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Phyton (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1851-5657

Phyton (B. Aires) v.73  Vicente López ene./dic. 2004

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Cambios bioquímicos inducidos por etilenglicol, etanol y acido acetilsalicilico en plantas de naranjo (Citrus sinensis (L) Osbeck), bajo condicionesde temperatura controlada (con 4 figuras)

Salazar-Salazar Ovidio1, Jorge Rodríguez-Alcázar2

1Universidad Autónoma de Tamaulipas. U.A.M. Agronomía y Ciencias, Centro Universitario "Adolfo Ruíz Cortínez" CD. Victoria, Tamaulipas, México. E-mail: osalazar@uat.edu.mx
2Colegio de Postgraduados. Montecillo, Edo. de México. E-mail: joroal@colpos.colpos.mx

Recibido 04.II.2004: aceptado 26.III.2004

Resumen. El efecto bioquímico del etilenglicol (ETG 1 y 2M), metanol (MET 10 y 20%) y el ácido acetilsalicílico (ASA 10-3 y 10-2 M) se evaluó en plantas de naranjo 'Navelina' de dos años de edad, después de 12/12 horas a la temperatura 15 ºC/26 ºC; 10 ºC/26 ºC; 5 ºC/26 ºC y 5 ºC/26 ºC cámara/ambiente. Entre cada nivel de temperatura cámara/ambiente, se muestrearon hojas de edad adulta de la sección intermedia del árbol y se determinó el contenido de ácidos grasos, carbohidratos, proteína y clorofila. El contenido de ácidos grasos saturados e insaturados fue diferencialmente afectado por las aplicaciones en las diversas temperaturas. Los azúcares totales son disminuidos por el ETG e incrementados 52.7% a 10 ºCpor el ASA 10-3 M y MET 10%. A -5 ºC, el MET 10% y 20% incrementan los azúcares totales en 165 y 244% respectivamente y los reductores en 84% por MET 20%. El porcentaje de proteína total fue incrementado 45% a 5 ºC por el MET 10% y los pigmentos fotosintéticos no fueron afectados en su contenido por las aplicaciones.

Palabras clave: Citrus, ácidos grasos, carbohidratos, proteína, clorofila, estrés por congelamiento.

Abstract. The biochemical effect of etyleneglicol (ETG 1 and 2M), methanol (MET 10 and 20%) and acetylsalicylic acid (ASA 10-3 y 10-2 M) was evaluated on two year old 'Navelina' orange trees, after 12/12 hours chamber/external temperatures: 15 ºC/26 ºC; 10 ºC/26 ºC; 5ºC/26 ºC and 5ºC/26 ºC. Between each chamber/natural temperature levels, adult leaves were sampled from tree middle section and fatty acid, carbohydrates, protein and chlorophyll content were determined. The saturated and unsaturated fatty acid content was differentialy affected by chemical applications at evaluated temperatures. The total sugars decreased by ETG and increased about 52.7% at 10 ºC by ASA 10-3 M y MET 10%. At -5 ºC, total sugar were increased about 165 and 244% by MET 10% and MET 20% respectively and the reducing sugars about 84% by MET 20%. The protein content was increased 45% at 5 ºC by MET 10%. The content of pigments was not affected.

Key words: Citrus, fatty acid, carbohydrates, protein, chlorophyll, freezing stress.

   La aclimatación al frío es un proceso complejo que involucra la adaptación de funciones celulares y metabólicas básicas para el forzado biofísico impuesto por la baja temperatura, lo que permite la inducción de la tolerancia al frío (5). La síntesis de proteínas asociada a la inducción de tolerancia al frío ha sido investigada en algunas especies (6); el contenido de lípidos y su relación con la congelación de tejidos vegetales (19); el efecto de la aclimatación a la baja temperatura y su relación con la actividad fotosintética (3) así como la síntesis y acumulación de carbohidratos en condiciones de temperatura subóptima en algunas especies (18).
   
En las especies cítricas, se han dirigido considerables esfuerzos para determinar los cambios fisiológicos y bioquímicos que ocurren cuando las plantas son sometidas a condiciones de temperatura muy por debajo del óptimo de crecimiento (20, 21, 12, 13, 14). El potencial de algunos productos químicos para minimizar el daño ocasionado por frío cuando éstos son asperjados a las plantas ha sido evaluado en algunas especies, incluyendo a los cítricos (9, 22). Las aspersiones foliares deetilenglicol, metanol y ácido acetilsalicílico, cuando se aplican a los cítricos bajo condiciones de campo tienen un efecto interesante sobre el metabolismo de la planta al favorecer la acumulación de carbohidratos y modificar la relación entre ácidos grasos saturados e insaturados (14) y de incrementar la temperatura del tejido y la fotosíntesis durante una baja temperatura ambiental (12).
   
Esta investigación tuvo como objetivo evaluar los cambios bioquímicos inducidos por las aspersiones foliares de etilenglicol, metanol y ácido acetilsalicílico en plantas de cítricos a diferente temperatura controlada.

MATERIALES Y METODOS

   La investigación fue realizada en el Colegio de Postgraduados, en Montecillo, México; localizado a los19º29' LN y 98º54' LW, a 2240 msnm; con una temperatura media anual de 15 ºC y 645 mm de precipitación.
   
Como material vegetal se utilizaron plantas de naranjo dulce (C. sinensis L. Osbeck) cv. 'Navelina', injertadas sobre limón rugoso (C. jambhiri.), de dos años de edad que desarrollaron en condiciones de intemperie en recipientes plásticos de 20 litros de capacidad, con un substrato de 60% de tierra de monte, 30% de agrolita y 10% de arena, donde se les proporcionó riego, fertilización y control fitosanitario para su crecimiento.
   
El etilenglicol (ETG), metanol (MET) y ácido acetilsalicílico (ASA) fueron utilizados en dos concentraciones: ETG, 1 y 2 M; MET, 10 y 20% y el ASA a 10-2 y 10-3 M así como un tratamiento testigo, cuya aplicación fue solamente agua destilada. Cada tratamiento se aplicó a tres plantas mediante un atomizador manual hasta alcanzar un mojado homogéneo.
   
Doce horas después de aplicados los tratamientos químicos (8:00 p.m.), las plantas asperjadas fueron colocadas en una cámara de refrigeración, donde recibieron tratamientos de 12/12 h a las siguientes temperaturas cámara/ambiente: 15 ºC/26 ºC; 10 ºC/26 ºC; 5 ºC/26 ºC y 5 ºC/26 ºC. Al término de cada nivel de temperatura de la cámara, se efectuaron muestreos de hojas adultas de la sección media de la planta. Las muestras fueron colectadas en bolsas de papel e inmediatamente llevadas al laboratorio donde el polvo y otras partículas superficiales fueron eliminados con agua desionizada y puestas secar a 65 ºC durante 48 h. Lassiguientes variables bioquímicas fueron evaluadas en base a peso seco:
   
Contenido de ácidos grasos. Palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoléico (18:2) y linolénico (18:3). Estos fueron extraídos con hexano, se le adicionó metilato de sodio para la reacción y cuantificados mediante un cromatógrafo de gases Varian modelo 3700, se utilizó una columna Cromosorb WHP80-100, de 2m ´ 1/8" ss, la temperatura de la columna fue de 180 ºC.
   
Contenido de carbohidratos. Se extrajeron con etanol 80% de acuerdo con la secuencia descrita por Peña-Valdivia y Ortega-Delgado (1991). Los azúcares totales se determinaron por el método de la antrona y los reductores indirectos por el método de Nelson-Somogyi (Neufeld y Ginsburg, 1966).
   
Porcentaje de proteína total. El contenido de proteína en términos de porcentaje fue calculado mediante la determinación de N total con un equipo Tecator Kjeltec modelo 1030 y éste multiplicado por el factor 6.25 (Anónimo, 1984).
   
Pigmentos fotosintéticos. En tejido vegetal fresco, se midió, en cada nivel de temperatura de la cámara, el contenido de clorofila a, b y carotenos. La extracción de estos pigmentos fue con acetona al 80% (v/v) y cuantificados por colorimetría. La absorbancia de la clorofila a, b y carotenos fue medida a una longitud de 664, 647 y 436 nm respectivamente, con un espectrofotómetro Spectronic 21 de Fisher Scientific (Boyer, 1990).
   
Diseño experimental. Fue utilizado un diseño completamente al azar, con tres repeticiones y una planta como unidad experimental. Se usó la prueba de comparación de medias de Tukey. Se efectuó un análisis de regresión de las variables dependientes en función de la temperatura y se determinó la correlación entre ellas. El análisis fue realizado mediante el paquete estadístico SAS.

RESULTADOS Y DISCUSION

   Contenido de ácidos grasos. A 15 ºC los tratamientos químicos afectaron el contenido de los ácidos palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1) y linolénico (18:3). El ácido 16:0 fue reducido 22% por los tratamientos MET 20% y ASA 10-2 M con respecto al testigo.El ETG 1M incrementó 1.9% el nivel de 18:0; el de 18:1 en 148% y redujo 21% el ácido 18:3. El ASA 10-2 M redujo 16:0 e incrementó 18:3.
   
A 10 ºC, el ETG 2M redujo significativamente el contenido de 16:0, e incrementó 74% el 18:1. En tanto que ASA 10-3 M aumentó el 16:0 y 18:2 en 20 y 5.3% respectivamente y redujo 2.5% el 18:3.
   
En el nivel de temperatura de 5 ºC, los tratamientos químicos afectaron solamente el contenido de los ácidos saturados. El MET 20%, estimuló la acumulación del ácido palmítico 9% mas que el testigo, en tanto que el tratamiento de ASA 10-3 M tuvo un efecto contrario al MET al reducir el contenido de ácido palmítico en 6.5%. El ácido esteárico fue inhibido totalmente en su acumulación por las aplicaciones de ETG 1M y el porcentaje más alto de este ácido lo indujo ETG 2M, con 92% más que el testigo.
   
El ASA en sus dos concentraciones utilizadas y el MET 20% también incrementaron el porcentaje de 18:0 en 58 y 33% respectivamente
   
A -5 ºC, todos los tratamientos químicos incrementaron el contenido de 16:0, el ASA 10-3 M indujo el mayor incremento (18.4%), el resto de los tratamientos lo incrementaron en menor proporción. Contrariamente, el ácido 18:2 fue reducido por todos los tratamientos y fue el MET 10% el que lo redujo en mayor proporción(18.0%).El ácido 18:3 fue ligeramente incrementado (1.2%) por MET 10% y ASA 10-2 M y reducido 4.5% por ETG 1M.
   
Un análisis de regresión de las variables dependientes ácidos grasos y la variable independiente temperatura de la cámara, indica que la aplicación de ETG 1M y MET 10%, incrementa el contenido de ácido linoléico conforme desciende la temperatura de la cámara, hasta llegar a una temperatura crítica de 5 y 4 ºC respectivamente,a partir de la cual, cualquier descenso de temperatura induce la disminución del contenido de ácido linoléico . El ASA 10-2 M, con una r2=0.85, reduce el contenido de ácido linolénico cuando la temperatura de la cámara es mayor de 3 ºC y lo incrementa cuando ésta es menor (Figura 1).

   En condiciones de temperatura controlada, la aplicación de MET 20% reduce, con una r2=0.87, el contenido de ácido palmítico, de acuerdo a la reducción de temperatura; sin embargo cuando ésta desciende por debajo de 2.5 ºC, el contenido de ácido se incrementa ligeramente, aun abajo de -5 ºC. Un efecto mucho mas marcado se observa con la aplicación de ASA 10-3 M, cuya acumulación de ácido palmítico es estimulada a 7 ºC (Figura 2), lo que puede ser atribuido a la saturación de los ácidos oleico y linoleico, los cuales disminuyen en función de un descenso de temperatura por las aplicaciones de metanol.

   Durante la aclimatación al frío hay una tendencia general a incrementar los lípidos totales, fosfolípidos y ácidos grasos insaturados. Se ha observado que en algunas especies de Solanum, los lípidos se incrementan durante la aclimatación al frío y en algunas otras su nivel permanece más o menos constante (4).
   
En Chlorella, las células aclimatadas tuvieron un marcado incremento en el contenido de ácidos palmítico, oleico, linoleico y linolénico (7). La importancia del ácido linolénico en los cereales ha quedado de manifiesto por la disminución en la tolerancia al frío cuando las plantas fueron asperjadas con un inhibidor de la síntesis del ácido linolénico (17).
   
Los resultados en esta investigación, muestran que algunos de los productos aplicados incrementan el contenido de ácidos grasos insaturados y reducen el nivel de ácidos saturados, así por ejemplo el ETG, a 15 y 10 ºC, reduce el nivel de 16:0 pero incrementa el de 18:1 considerablemente. A diferencia de los resultados obtenidos bajo condiciones de campo a esta misma temperatura, es el 18:3 el que se incrementa aparentemente a expensas de una disminución de 16:0 (14). A 10 ºC, el ASA 10-3 M aumentó el 16:0 y 18:2 pero a expensas de disminuir 18:3. El MET 10% fue el producto que logró un aumento en el contenido de ácido palmítico y linolénico de manera simultánea, a la temperatura mas baja evaluada en esta investigación. Esto es importante porque los lípidos de las membranas de las plantas resistentes a frío tienen una mayor proporción de ácidos grasos insaturados que aquellas especies sensibles. Estos hacen que la temperatura a la cual los lípidos de la membrana inician la fase de transición de la fase líquida a gel sea menor, lo que confiere cierto grado de protección a la célula contra la congelación.
   
Contenido de carbohidratos. a) Azúcares totales. A 15 ºC todos los tratamientos químicos aplicados redujeron significativamente el contenido de azúcares totales en el tejido foliar. El ETG 1M mostró el mayor efecto en esta reducción al disminuir los azúcares de 45.7 a 14.7 mg g-1de materia seca. A 10 ºCel ASA 10-3 M y el MET 10% los incrementaron 52.7% y el ETG 1M los redujo 47%. A 5 ºC los azúcares totales fueron incrementados en relación al testigo en 86, 65, 31 y 42% por el MET 20%, MET 10%, ETG 2M y ETG 1M respectivamente. A -5 ºC El MET 20% aumentó el contenido de azúcares totales en 244% y por el MET 10% en 165%, con relación al tratamiento testigo.
   
El análisis de regresión del contenido de azúcares totales en función de la temperatura, indica que éstos son acumulados conforme desciende la temperatura, alcanzan su máxima acumulación a 5 ºC (Figura 3).

   b) Azúcares reductores. A 15 ºC los azúcares reductores como lafructosa se incrementaron únicamente por ASA 10-3 M en 9.7% con relación al testigo; el resto de los tratamientos mostraron una reducción significativa de éstos aunque en proporción menor al porcentaje incrementado por ASA. A diferencia de ello, a 10 ºC los tratamientos de ETG 2M, MET 10%, ASA 10-3 M`y ASA 10-2 M incrementaron el contenido de azucares reductores entre 38 y 65%, con mayor efecto del ETG 2M. En esta temperatura, la aplicación de ETG 1M los redujo 50% con respecto al testigo.
   
El ETG 1M indujo 33% mas azúcares que el testigo a una temperatura de 5 ºC y a excepción del MET 20%, el resto de los tratamientos los redujeron aunque en porcentajes relativamente bajos. Cuando la temperatura fue de -5 ºC todos los tratamientos aumentaron el contenido de estos azúcares en un rango de 22% (ASA 10-3 M) y 84%, inducido por MET 20%. La regresión de esta variable por temperatura muestra que los azúcares reductores tienden a acumularse cuando desciende la temperatura y el MET 20% estimula esta acumulación a partir de 7 ºC (Figura 4).

   Los resultados obtenidos con temperatura controlada, indican que hay una tendencia a incrementar el contenido de azúcares no reductores conforme desciende la temperatura y esta acumulación disminuye a 5 ºC, de manera similar a la observada bajo condiciones de campo (14).
   
En la condición de temperatura controlada, los azúcares reductores presentaron contenidos ligeramente superiores a los observados en la condición de campo y su acumulación continua aún a la temperatura de -5 ºC, en ambas condiciones.
   
Se ha observado que los diferentes productos químicos utilizados como crioprotectores presentan diferente grado de eficiencia. El mecanismo por el cual los compuestos individuales evitan o previenen el daño por frío o congelamiento en las biomembranas no es del todo conocido. La acción coligativa de los solutos parece ser el punto primario en la protección de las membranas por ejemplo, el incremento en la concentración de solutos compatibles en las membranas reducirá la concentración de compuestos potencialmente tóxicos en la fracción residual no congelada (16).
   
La acumulación de carbohidratos observada coincide con lo reportado por Sakai y Larcher (11), en el sentido de que los carbohidratos (con frecuencia la sacarosa) y los aminoácidos(generalmente la prolina), se acumulan durante la aclimatación al frío. La importancia de que MET 20% incremente la acumulación de azúcares totales mas de 240% y el MET 10% en 165%, radica en la capacidad que éstos tienen para proteger la fosforilación y la formación del gradiente de protones durante la baja temperatura (15).
   
Posiblemente la diferencia en la propiedad de permeabilidad de los solutos afecte la preservación de las membranas. Mientras algunos productos como el glicerol puede fácilmente penetrar la membrana de los cloroplastos, el paso de la sacarosa en los tilacoides es extremadamente bajo (8) lo que puede ayudar a evitar la acumulación de solutos potencialmente tóxicos en ambos lados de la membrana o puede mantener cierto equilibrio en su potencial osmótico.
   
Porcentaje de Proteína total. Se observó un efecto de los tratamientos a la temperatura de 5 ºC. En ella, todos los tratamientos incrementaron el nivel de proteína en el tejido foliar, en porcentajes que fluctuaron entre 17.8 (inducido por el ETG 1M) y 45% (estimulado por MET 10%). Sin embargo, de manera similar al efecto de la aplicación de estos agentes químicos bajo condiciones de campo (14), el contenido de proteína total no fue diferente entre tratamientos.
   
La estabilidad observada en el contenido de proteína en los diferentes niveles de temperatura evaluados, indica que es necesario un análisis cualitativo de ésta, así como una cuantificación de las proteínas solubles o una extracción de éstas a nivel de membrana y no como proteína cruda en el total del tejido, dado que el primer efecto de la baja temperatura se manifiesta inicialmente en esas estructuras.
   
Contenido de pigmentos fotosintéticos. El contenido de los pigmentos fotosintéticos varió de 2.7 a 5.8 mg cm-2 de tejido foliar en clorofila a; la clorofila b entre 1.7 y 3.8 mg cm-2 y los carotenos entre 0.7 y 1.7 mg cm-2, el análisis de la información indica que el contenido de pigmentos fotosintéticos en las hojas de cítricos, en los diferentes niveles de temperatura, no fue influenciado de manera significativa por ninguno de los tratamientos químicos asperjados. Este resultado sugiere que no es el contenido de clorofila el factor limitante bajo una condición de baja temperatura sino la eficiencia con que los fotosistemas responden a la luz, de manera que puede ser el transporte de electrones el que se ve afectado a nivel reacciones de oxido reducción por los aceptores y donadores de electrones, de acuerdo a lo reportado por Briantais et al. (3).

CONCLUSIONES

   Las aplicaciones foliares de ETG 1M y MET 10%, a cítricos, tienden a incrementar el contenido de ácido linolénico conforme desciende la temperatura, hasta una temperatura crítica de 4 ºC, a partir de la cual cualquier descenso en ella induce una reducción en el contenido de este ácido.
   
El Metanol al 20%, reduce el contenido de ácido palmítico a temperaturas superiores a 2.5 ºC y lo incrementa a temperaturas inferiores a ésta, aun abajo de -5 ºC.
   
El metanol disminuye el contenido de los ácidos grasos insaturados oleico y linoleico, conforme la temperatura desciende de 15 ºC.
   
El ácido acetilsalicílico (10-2 M), aumenta el contenido de ácido linolénico a temperaturas menores de 3 ºC.
   
Los azúcares totales y reductores son incrementados por el metanol y los azúcares reductores se incrementan conforme la temperatura disminuye.
   
El contenido de pigmentos fotosintéticos en las hojas de cítricos, en los diferentes niveles de temperatura evaluados, no es influenciado por las aplicaciones de ETG, MET y ASA.

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