ARTÍCULOS ORIGINALES

Avaliação da atividade anti-Leishmania e anti-Trypanosoma do extrato etanólico das folhas de Annona squamosa L.

Evaluation of the anti-leishmania and anti-trypanosoma activity of ethanolic extract from the leaves of Annona squamosa L.

 

Sobreira Dantas Nóbrega de Figuêiredo, Francisco Rodolpho¹; de Araújo Delmondes, Gyllyandeson¹; Paulo da Cruz, Luzia¹; Amaro do Nascimento, Érika¹; Relison Tintino Saulo²; Santiago Lemos, Izabel Cristina¹; Bezerra da Cunha, Francisco Assis²; Vega Gomez, Maria Celeste³; Coronel, Cathia³; Martins da Costa, José Galberto⁴; Melo Coutinho, Henrique Douglas²; Bezerra Felipe, Cícero Francisco¹; Alencar de Menezes, Irwin Rose¹; Kerntopf, Marta Regina¹*

¹Laboratório de Farmacologia e Química Molecular, Universidade Regional do Cariri, Crato-CE. Rua Cel. Antônio Luís, 1161, Pimenta, CEP: 63105-00. Fone:+55 (88) 3102 1212; Fax: +55(88)31021291. ²Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular da Universidade Regional do Cariri, Crato-CE. ³Centro para el Desarrollo de la Investigación Científica (CEDIC), Fundación Moisés Bertoni/Laboratorios Díaz Gill, Asunción-Paraguay. ⁴Laboratório de Pesquisa com Produtos Naturais, Universidade Regional do Cariri, Crato-CE.
*martareginakerntopfm@outlook.com

Recibido: 1 de diciembre de 2014
Aceptado: 14 de septiembre de 2016

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Resumo.

As doenças parasitárias, também chamadas de “doenças negligenciadas”, continuam sendo uma grande dificuldade para o desenvolvimento social e econômico dos países mais pobres. Podemos citar como exemplo dessas doenças, a leishmaniose e a doença de Chagas. A leishmaniose é causada por parasitas do gênero Leishmania e afeta cerca de 12 milhões de pessoas. A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, causa aproximadamente 50.000 mortes por ano. Os fármacos disponíveis para o tratamento dessas doenças são altamente tóxicos, sendo este um dos motivos que leva à busca por drogas eficazes e seguras para seus tratamentos. As folhas da Annona squamosa, espécie da família Annonaceae, já foram descritas na literatura por suas atividades hepatoprotetora, antiparasitária, pesticida e antimicrobiana. Nesse estudo avaliamos a atividade anti-leishmania e tripanocida do extrato etanólico das folhas de Annona squamosa L. (EEAS) em formas promastigota do parasita Leishmania braziliensis e Leishmania infantum e epimastigota de Trypanosoma cruzi, além de avaliar a atividade citotóxica em fibroblasto. Os resultados demonstram que o extrato apresentou uma melhor atividade contra Leishmania infantum e Leishmania brasiliensis quando comparados com Trypanosoma cruzi; e que apresentou uma maior toxicidade nas concentrações de 500 e 1000 μg/ml, com mortalidade dos fibroblastos de aproximadamente 85% e 100%, respectivamente. Esse estudo aponta para uma perspectiva terapêutica alternativa que se mostrou eficaz frente aos parasitas aqui estudados, exceto a forma epimastigota de Trypanosoma cruzi. Com relação aos testes de citotoxicidade fazem-se necessários novos testes, uma vez que apresentou um alto nível de toxicidade, viabilizando assim futuros ensaios in vivo.

Palavras-chave: Annona squamosa; Annonaceae; Leishmania; Trypanosoma cruzi.

Abstract.

The parasitic diseases, also calls by “neglected diseases”, continue being a major difficulty for the social and economic development of the poorest countries. We can cite as an example of these diseases, the leishmaniasis and the Chagas disease. Leishmaniasis is caused by parasites of the genus Leishmania and affects about 12 million people. The Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, causes approximately 50,000 deaths per year. The drugs available for the treatment of these diseases are highly toxic, being this one of the reasons that leads to the search for effective and safe drugs for their treatments. The leaves of the Annona squamosa, species of the family Annonaceae, have already been described in the literature by their hepatoprotective activities, antiparasitic, pesticide and antimicrobial. In this study we assessed the activity tripanocidal and antileishmania of ethanolic extract from the leaves of Annona squamosa L. (EEAS) in promastigota forms of the parasite Leishmania braziliensis and Leishmania infantum and epimastigota of Trypanosoma cruzi, in addition to evaluating the cytotoxic activity in fibroblasts. The results demonstrate that the extract presented a better activity against Leishmania infantum and Leishmania brasiliensis when compared with Trypanosoma cruzi; and which presented a greater toxicity at concentrations of 500 and 1000 μg/ml, with mortality of fibroblasts of approximately 85% and 100%, respectively. This study points to an alternative therapeutic perspective that showed effective against the parasites here studied, except the epimastigota form of Trypanosoma cruzi. With relation to cytotoxicity tests are required new tests, once presented a high level of toxicity, thus enabling future in vivo assays.

Keywords: Annona squamosa; Annonaceae; Leishmania; Trypanosoma cruzi.

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Introdução

As doenças parasitárias continuam sendo uma grande dificuldade para o desenvolvimento social e econômico dos países mais pobres e costumam serem chamadas de “doenças negligenciadas”, “doenças órfãs” e/ ou “doenças tropicais” (Nwaka e Ridley 2003).

As doenças negligenciadas continuam a existir por conta das deficiências do conhecimento científico; como também dificuldades enfrentadas pelo mercado, os altos custos de medicamentos ou vacinas e devido às dificuldades de planejamento enfrentadas na saúde pública, medicamentos baratos ou mesmo gratuitos que não são utilizados (MoreL 2006). Tem-se como exemplos de doenças negligenciadas, a doença de Chagas e a leishmaniose (Ministério da Saúde 2010).

A leishmaniose é uma doença que pode acometer homens, mulheres e crianças em muitos países por todo o mundo e que afeta aproximadamente 12 milhões de pessoas. Essa parasitose pode ter vários sintomas clínicos e se apresentar nas formas: cutânea, mucocutânea ou visceral. A Leishmaniose cutânea é a manifestação clínica mais comum e a forma visceral é mais grave, em que os órgãos vitais do corpo são atingidos (WHO 2013). É causada por parasitas do gênero Leishmania, possui ciclo de vida heteroxênico, e têm duas formas morfológicas, promastigota e amastigota (Michalick 2003).

Outra doença parasitária, bastante difundida, é a doença de Chagas. Foi descoberta em 1909 pelo médico brasileiro Carlos Chagas, é um dos grandes problemas sociais e econômicos enfrentados na América Latina. É causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, afeta cerca de 18 milhões de pessoas do sul dos Estados Unidos até a Patagônia. Chega a causar aproximadamente 50.000 mortes por ano, sendo que outros 100 milhões de indivíduos vivem em áreas de risco de contágio (Gelb e Hol 2002; Engels e Savioli 2006).

A história da terapêutica experimental destas doenças tem sido caracterizada por sucessos e fracassos. No tocante a doença de Chagas duas drogas tem relevante destaque, o nifurtimox e o benzonidazol, entretanto estes fármacos sofrem influências diretas de algumas condições, como a duração do tratamento, a idade e a distribuição geográfica dos pacientes, dentre outros (Dias et al. 2009). No caso das leishmanioses cutânea e visceral, mesmo com sua alta toxicidade, os antimoniais pentavalentes têm sido usados como drogas de primeira escolha para tratamento. A anfotericina B lipossomal, pentamidina, paramomicina e miltefosine são drogas de interesse por representarem novas alternativas terapêuticas, porém apresentam significativos problemas como efeitos colaterais, preço do produto e produção da formulação (Pereira et al. 2011).

A Annonaceae é uma família com distribuição predominantemente tropical, que inclui 130 gêneros e 2200 espécies. No Brasil ocorrem 33 gêneros e cerca de 250 espécies. As Annonaceae ocorrem em praticamente todas as formações naturais do Brasil, com destaque para Xylopia aromatica (pimenta-de-macaco) e Annona crassiflora (marolo) nos cerrados, que servem como fonte de renda para populações locais. A pinha-ata ou fruta do conde (Annona squamosa) e a graviola (Annona muricata) são espécies originárias da América Central, frequentemente cultivadas no Brasil, em especial no Nordeste, com frutos que são consumidos in natura ou na forma de sucos e sorvetes (Souza e Lorenzi 2008).

O gênero Annona inclui aproximadamente 140 espécies tropicais com várias espécies nativas sendo conhecidas popularmente por fruta-do-conde, pinha, graviola, beribá e cabeça de negro. As espécies mais comuns no Brasil são Annona muricata, Annona cherimola, Annona coriacea, Annona reticulata, Annona tenuiflora e Annona squamosa (Hiruma- Lima e Di Stasi 2003). As folhas da Annona squamosa foram descritas na literatura tendo como propriedades as atividades: hepatoprotetora (Raj et al. 2009); antiparasitária (Fernandes et al. 2009); pesticida e antimicrobiana, sendo que sua atividade antimicrobiana está relacionada a presença de flavonóides (Kotkar et al. 2001; Patel e Kumar 2008). Este trabalho tem como objetivo avaliar atividade antiLeishmania e tripanocida do extrato etanólico das folhas de Annona squamosa L. em formas promastigota do parasita Leishmania braziliensis e Leishmania infantum e epimastigota de Trypanosoma cruzi, além de avaliar a atividade citotóxica em fibroblasto.

Metodologia

Material botânico

As folhas da espécie Annona squamosa utilizadas em nossos experimentos foram coletadas no Distrito Ponta da Serra situado no município de Crato–CE. Uma amostra representativa da espécie, contendo flor e fruto, foi depositada e identificada no Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) da Universidade Regional do Cariri–URCA, sob o registro #5539.

Preparação do extrato

O extrato etanólico foi obtido pelo método de extração exaustiva à frio (Matos 1997). Foram utilizadas folhas frescas de Annona squamosa (275 g), que foram previamente trituradas e submetidas à extração com etanol P.A. por 72 h. Em seguida o solvente foi destilado em evaporador rotativo a 80º C sob pressão reduzida, sendo o extrato bruto obtido pesado (10,2g) e armazenado a temperatura ambiente.

Linhagens celulares utilizadas

Para os testes in vitro de T. cruzi, foi utilizado o clone CL-B5 (Buckner et al. 1996). Os parasitos, transfectados de forma estável com o gene para a β-galactosidase de Escherichia coli (lacZ), foram fornecidos pelo Dr. F. Buckner através do Instituto Conmemorativo Gorgas (Panamá). As formas epimastigotas foram cultivadas a 28º C em Meio de cultura Liver Infusion Tryptose Broth (Difco, Detroit, MI), suplementado com Soro Fetal Bovino 10% (SFB) (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina (Ern, S.A., Barcelona, Spain) e estreptomicina (Reig Jofr´e S.A., Barcelona, Spain), conforme descrito por Le Senne et al. (2002). As células foram coletadas para os testes na fase exponencial de seu crescimento.

Culturas de Leishmania spp. foram obtidas do Instituto de Investigaciones en Ciências de la Salud, Asunción, Paraguay - IICS e identificadas por análise isoenzimática. A manutenção das linhagens, forma de cultivo e isolamento das formas promatigotas de Leishmania spp. seguiram os procedimentos descritos por Roldos et al. (2008). Os ensaios de inibição das formas promastigotas foram realizados utilizando as linhagens de L. braziliensis (MHOM/CO/88/UA301) e L. infantum (MHOM/ES/92/BCN83), cultivadas a 22 °C em meio Schneider’s Drosophila, suplementado com SFB 20%.

Os ensaios de citotoxicidade utilizaram a linhagem de fibroblastos NCTC929, cultivada em Minimal Essential Medium (Sigma). O meio de cultura foi suplementado com SFB inativada por calor (10%), penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL). As culturas foram mantidas a 37º C em atmosfera úmida com 5% de CO2. A viabilidade destas linhagens foi avaliada através do uso da resazurina como método colorimétrico (Rolón et al. 2006).

Reagentes

Resazurina sódica foi obtida da Sigma–Aldrich (St Louis, MO) e estocada a 4 ºC ao abrigo da luz. A solução de resazurina foi preparada com tampão fosfato 1%, pH 7 e esterilizada por filtração antes de ser utilizada. O Clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosídio (CPRG; Roche, Indianapolis, IN) foi dissolvido em uma solução de Triton X-100 0,9% (pH 7.4). Penicilina G (Ern, S.A., Barcelona, Spain), estreptomicina (Reig Jofré S.A., Barcelona, Spain) e Dimetilsulfóxido (DMSO) também foram utilizados.

Teste de atividade antiepimastigota

O teste foi realizado em microplacas com 96 cavidades, com culturas na fase exponencial, conforme descrito por Vega et al. (2005). Epimastigotas foram inoculados em uma concentração de 1 x 10⁵ mL-1 em 200 μL de caldo de fígado triptose. As placas foram então incubadas com as drogas nas concentrações de 100 e 500 μg/mL a 28 °C por 72 h. Após este tempo, foram adicionados 50 μL da solução de CPRG, de forma a atingir uma concentração final de 200 μM. As placas foram incubadas por um tempo adicional de 6 h a 37 ºC e foram submetidas a visualização sob 595nm. Cada experimento foi realizado duas vezes e de forma independente, tendo sido cada concentração testada em triplicata em cada experimento. A eficiência de cada composto foi estimada através do cálculo do percentual de atividade antiepimastigota (AE%).

Teste de atividade antipromastigota

Culturas de formas promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram cultivadas até uma concentração de 106 células/mL e então transferidas para o teste. Os compostos foram dissolvidos em DMSO até as concentrações a serem testadas e foram transferidos para as microplacas. Cada ensaio foi realizado em triplicata. A atividade dos compostos foi avaliada após 72 h por contagem direta das células após diluições seriais e comparadas com um controle não tratado.

Teste de citotoxicidade

Fibroblastos NCTC929 foram plaqueados em placas de microdiluição de 96 cavidades a uma concentração final de 3 x 10⁴ células/cavidade. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera com 5% de CO2. Após isso, o meio de cultura foi removido e os compostos foram adicionados a 200 μL, sendo realizado um novo cultivo por 24 h. Após esta incubação, 20 μL de uma solução de Resazurina 2 mM foi adicionada em cada cavidade. As placas foram incubadas por 3h e a redução da resazurina foi determinada através de dupla absorbância nos comprimentos de onda de 490 e 595 nm. O valor do controle (branco) foi subtraído. Cada concentração foi testada em triplicata.

Análise estatística

A concentração efetiva (CE₅₀) e concentração letal (CL₅₀) foram calculadas pelo software Probitos Tsk version 1.5.

Resultados

A atividade citotóxica, antiLeishmania e tripanocida do EEAS são exibidas na Tabela 1. O extrato apresentou uma maior toxicidade nas concentrações de 500 e 1000 μg/ml, com mortalidade dos fibroblastos de aproximadamente 85% e 100%, respectivamente.

Tabela 1. Atividade antipromastigota L. infantum e L. brasiliensis, atividade antiepimastigota T. cruzi e citotoxicidade.

No tocante à avaliação da atividade antiparasitária, o EEAS foi testado nas concentrações de 125, 250, 500 e 1000 μg/ml. Obtivemos uma melhor atividade contra as formas promastigotas de L. infantum e L. brasilienses nas concentrações de 500 a 1000 μg/ml, com uma taxa de mortalidade de 83,30 e 95,07% de L. infantum, respectivamente, e de 58,97 e 98,06% de L. brasiliensis, respectivamente.

Já frente a T. cruzi, obtivemos um maior percentual de mortalidade na concentração de 1000 μg/ml, o qual matou 27,88% dos parasitas. Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados foram expressos como média das repetições.

Na análise estatística, calculamos os valores da CE₅₀ do EEAS frente aos parasitas L. infantum e L. brasilienses e obtivemos os seguintes valores: 186,61 μg/ml e 284,73 μg/ml, respectivamente. Já referente à T. cruzi, não foi possível calcular a CE₅₀ devido os baixos percentuais de mortalidade nas concentrações testadas. Outro valor calculado c foi o da CL50 frente aos fibroblastos, onde observamos que a CL₅₀ do EEAS é de 260,14 μg/ml.

Discussão

Os produtos naturais oferecem novas fontes e perspectivas na busca de novos compostos com potencial clínico-terapêutico. Pesquisas com fitoterápicos tem revelado o grande potencial na busca de novas substâncias para combater as doenças negligenciadas (Rondon et al. 2012) dentre elas, a doença de Chagas e a leishmaniose (ministério da Saúde 2010). Entretanto, para que novos fármacos sejam disponíveis para o tratamento dessas doenças em humanos é necessário que se faça uma avaliação prévia desses compostos in vitro e in vivo (Soares-Bezerra et al. 2004), os quais são executados em diferentes etapas. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), para que um candidato seja testado in vivo, inicialmente devemos submetê-los a ensaios in vitro de citotoxicidade e atividade antiparasitária, após realizar essa primeira triagem os resultados devem ser analisados para definir essa possibilidade (Dias et al. 2009).

Os resultados demonstram que o extrato etanólico de Annona squamosa apresentou uma melhor atividade contra L. infantum e L. brasiliensis quando comparados com T. cruzi. O extrato, numa concentração de 250 μg/ ml, apresentou um percentual de mortalidade de L. infantum e L. brasiliensis de 66,59 e 55,40%, respectivamente, dado importante visto que uma inibição neste nível com uma concentração de 250 μg/mL é considerado clinicamente relevante (Rosas et al. 2007). Outras espécies do gênero Annona já foram descritas na literatura por possuir atividade leihmanicida, podemos citar como exemplo, Annona muricata (Vila-Nova et al. 2011), Annona mucosa (De-Lima et al. 2012) e Annona cornifolia (Lima et al. 2014)

Levando a expressividade dos resultados tripanocidas, vale ressaltar que embora o extrato em questão não tenha apresentado resultado favorável, tal qual apresentou sobre as espécies de Leishmania, já foram evidenciados vários metabólitos secundários de diferentes padrões estruturais que têm se mostrado ativo contra T. cruzi (Saúde-Guimarães e Faria 2007); a triagem de extratos de plantas é uma estratégia válida, sendo explorados para descobrir agentes tripanocidas (Luize et al. 2006; Pizzolatti et al. 2008).

Um importante critério na procura por compostos ativos com atividade tripanocida e leishmanicida é a avaliação da citotoxicidade em células do hospedeiro. A atividade citotóxica de outras plantas foram avaliadas em diferentes modelos de células humanas, tais como: linfócitos humanos (Reyes-Chilpa et al. 2008), células MRC-5 (Cabral et al. 2010) e macrófagos peritoneais (Houghton et al. 2007).

Os resultados obtidos apontam para uma perspectiva terapêutica alternativa que se mostrou eficaz frente aos parasitas aqui estudados, exceto a forma epimastigota de T. cruzi. Com relação aos testes de citotoxicidade fazem-se necessários novos testes, uma vez que apresentou alto nível de toxicidade, viabilizando assim futuros ensaios in vivo.

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