxido de sodio 10 N 200 μl.

• Acondicionamiento de la columna: se sustituyó el buffer acetato por 1 ml de ácido clorhídrico 100 mM.

• Lavado de la columna: se modificó la proporción de ácido clorhídrico 100 mM / acetonitrilo a 70/30 (v/v).

• Derivatización de los extractos secos obtenidos, se realizó con 100 μl de MSTFA a 70 ºC durante 30 minutos.

Condiciones cromatográficas y del detector de masas (GC-MS)

El programa de temperatura del horno fue 150 °C durante 1 minuto con una rampa de 20 °C/ min hasta 280 °C durante 7 minutos. La temperatura del inyector, línea de transferencia y fuente de ionización, fueron de 260, 280 y 220 °C respectivamente. El modo de inyección utilizado fue splitless, con un volumen de inyección de 2 μl y flujo de helio de 0,7 ml/min. La fragmentación se efectúo por impacto electrónico, a una corriente de 300 mA, energía del electrón de 70 eV, operado en modo SCAN y SIM (rango de masas 200 a 500 uma).

La cuantificación se realizó en modo SIM, los iones de THC-COOH monitoreados fueron m/z: 371/473/488 siendo el ion cuantificador el m/z 371 y del estándar interno THCCOOH- D₃ el m/z 374.

Análisis de datos

El software MSD ChemStation Data analysis, provisto por Agilent Technologies, se utilizó en el análisis de datos del GC-MS. Para cada ion analizado, se determinó el tiempo de retención, el tiempo de retención relativo y la abundancia relativa porcentual respecto al ion cuantificador (m/z: 371), siguiendo los criterios de World Anti-Doping Agency (WADA 2010) como se muestra en tabla 1. El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism 5.0 2009, provisto por GraphPad Software.

Tabla 1.Criterios de confirmación establecidos según Word Anti-doping Agency.

Validación del método analítico

La validación del método analítico fue realizada de acuerdo con las directrices de United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC 2010), Food and Drug Administration (FDA 2001), la International Conference on Harmonization (ICH 1996) y literatura publicada referente a procedimientos de validación (Nowatzke y Woolf 2007, Peters y col. 2007, Shah 2007). Los parámetros estudiados fueron: selectividad, especificidad, linealidad, límite de cuantificación, precisión intra e interensayo y exactitud.

Selectividad y especificidad

Para evaluar la pureza del pico y selectividad, se analizaron blancos de orina (n=10) de personas no expuestas a la sustancia en estudio, que se encontraban bajo tratamiento médico con diferentes fármacos de uso habitual en Argentina (ibuprofeno, paracetamol, clonazepam, alprazolam, lamotrigina, etinilestradiol, drospirenona, omeprazol, T₄, diclofenac) y que declararon hábito de fumar y consumo frecuente de mate y/o café.

Para verificar la ausencia de cantidades apreciables (< al 1 %) de los iones 371/473/488 correspondientes al THC-COOH en el SI (THC-COOH D₃), una solución del SI de 1 μg/ ml en metanol sin extracción fue analizada en modo SCAN y SIM.

Linealidad, límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC)

Para evaluar la linealidad del método, una curva de calibración se preparó diariamente durante cinco días consecutivos, fortificando blancos de orina para obtener calibradores a una concentración final de 10; 15; 30; 50; 75 y 100 ng/ml (seis calibradores, cinco réplicas independientes). Con cada curva de calibración también se procesó un blanco de muestra.

Las curvas de calibración se obtuvieron graficando la relación de áreas entre los iones cuantificadores del analito y de su análogo deuterado (m/z 371/374) para cada concentración.

Para evaluar la linealidad se aplicó el test F de Fisher y el test T de Student para la pendiente. La correlación entre las variables se comprobó realizando el test de significación del coeficiente de correlación de Pearson (r) y se calculó el intervalo de confianza para el mismo.

El límite de cuantificación (LC) se obtuvo analizando diez réplicas independientes de orina blanco adicionadas con THC-COOH para obtener una concentración final de 10 ng/ml. Los criterios aplicados para LC fueron una variación en el tiempo de retención relativo menor al 2 % y un coeficiente de variación (CV %) inferior al 20 %. El límite de detección no fue estudiado sistemáticamente por debajo de 10 ng/ml dado que el punto de corte recomendado por SAMHSA para la confirmación de THC-COOH por GC-MS es de 15 ng/ ml. La relación señal-ruido (S/R) en el LC se determinó con el macro de Chemstation. La S/R fue definida como la altura del pico del analito dividido por el ruido de pico a pico a una distancia de 0,05 minutos respecto del comienzo del pico del analito. El criterio de aceptación utilizado fue un valor de R/S ≥10.

Precisión y exactitud

Precisión intra-ensayo: se evaluó fortificando muestras de orina blanco a tres concentraciones (10,0; 30,0 y 75,0 ng/ml) y procesando cinco réplicas para cada concentración, en un corto intervalo de tiempo y bajo las mismas condiciones. El criterio de aceptación en este punto fue un CV % menor al 20 % para el nivel bajo de la curva y un CV % menor al 15 % para el nivel medio y alto.

Precisión inter-ensayo: fue estimada a tres concentraciones (10; 30 y 75 ng/ml) fortificando muestras de orina blanco (n=7 para cada concentración) durante cinco días consecutivos. El criterio de aceptación para la precisión intermedia fue presentar un CV % menor al 20 % en el nivel bajo de la curva y un CV % menor al 15 % para el nivel medio y alto. Además, estos datos fueron evaluados con análisis de varianza de un factor (ANOVA).

La exactitud del método se valoró en términos de error relativo porcentual (ER %). El criterio de aceptación en este punto fue un ER % menor al 20 % para el nivel bajo de la curva y un ER % menor al 15 % para el nivel medio y alto.

Recuperación

La recuperación se determinó mediante el análisis de muestras de orina fortificadas (n=15) a cuatro niveles de concentraciones (10; 15; 50 y 100 ng/ml). El cálculo se realizó comparando las áreas (m/z: 371) de las orinas enriquecidas a los cuatro niveles de concentración versus las obtenidas con el analito puro en solución metanólica.

Aplicación en muestras reales

Para la verificación del método validado, se cuantificaron muestras de orina, derivadas al CENATOXA para la confirmación por GCMS de resultados positivos (acido-11-nor-9- carboxi-Δ⁹-tetrahidrocanabinol) en la prueba inicial o screening.

Los criterios de confirmación aplicados fueron los establecidos por WADA 2010.

Resultados y discusión

El análisis de THC-COOH en orina suele involucrar un paso de hidrólisis del conjugado glucurónido, una extracción líquido-líquido o SPE, derivatización y finalmente detección por GC-MS.

En humanos, el THC-COOH es el principal metabolito urinario del THC y sus parámetros de excreción fueron exhaustivamente estudiados por diversos autores (Johansson y col. 1990; Huestis y col. 1995; Smith-Kielland y col. 1999; Musshoff y col. 2006). Se elimina mayormente conjugado, formando un éster entre el resto carboxílico presente en el C11 del THC-COOH y el glucurónido (Williams y col. 1979; Williams y Moffat 1980). El clivaje de esa unión puede realizarse bajo condiciones alcalinas (Meatherall y Garriott 1988) o por hidrólisis enzimática utilizando β-glucuronidasa (Gustafson y col. 2003). En este método validado se realizó hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio 10 N, por ser la de mayor efectividad respecto a la hidrólisis enzimática de acuerdo a Abraham y col. (2007).

Es un prerrequisito esencial la derivatización del THC-COOH para el análisis por GC-MS, debido a su labilidad térmica. La presencia de un grupo carboxílico e hidroxilo fenólico hacen factible esa derivatización. Algunas de las posibles reacciones de derivatización incluyen metilación (Whiting y Manders 1982), perfluoralquilación (Karlsson y col. 1983; McBurney y col.1986), metilación con perfluoralquilación (Foltz y col. 1983) y trimetilsililación (Baker y col.1984). En la metodología aquí presentada, el uso de N-metil-N-trimetilsilil- trifluoroacetamida (trimetilsililación) permitió alcanzar una sensibilidad y rango lineal adecuado. Además, presenta una ventaja respecto a la metilación, dado que la fragmentación de la molécula nativa metilada (THCCOOH) aporta también el ion m/z 316 que se monitorea para el estándar interno deuterado (Buddha y col. 1987), acotando el rango lineal. También mejora la sensibilidad respecto a la fluoración, donde la formación de iones negativos durante la fragmentación de la molécula derivatizada se traduce como una baja sensibilidad cuando se utiliza impacto electrónico (IE) como técnica de fragmentación (Karlsson y col. 1983).

La reacción entre THC-COOH y MSTFA implica la sustitución de un resto trimetilsililo sobre el hidrógeno activo presente en el resto fenólico y carboxílico de la molécula nativa (THC-COOH) (Figura 1). El peso molecular del producto de derivatización es de 488 uma, el cual se observa en un cromatograma iónico total (SCAN). El fragmento más abundante (pico base, m/z: 371 uma) se genera por pérdida del grupo carboxílico esterificado con el resto trimetilsililo (-C₄H₉SiO₂), mientras que el fragmento de 473 uma se obtiene por la pérdida de un resto metilo (-CH₃). (Figura 2). En este trabajo, el analito derivatizado (THC-COOH-2TMS), resultó estable por lo menos durante 120 horas a 24 ºC (Tabla 2), a diferencia de Baker y col. (1984) quienes reportaron una estabilidad de 48 horas del derivatizado congelado.

Figura 1. Reacción de derivatización de THC-COOH con MSTFA. THC-COOH: ácido-11-nor-9-carboxi- Δ ⁹-tetrahidrocannabinol, MSTFA: N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida, THC-COOH-2TMS: ácido-11-nor-9-carboxi- Δ ⁹-tetrahidrocannabinol (trimetilsilil)₂.

Figura 2. Cromatograma iónico total (A) y espectro de masas en SCAN (Rango de masas: 200- 500) (B) para THC-COOH-2TMS de una muestra de orina fortificada (10 ng/ml). THC-COOH-2TMS: ácido-11-nor-9-carboxi- Δ ⁹-tetrahidrocannabinol (trimetilsilil)₂.

Tabla 2. Estabilidad THC-COOH-2TMS (n=3).

Respecto a los parámetros de la validación, el método resultó ser específico y selectivo para la cuantificación de THC-COOH en orina. Bajo las condiciones cromatográficas descritas, se separó el THC-COOH (tr 10,63) y su análogo deuterado (tr 10,60). El análisis de blancos de orina (n=10) no reveló picos interferentes en la ventana de detección del analito (m/z 371,473 y 488) y de su análogo deuterado (m/z 374). Adicionalmente, la ausencia de los fragmentos monitoreados (m/z 371,473 y 488) del THC-COOH en blancos de orina fortificados solo con el SI, demostró que el THC-COOH D₃ no contiene cantidades relevantes de la molécula madre (Figura 3). En el rango estudiado (10 - 100 ng/ml), el test de Fisher demostró que el modelo de calibración lineal era el adecuado, con un coeficiente de correlación > 0,999 y límite de cuantificación de 10 ng/ml (Tabla 3 y Figura 4).

Figura 3. Cromatograma de orina blanco (A); cromatograma iónico de orina fortificada con THC-COOH (10 ng/ml) y de los iones monitoreados (B); cromatograma del SI (C). THC-COOH: ácido-11-nor-9-carboxi- Δ ⁹-tetrahidrocannabinol.

Tabla 3. Linealidad y límite de cuantificación.

Figura 4. Curva de calibración en orina blanco fortificada (10, 15, 30, 50, 75, 100 ng/ml) para la cuantificación de THC-COOH. THC-COOH: ácido-11-nor-9-carboxi- Δ ⁹-tetrahidrocannabinol.

El método validado propone un rango dinámico lineal adecuado y útil en diversas situaciones. Por ejemplo, para la cuantificación de THC-COOH por GC-MS en orinas recolectadas para análisis de doping, donde concentraciones mayores a 15 ng/ml se considera dopaje (De Cock y col. 2003). También en la cuantificación de la primera micción pos consumo de un sólo cigarrillo y en la fase terminal de eliminación de THC-COOH cuando las orinas consecutivas de un mismo individuo pueden fluctuar entre positivas y negativas según el screening inmunológico (Huestis y col. 1995; 1996; Huestis y Cone 1998).

El límite de cuantificación de 10 ng/ml del método validado, junto con el uso de una prueba inicial con cutoff de 20 ng/ml, en lugar de una prueba inicial con cutoff de 50 ng/ml, ofrecería la posibilidad de incrementar la tasa THC positivos de 2,8 % a 4,1 % de acuerdo a Wingert (1997).

La precisión intra e interensayo fueron adecuadas, presentando un CV<15 %, en los tres niveles evaluados; mientras que la veracidad (en término de error relativo) presentó el intervalo más amplio de ± 10 % para el nivel más bajo. Al aplicar el análisis de varianza de un factor, ANOVA (p<0,05), no se encontró diferencia significativa entre los valores de concentraciones medias obtenidos de las cuantificaciones realizadas en los diferentes días (Tablas 4 y 5).

Tabla 4. Precisión intra-ensayo y exactitud (n=10).

Tabla 5. Precisión inter-ensayo y exactitud (n=15).

La recuperación absoluta en los cuatro niveles estudiados fue superior al 90 % con un desvío estándar de 1,5 - 5,5 %, sin diferencia significativa en los cuatro niveles evaluados (Tabla 6).

Tabla 6. Recuperación absoluta (n=15).

Aplicación en muestras reales

Un total de 19 muestras de orina, con resultados positivos para THC-COOH en una prueba inicial o screening, fueron cuantificadas con el método propuesto.

Todas las muestras cumplieron los criterios de confirmación adoptados de WADA 2010 (Tabla 1).

Los valores obtenidos se encontraron en el rango de 10 - 97 ng/ml (Tabla 7). En la figura 5 se representa el cromatograma de los iones monitoreados de THC-COOH y de los iones cuantificadores de THC-COOH /THC-COOHD₃ de una muestra real.

Tabla 7. Aplicación del método validado en muestras reales.

Figura 5. Cromatograma de fragmentos iónicos analizados para THC-COOH (A) y de los iones cuantificadores de THC-COOH / THC-COOH-D3 (B) de una muestra de orina con resultado positivo en la prueba inicial o screening identificada como protocolo 1.
THC-COOH: ácido-11-nor-9-carboxi- Δ ⁹-tetrahidrocannabinol.

Conclusión

Se describe un método por GC-MS, sensible y específico para la cuantificación del ácido-11-nor-9-carboxi-Δ⁹-tetrahidrocanabinol en orina humana. El método validado tiene adecuada linealidad, exactitud y precisión con alta recuperación del analito. Es muy fiable, rápido y fácil de realizar. Su aplicación a muestras de orina de individuos expuestos a THC para cuantificar el ácido-11-nor- 9-carboxi-Δ⁹-tetrahidrocanabinol mostró una excelente performance.

El método propuesto puede ser utilizado de rutina en laboratorios de toxicología para la confirmación y cuantificación de ácido- 11-nor-9-carboxi-Δ⁹-tetrahidrocanabinol en muestras de orina, resultando un procedimiento útil en diferentes campos de la toxicología.

Bibliografía citada

1. Abraham T.T., Lowe R.H., Pirnay S.O., Darwin W.D., Huestis M. A. Simultaneous GC-EIMS Determination of Δ⁹-Tetrahydrocannabinol, 11-Hydroxy-Δ⁹. Tetrahydrocannabinol, and 11-nor.9-Carboxy- Δ⁹-Tetrahydrocannabinol in Human Urine Following Tandem Enzyme - Alkaline Hydrolysis. J Anal Toxicol. 2007;31(8):477- 485.

2. Asbridge M., Hayden J.A., Cartwright J.L. Acute cannabis consumption and motor vehicle collision risk: systematic review of observational studies and meta-analysis. BMJ. 2012;344: e536.         [ Links ]

3. Ashton C.H. Adverse effects of cannabis and cannabinoids. Brit J Anaesth. 1999;83(4):637- 49.         [ Links ]

4. Baker T.S., Harry J.V., Russell J.W., Lee Myers R. Rapid Method for the GC/MS Confirmation of 11-Nor-9-Carboxy-Δ⁹-Tetrahydrocannabinol in Urine. J Anal Toxicol.1984;8(6):255-259.

5. Buddha D.P., Mell L.D., Mitchell J.M., McKinley R.M. Detection and Quantitation of Urinary 11-Nor-Delta-9-Tetrahydrocannabinol-9-Carboxylic Acid, A Metabolite of Tetrahydrocannabinol, by Capiilary Gas Chromatography and Electron Impact Mass Fragmentograph. J Anal Toxicol. 1987;11(1):1-5.         [ Links ]

6. Bui Q.M., Scott Simpson B.S., Nordstrom K. Psychiatric and Medical Management of Marijuana Intoxication in the Emergency Department. West J Emerg Med. 2015;16(3):414-417.         [ Links ]

7. Campos D.R., Yonamine M., L. de Moraes Moreau R. Marijuana as Doping in Sports. Sports Med. 2003;33(6):395-399.         [ Links ]

8. Carobini Werner de Souza Eller S., Goncalves F., Passos Bismara Paranhos A., da Costa J., Rebello Lourenc F., Yonamine M. Analysis of 11-nor-9-carboxy-Δ⁹-tetrahydrocannabinol in urine samples by hollow fiber-liquid phase microextraction and gas chromatography- mass spectrometry in consideration of measurement uncertainty. Forensic Toxicol. 2014;32:282-291.

9. Chang L., Yakupov R., Cloak C., Ernst T. Marijuana use is associated with a reorganized visual-attention network and cerebellar hypoactivation. Brain. 2006;129:1096-1112.         [ Links ]

10.Congost M., De la Torre A., Segura J. Optimization of the quantitative analysis of the major cannabis metabolite (11-nor-9- carboxy- ,Δ⁹-tetrahydrocannabinol) in urine by GC/ MS. Biomed. Environ. Mass Spectrom. 1988;16:367-72.

11.Curran H.V., Brignell C., Fletcher S., Middleton P., Henry J. Cognitive and subjective dose- response effects of acute oral D 9-tetra-hydrocannabinol (THC) in infrequent cannabis users. Psychopharmacology. 2002;164:61-70.         [ Links ]

12.De Cock K.J.S., Delbeke F.T., De Boer D., Van Eenoo P., Roels K. Quantitation of 11-nor-Ag- Tetrahydrocannabinol- 9-carboxylic acid with GC-MS in Urine Collected for Doping Analysis. J Anal Toxicol. 2003;27(2):106-109.         [ Links ]

13.Foltz R.L., McGinnis K.M., Chinn D.M. Quantitative Measurement of Δ⁹-Tetrahydrocannabinol and Two Major Metabolites in Physiological Specimens Using Capillary Column Gas Chromatography Negative Ion Chemical Ionization Mass Spectrometry. Biomed Mass Spectrom. 1983;10(5):316-323

14.Food and Drug Administration U.S. Department of Health and Human Services, Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. FDA [en linea]. Mayo 2001. [Consulta: diciembre 2013]. Disponible en: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/.../Guidances/ucm070107.pdf.         [ Links ]

15.Gustafson R.A., Moolchan E.T., Barnes A., Levine B., Huestis M.A. Validated method for the simultaneous determination of Δ⁹-tetrahydrocannabinol (THC), 11-hydroxy-THC and 11-nor-9-carboxy-THC in human plasma using solid phase extraction and gas chromatography- mass spectrometry with positive chemical ionization. J Chromatogr B. 2003,798:145-154.

16.Hamilton police service-Crime Prevention. Drug facilitated sexual assault. [en línea]. Abril 2011. [Consulta: diciembre de 2014]. Disponible en http://hamiltonpolice.on.ca/sites/default/files/drugfacilitatedsexualassaultapril42011.pdf.         [ Links ]

17.Hartman R.L., Huestis M.A. Cannabis Effects on Driving Skills. Review. Clin Chem. 2013;59(3):478-492.         [ Links ]

18.Huestis M.A., Cone E.J. Urinary excretion half life of 11-Nor-9-Carboxy-Δ⁹- Tetrahydrocannabinol in humans. Ther Drug Monit. 1998;20(5):570-576.

19.Huestis M.A., Mitchell J.M., Cone E.J. Detection Times of Marijuana Metabolites in Urine by Immunoassay and GC-MS. J Anal Toxicol. 1995;19(6):443- 449.         [ Links ]

20.Huestis M.A., Mitchell J.M., Cone E.J. Urinary Excretion Profiles of 11-Nor-9-Carboxy-Δ⁹- Tetrahydrocannabinol in Humans after Single Smoked Doses of Marijuana. J Anal Toxicol. 1996;20(6):441- 452.

21.International Conference on Harmonization (ICH), Validation of Analytical Procedures: Methodology ICH Q2 B. ICH [en linea] Noviembre 1996. [Consulta: diciembre 2013]. Disponible en http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm073384.pdf.         [ Links ]

22.Joern W.A. Detection of past and recurrent marijuana use by a modified GC/MS procedure. J Anal Toxicol. 1987;11:49-52.         [ Links ]

23.Johansson E., Gillespie H.K., Halldint M.M. Human Urinary Excretion Profile after Smoking and Oral Administration of [14C] Δ1.Tetrahydrocannabinol. J Anal Toxicol. 1990;14(3):176-180.

24.Kaestner R., Grossman M. The effect of drug use on workplace accidents. Labour Econ. 1998;5:267-294.         [ Links ]

25.Karlsson L., Jonsson J., Aberg K., Roos C. Determination of Δ ⁹-Tetrahydrocannabinol- 11-oic Acid in Urine as Its Pentafluoropropyl-, Pentafluoropropionyl Derivative by GC/ MS Utilizing Negative Ion Chemical Ionization. J Anal Toxicol. 1983;7(4):198-202.

26.Kim S.Y., Kim J.Y., Kwon W., In M.K., Kim Y.E., Paeng K. Method development for simultaneous determination of amphetamine type stimulants and cannabinoids in urine using GC-MS. Microchem J. 2013;110:326-333.         [ Links ]

27.McBurney L.J., Bobble B.A., Sepp L.A. GC/ MS and EMIT Analyses for Δ⁹-Tetrahydrocannabinol Metabolites in Plasma and Urine of Human Subjects. J Anal Toxicol. 1986;10(2):56-64.

28.Meatherall R.C., Garriott.J.C. A Sensitive Thin-Layer Chromatographic Procedure for the Detection of Urinary 11-Nor-Δ⁹.Tetrahydrocannabinol. 9-Carboxylic Acid. J Anal Toxicol. 1988;12(3):136-140.

29.Musshoff F., Madea B. Review of Biologic Matrices (Urine, Blood, Hair) as Indicators of Recent or Ongoing Cannabis Use. Ther Drug Monit. 2006;28:155-163        [ Links ]

30.National Institute on Drug Abuse (NIDA). Info- Facts. Visitas a las salas de emergencias por consumo de drogas. Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos— Institutos Nacionales de la Salud, 2011; pp:1-4.

31.Navarro Escayola E., Vega Vega C. Agresiones sexuales facilitadas por sustancias psicoactivas, detectadas en el Instituto de Medicina Legal de Alicante en el cuatrienio 2009- 2012. Gaceta Internacional de Ciencias Forenses, 2013;8:8-15.         [ Links ]

32.Nowatzke W., Woolf E. Best Practices During Bioanalytical Method Validation for the Characterization of Assay Reagents and the Evaluation of Analyte Stability in Assay Standards, Quality Controls, and Study Samples. The AAPS Journal 2007;9(2) Article13:E117-E122.         [ Links ]

33.Peters F.T., Drummer O.H., Musshoff F. Validation of new methods. Forensic Sci Int. 2007;165:216-224.         [ Links ]

34.Ramaekers J.G., Moeller M.R., van Ruitenbeek P., Theunissen E.L., Schneider E., Kauert G. Cognition and motor control as a function of Δ⁹ -THC concentration in serum and oral fluid: Limits of impairment. Drug Alcohol Depen. 2006;85:114-122.

35.Shah V.P. The History of Bioanalytical Method Validation and Regulation: Evolution of a Guidance Document on Bioanalytical Methods Validation. The AAPS Journal 2007;9(1) Article 5:E43-E47.         [ Links ]

36.Smith-Kielland A., Skuterud B., Morland J. Urinary Excretion of 11-nor-9-Carboxy-Δ⁹- Tetrahydrocannabinol and Cannabinoids in Frequent and Infrequent Drug Users. J Anal Toxicol. 1999;23(5):323-332.

37.Solid phase extraction applications manual (2009). Ed. United Chemical Technologies, Inc. Pennsylvania, p.36.         [ Links ]

38.Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). Results from the 2013 National Survey on Drug Use and Health: Summary of National Findings, NSDUH Series H-48, HHS Publication No. (SMA) 14-4863. Rockville, MD: Substance Abuse and Mental Health Services Administration, 2014.         [ Links ]

39.Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs. Federal Register, 2008;73(228):71858-71907.         [ Links ]

40.United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC). Directrices para la validación de métodos analíticos y la calibración del equipo utilizado para el análisis de drogas ilícitas en materiales incautados y especímenes biológicos. ST/NAR/41- Nueva York, 2010.         [ Links ]

41.Wadsworth E.J.K., Moss S.C., Simpson S.A., Smith A.P. Cannabis use, cognitive performance and mood in a sample of workers. J Psychopharmacol. 2006;20(1):14-23.         [ Links ]

42.Whiting J.D., Manders W.W. Confirmation of a Tetrahydrocannabinol Metabolite in Urine by Gas Chromatography. J Anal Toxicol. 1982;6(1):49-52.         [ Links ]

43.Williams P.L. and Moffat A.C. Identification in human urine of Δ⁹-tetrahydro cannabinol- 11-oic acid glucuronide: a tetrahydrocannabinol metabolite. J Pharm Pharmacol. 1980;32:445-448.

44.Williams P.L., Moffat A.C., King L.J. Combined high-performance liquid chromatography and radioimmunoassay method for the analysis of Δ⁹- tetra- hydrocannabinol metabolites in human urine. J Chromatrogr. 1979;186:595-603.

45.Wingert W.E. Lowering cutoffs for initial and confirmation testing for cocaine and marijuana: large-scale study of effects on the rates of drug-positive results. Clin Chem. 1997;43(1):100-103.         [ Links ]

46.World Anti-Doping Agency (WADA) Technical Document. Identification Criteria for qualitative assays. Incorporating chromatography and mass spectrometry. Document Number: TD2010IDCR. 2010, September.         [ Links ]