ARTÍCULOS ORIGINALES

Caracterización de variedades y lineas élite de papa (Solanum tuberosum L.) en México utilizando marcadores RAPD y SSR (con 4 figuras y 4 cuadros)

Orona-Castro F¹, V Pecina-Quintero², MA Rocha-Peña³, VM Parga-Torres⁴, O Martínez de La Vega⁵, IH Almeyda-León³

¹Estudiante de Doctorado en la F.C.B.-U.A.N.L.
²Investigador del C. E. Río Bravo. CIRNE - INIFAP
³Investigador del C.E. General Terán. CIRNE-INIFAP.
⁴Investigador del C.E. Saltillo. CIRNE-INIFAP.
⁵ Investigador del CINVESTAV - Irapuato

Recibido 12.V.2004; aceptado 29.VI.2004

Resumen. Se colectaron ocho variedades comerciales y siete líneas avanzadas de papa para su caracterización molecular mediante las técnicas de RAPD´s y SSR´s. En la técnica de RAPD's se evaluaron de manera individual 16 iniciadores y 9 combinaciones con diferentes proporciones de guanina-citosina (G-C) como nucleótidos selectivos. En la técnica de SSR´s se evaluaron seis pares de iniciadores, los cuales se seleccionaron con base en el número de genotipos que pueden diferenciar. Las relaciones genéticas entre genotipos se calcularon por el método de similitud genética de Nei y Li, usando el paquete de software S-Plus Versión 4.0. La matriz de distancias generada se utilizó para producir un dendrograma por medio del método UPGMA. En la técnica de RAPD´s se observaron un total de 395 fragmentos, de los cuales el 70.94% fueron polimórficos. En la técnica de SSR´s se obtuvieron un total de 79 fragmentos, de los cuales el 88.61% fueron polimórficos. Mediante las dos técnicas se diferenciaron los 15 genotipos y por medio del análisis de similitud genética de Nei y Li, se generaron dendrogramas, encontrándose diferencias en la forma de agrupamiento de los diferentes genotipos evaluados.

   En México se siembran anualmente alrededor de 63,762 ha de papa (Solanum tuberosum L.), con una producción de 1,500,000 ton/año. Los principales estados productores son Chihuahua, Coahuila, Guanajuato, Jalisco, Michoacán, Nuevo León, Sinaloa, Sonora, y Zacatecas. En la región de Coahuila y Nuevo León, se cultiva el 7% de la superficie nacional con un rendimiento promedio de 30-40 ton/ha (SAGARPA^a , 2002).
   A pesar de que México no es la zona de origen de la papa, existe una gran diversidad de germoplasma de este cultivo. Ferroni (11), distingue tres grupos de variedades de papa en México: genotipos de Holanda, EUA, y las variedades mejoradas generadas por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). El primer grupo representa alrededor del 50% del cultivo nacional (variedad alpha), el segundo el 38% y el último alrededor del 8%. Los dos centros principales de diversidad y producción de papas nativas o criollas en México son el Nevado de Toluca y el Pico de Orizaba. Ambos picos volcánicos son fértiles con grandes extensiones de tierra, con una altura sobre el nivel del mar de 2900 a 3400 metros. Ambas regiones son los centros de origen de 17 cultivares de Solanum tuberosum, sin embargo, solo seis de los genotipos clonales presentan amplia adaptación en México. El gran endemismo de esos cultivares, así como la gran diversidad morfológica presentes en el Nevado de Toluca y el Pico de Orizaba, sugieren que estas regiones son los primeros centros de variabilidad genética de papa en México (32).
   Aunque en la actualidad existe un gran número de colecciones de germoplasma con genotipos de un alto valor agronómico, susceptibles de ser usados en los programas de mejoramiento genético; en muchas ocasiones se desconoce el grado de diversidad y la relación existente entre materiales lo que impide su utilización (5); por lo cual el análisis de su diversidad genética y relaciones entre especies o dentro de ellas siempre ha sido un objetivo de los investigadores.
   Históricamente los estudios de diversidad genética han estado relacionados con datos como la anatomía comparativa, morfología, embriología y fisiología. Sin embargo, la influencia ambiental y el reducido número de genes involucrados en este proceso han limitado el uso de estos marcadores. Actualmente, los avances de la biología molecular ha permitido el uso de técnicas que permiten detectar cambios en el genotipo mediante el diagnóstico del DNA (13). Este tipo de marcadores moleculares han permitido conocer la estructura de las poblaciones en animales, plantas y microorganismos. Asimismo, han sido útiles en estudios de taxonomía, migración, y filogenia de fitopatógenos. Además permiten estudiar el origen y la evolución de las razas dentro de una población facilitando la identificación de genes de interés y la construcción de mapas genéticos (18).
   En la actualidad se ha generado un gran numero de marcadores moleculares entre los que destacan los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permiten amplificar secuencias específicas o al azar del DNA y requieren de pequeñas cantidades iniciales del mismo.Entre estos marcadores están los denominados polimorfismos del DNA amplificados al azar (RAPD = por sus siglas en inglés "random amplified polymorphic DNA") y los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSR = por sus siglas en inglés, "simple sequence repeats").El método RAPD´s es un sistema de marcadores que utiliza oligonucleótidos cortos, de secuencias arbitrarias y de baja astringencia que permiten amplificar fragmentos discretos de DNA mediante la técnica de PCR (34, 35). Los análisis RAPD´s son rápidos, económicos y fáciles de realizar; han sido extensamente utilizados para diversos estudios genéticos como el análisis de variación genética de bacterias, hongos y plantas (6, 17, 33), y en la construcción de los primeros mapas de ligamiento para ciertas especies de plantas (16, 36) lo que los convierte en una herramienta útil en programas de mejoramiento genético de plantas y animales. Además, han sido utilizados para determinar la variación intra e interespecífica en híbridos somáticos de papa y huella genética (4, 7, 8, 14)Los SSR's o microsatélites también han sido utilizados para establecer las relaciones genéticas entre cultivares de papa (3, 19, 24) y otras especies como soya y cebada (1, 29). Estos marcadores son secuencias repetidas en tandem de 1 a 5 nucleótidos cuyo número de repeticiones revela las diferencias genéticas entre individuos (31). El DNA conteniendo tales secuencias pueden ser amplificadas mediante PCR con iniciadores que flanquean las secuencias repetidas y que pueden ser fácilmente visualizados mediante geles de electroforesis. Además, estudios genéticos y análisis de germoplasma en distintas especies (23, 28), han demostrado que las correlaciones de las relaciones genéticas entre distintos ensayos polimórficos pueden variar ampliamente intra y entre especies. Por lo anterior y debido a que en México se desconoce las relaciones genéticas entre el germoplasma de papa, y que es necesario establecer criterios para su conservación y/o aprovechamiento, es que se planteó el presente trabajo, con el objetivo de hacer una caracterización molecular de las líneas elite y variedades comerciales de papa y determinar sus relaciones genéticas utilizando dos tipos distintos de marcadores genéticos.

MATERIALES Y METODOS

   Material genético y extracción de DNA. Se colectaron ocho variedades comerciales y siete líneas avanzadas de papa (Cuadro 1).Para asegurar la pureza de los materiales evaluados en el estudio, estos fueron colectados del banco de germoplasma del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, ubicado en Emiliano Zapata, Nuevo León, México.En el presente trabajo se utilizaron tres plantas por variedad y se corrieron tres ensayos diferentes en forma simultánea para cada tipo de marcador. La extracción de DNA genómico se realizó utilizando la metodología descrita por Almeyda (2). Se trituraron 250 mg de tejido fresco con la ayuda de nitrógeno líquido. La muestra macerada fue transferida a un tubo de de 1.5 ml y se le agregó 750 ml de la solución de extracción (2% p/v CTAB, 100 mM Tris - HCl pH 8.0, 20 mM EDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl, 1% p/v polivinyl-pyrrolidona) previamente calentada a 65 ºC. La mezcla fue homogenizada e incubada durante 30 min a 65 ºC, agitándola ocasionalmente. Después se agregó a la mezcla un volumen (p/v), de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y se agitó suavemente por inversión para luego centrifugar a 100 g durante cinco min a temperatura ambiente. La fase acuosa de sobrenadante fue colectada y se realizó una segunda extracción con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y nuevamente se colectó la fase acuosa. El DNA fue precipitado adicionando 0.7 volumen de isopropanol, dejando la muestra reposar 15 minutos a -20 oC para posteriormente centrifugar a 200 gpor 15 min. El sobrenadante fue eliminado y el sedimento fue lavado con etanol al 70 % frío al menos dos veces, secado y resuspendido en 100 µl de agua estéril. El DNA fue cuantificado en un espectrofotómetro de masas mediante lecturas de absorción a 260 y 280 nm.

   Análisis RAPD. Se evaluaron de manera individual 16 iniciadores RAPD´s y 9 combinaciones con diferentes proporciones de guanina-citosina (G-C) como nucleótidos selectivos (Cuadro 2). Las condiciones de reacción utilizadas fueron las reportadas por Pecina et al., (22), con algunas modificaciones: en un volumen final de 25 µl se mezclaron solución amortiguadora al 1 X, 2 mM de MgCl₂, 200 µM de dNTP´s, 0.5 µM de cada iniciador, 2.5 unidades de Taq polimerasa, 2 µl de DNA (50 ng) y 12.5 µl de agua estéril. Cuando se utilizó la combinación de dos iniciadores se agregaron 0.5 µM de cada iniciador.Las condiciones de PCR fueron las siguientes: a) 3 min a 94 ºC; b) 35 ciclos de 1 min a 94 ºC; 1 min a 36 ºC y 1.5 min a 72 ºC. Al final se realizó una extensión de 7 min a 72 ºC. Los productos amplificados se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 6 % y se tiñeron con bromuro de etidio, para ser visualizados en una fuente de luz ultravioleta y fotografiados.

   Análisis SSR. En el análisis de microsatélites se utilizaron seis pares de iniciadores (Cuadro 3), los cuales fueron seleccionados con base en el número de genotipos que pueden diferenciar (3, 12). Las condiciones de reacción utilizadas fueron: en un volumen final de 25 µl se mezcló solución amortiguadora al 1X, 2 mM de MgCl₂, 200 µM de dNTP´s, 0.5 µM de cada iniciador, 2.5 Unidades de Taq polimerasa, 2 µl de DNA (50 ng) y 12.5 µl de agua estéril. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: a) 3 min a 94 ºC; b) 35 ciclos de 1 min a 94 ºC; 2 min a 47 ºC y 1.5 min a 72 ºC; con una extensión final de 5 min a 72 ºC. Los productos de amplificación se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 6 % y se tiñeron con nitrato de plata para ser fotografiados.

   Análisis de datos. Todos los geles se analizaron y las bandas monomórficas y polimórficas se contabilizaron. Se asumió que bandas del mismo peso molecular en diferentes individuos son similares. La presencia de una banda fue indicado por un uno (1) y la ausencia como cero (0). Las relaciones genéticas entre genotipos se calcularon por el método de similitud genética propuesto por Nei y Li (21), usando el paquete de software S-Plus Versión 4.0. La matriz de distancias generada se utilizó para producir un dendrograma por medio del método UPGMA (por su siglas en inglés, Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages). Se usó el método reportado por Felstenstein (10) para obtener el intervalo de confianza para los grupos formados en cada nodo del dendrograma, para lo cual se realizaron 1000 repeticiones con muestreo con reemplazo de los datos originales. Los intervalos de confianza Felsenstein se refieren al porcentaje de veces que cada nodo del dendrograma es repetido en las 1000 muestras con reemplazo, lo que a su vez indica lo robusto de los grupos formados en cada nodo. Un porcentaje cercano a 100% sugiere que el grupo refleja la estructura de la población y que el error de muestreo es mínimo, mientras que bajos porcentajes (30% o menos) sugieren que puede existir variación entre los genotipos de algún nodo en particular, cada vez que realiza un análisis, por lo que es necesario aumentar el tamaño de muestra. Para estimar la utilidad de los sistemas de marcadores en papa, se calcularon algunos parámetros propuestos por Powell et al., (23), como el índice de diversidad mediante la ecuación: ID= 1 - p_i², donde p_i es la frecuencia del alelo iⁿ; en este caso, cada alelo individual se considera locus único y a su vez un fragmento de amplificación. La proporción múltiple efectiva (EMR), que es definida como producto de la fracción de loci polimórficos y el número total de loci polimórficos para un análisis por oligonucleótidos RAPD´s y SSR´s. El índice de marcador (MI), cuya estimación es usada para evaluar la utilidad total de cada sistema de marcadores y se define como el producto de los promedios del índice de diversidad para los fragmentos polimórficos y el EMR para cada análisis.

RESULTADOS

   Análisis RAPD. La técnica de RAPD's permitió diferenciar los 15 materiales de papa evaluados. Se observó un total de 395 productos (en promedio 14.42 bandas por iniciador), de los cuales 296 (70.94%) fueron polimórficos. El tamaño de los fragmentos analizados estuvo en un ámbito de 200 a 4000 pares de bases, aunque se observaron fragmentos de mayor y menor peso molecular (Fig. 1), además no se detectaron diferencias significativas en el número de bandas amplificadas entre iniciadores por el porcentaje de G-C.

   Análisis SSR. En la técnica de SSR´s se evaluaron seis pares de iniciadores, los cuales produjeron en total 79 productos diferentes (13.17 bandas en promedio), 70 (88.61%) de ellos fueron polimórficos. El tamaño de los fragmentos observados estuvo en el ámbito de 150 a 850 pares de bases (Fig. 2).

   Relaciones genéticas. Las relaciones genéticas entre genotipos para cada sistema de marcador fueron calculadas utilizando la matriz de distancia propuestas por Nei y Li (21). Los dendrogramas de cada sistema de marcadores mostraron diferencias en la forma de agrupamiento de los diferentes genotipos (Fig. 3 y 4). En el primer caso RAPD's formó dos grupos diferenciales de genotipos. El primero es un grupo homogéneo donde se ubicaron las variedades Atlantic, Gigant y Alpha, además de las líneas avanzadas 91-9-3, 91-10-1, 91-25-4 y 91-12-2. El otro grupo fue heterogéneo y se formó con las variedades Montserrat, Norteña, Fiana, Zafiro y Atzimba con la línea 57-50-12; además a este grupo se adicionó la línea 72-00-88, siendo el genotipo mas divergente la variedad Malinche (Fig. 3). Por otra parte la técnica SSR's formó seis grupos de los cuales dos fueron heterogéneos, el primer grupo formado con las variedades Atzimba, Fiana, Montserrat y Norteña con la línea 57-50-12, y el segundo con Malinche, Gigant y Zafiro, también se formaron tres grupos homogéneos el primero incluyo la variedad Alpha con la línea 91-9-3, el segundo Atlantic y la línea 91-12-2 y el tercero formado con las líneas 91-10-1 y 91-25-4 al final se destacó la separación de la línea 72-00-88 que proviene de Argentina. También se observó que las variedades Norteña, Montserrat Fiana y Atzimba, con la línea 57-50-12, permanecieron estrechamente relacionadas bajo los dos sistemas de marcadores aún cuando no estuvieron en el mismo grupo, al igual que los genotipos 91-12-2, 91-10-1 y 91-25-4 del INIFAP (Fig. 4). Asimismo, se observó una mayor divergencia entre genotipos en el dendrograma generado por los SSR´s, debido probablemente a un menor número de ensayos, ya que no hubo diferencias estadísticas en el número de fragmentos amplificados. Lo anterior también se reflejó en los bajos intervalos de confianza Felsenstein para los SSR en comparación con RAPD´s. (Fig. 3 y 4).

   Comparación de la utilidad de los Marcadores. Con el fin de estimar la utilidad de cada sistema de marcadores, se calcularon algunos parámetros reportados por Powell et al., (23), como el índice de diversidad (ID), la proporción múltiple efectiva (EMR) y el índice de marcador (IM), (Cuadro 4). Los altos o bajos niveles de polimorfismo determinan el nivel ID genética presente en un grupo de individuos. En este caso se observó un nivel de diversidad en los genotipos evaluados tanto para RAPD´s como para SSR´s (46.7 y 42.9% respectivamente). En el Cuadro 4 también se muestran las medias aritméticas para la EMR de cada sistema de marcadores. El promedio de EMR en RAPD´s fue de 9.47, mientras que para los SSR´s fue de 1, lo cual fue debido a que este sistema de marcador sólo revela un simple locus. En cuanto al índice de marcador fue de 4.49 y 0.85 para RAPD´s y SSR´s, respectivamente (Cuadro 4).

DISCUSION

   En años recientes, los esfuerzos en la investigación han sido enfocados a la caracterización del germoplasma y el establecimiento de las relaciones genéticas entre colectas, con el fin de hacer un uso y conservación mas adecuado. El desarrollo de tecnologías basadas en el DNA ha permitido contar con un mayor número de marcadores como los RFLP´s y los basados en PCR (19). Aunque ha sido reportado que los marcadores RAPD´s tienen como desventaja no ser reproducibles entre laboratorios (9), en el presente trabajo se utilizaron dos clonas por variedades y se corrieron dos ensayos diferentes en forma simultánea obteniendo resultados idénticos, lo queindica una reproducibilidad de los resultados y que el manejo de los clonas ha sido el adecuado ya que no se detectó variación dentro de la misma variedad. Asimismo, se corrobora que los microsatélites tienen la ventaja de ser ampliamente reproducibles, de fácil uso, e implementación (12), ya que pueden detectar altos niveles de polimorfismo en Solanum tuberosum, por lo que pueden ser usados como herramienta para detectar las diferencias genéticas entre colectas relativamente cercanas (3, 27).
   Respecto a las relaciones genéticas observadas en los dendrogramas para cada sistema de marcador (Fig. 3 y 4), la correlación fue baja (r = 0.56), ya que mediante ambas técnicas las variedades Norteña, Montserrat, Fiana y Atzimba, con la línea 57-50-12, permanecieron estrechamente relacionadas bajo los dos sistemas de marcadores, aún cuando no fue en el mismo orden; al igual que los genotipos 91-12-2, 91-10-1 y 91-25-4, además mediante SSR´s se logró una mejor discriminación entre genotipos, ya que la línea de Argentina fue la mas divergente, lo que coincide con lo reportado por varios investigadores, que le atribuyen a esta técnica ser más eficiente en identificar variación en sitios determinados, (3,19, 23, 27). Por otra parte, el hecho que la variedad Malinche se desligue de los dos grupos en RAPD´s, puede ser un indicador de que existe variabilidad genética que pueda ser explotada en programas de cruzamiento donde se incluya esta variedad como progenitor. Las técnicas de SSR´s y RAPD´s utilizadas en el presente estudio diferenciaron los 15 genotipos evaluados y permitieron establecer las relaciones genéticas entre variedades. La similitud genética estimada por la huella genética, es una herramienta útil ya que puede permitir la toma de decisiones en la selección de genotipos para ser usados en los programas de mejoramiento de papa. También puede ser útil para proteger los derechos de propiedad del germoplasma liberado, así como en la producción y verificación de la pureza genética de semilla.
   En el presente estudio, el agrupamiento de unidades de distancias mínimas y promedios aritméticos propuesto por Nei y Li (21), permitieron distinguir las diferencias genéticas existentes entre los 15 genotipos, lo que concuerda con los resultados obtenidos en otros trabajos (20) (Fig. 1 A y B). Asimismo, con base en lo antes citado, el desarrollo de microsatélites en Solanum tuberosum analizada con el modelo propuesto por Nei and Li (21) (Fig. 2 A y B), soportan las diferencias genéticas de la mayoría de los genotipos, como ha sucedido en otros estudios (27).
   La diversidad genética evaluada a través del los análisis RAPD´s y SSR´s en papa mostraron un porcentaje muy similar (46 y 42 %), lo que puede ser un reflejo en la forma de variación observada por cada sistema de marcador, la misma situación ha sido observada en soya por otros investigadores (23). Mientras que para la Proporción Múltiple Efectiva (EMR) los marcadores RAPD´s, presentaron valores mayores que los SSR (9.4 y 1), lo cual es normal debido a que se asume que SSR´s únicamente revela un solo locus, mientras que en el caso de los RAPD´s se asumió que cada banda pertenece a un locus distinto. Por otra parte, si se considera que la papa es una especie tetraploide, se puede asumir que un locus o alelo puede existir en cuatro formas distintas, es contradictorio que en los análisis SSR´s se mencione que sólo se esta amplificando un solo locus. El valor de 1 asignado en EMR para SSR´s incide en bajos valores de su índice de marcador (IM), aún cuando pudieran ser utilizadas algunas combinaciones de oligonucleótidos iniciadores que puedan revelar mas de un locus, (19).
   Además de los datos antes citados, es importante considerar un amplio rango de caracteres para decidir que técnica se debe utilizar de acuerdo a las necesidades y propósitos de estudio. El costo económico de las diferentes técnicas juega un papel importante en la elección de sistema a utilizar. Para el caso de RAPD´s, estimaron costos de 2310 dólares para la diferenciación de 100 genotipos, utilizando 100 iniciadores, lo cual seria un costo aproximado de 23.1 dólares por genotipo identificado (26), el costo por genotipo en este estudio fue de 28.5 dólares por genotipo identificado.
   Los resultados obtenidos permiten concluir que mediante las dos técnicas utilizadas se pudieron diferenciar los 15 genotipos evaluados y con la reproducibilidad de los resultados obtenidos se pueden recomendar las condiciones descritas en este trabajo para estudios de caracterización molecular de un mayor número de material genético de papa.

NOTAS

a. Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Medio Ambiente, México. 2002.

LITERATURA CITADA

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