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Phyton (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1851-5657

Phyton (B. Aires) v.75  Vicente López ene./dic. 2006

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Multiplicación in vitrodel Piñón Azul Pinus maximartinezii (Rzedowski)
(Con 3 Tablas)

In vitro multiplication of the Piñón Azul Pinus maximartinezii (Rzedowski)
(With 3 Tables)

Ojeda-Zacarías1 Ma del Carmen, Hugo A Luna-Olvera2, Lilia H Morales-Ramos2, María J Verde-Star2, Teresa E Torres-Cepeda2, Benito Pereyra-Alférez2, Leobardo Iracheta- Donjuan3, Emilio Olivares-Sáenz4, Raúl Salazar-Sáenz4, Elizabeth Cárdenas-Cerda4

1 Instituto Tecnológico de Nuevo León, Eloy Cavazos No 2001, Guadalupe, Nuevo León, CP 67170.
2 Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Apdo Postal 38F, Pedro de Alba, s/n, Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N.L. México, CP. 66450.
3 Investigador del Instituto Nacional Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias; Campo Experimental Rosario Izapa, Tuxtla Chico Chiapas, Méx. CP. 30870
4 Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Facultad de Agronomía, Carretera Zuazua- Marín Km 17.5, Marín, N.L., CP. 66700, e-mail ojedacz@yahoo.com.mx
Agradecimiento: al Consejo Nac. De Ciencia y Tecnología por el apoyo económico brindado en la realización de mis estudios Doctorales.

Recibido 24.03.2006: aceptado 31.08.2006

Resumen. Pinus maximartinezii (Rzedowski) es una especie endémica en peligro de extinción, confinada a una población de aproximadamente 2000 a 2500 árboles maduros en una superficie de 400 ha. En estos casos, es necesario establecer técnicas de propagación que permitan incrementar la disponibilidad del material vegetativo.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para la multiplicación in vitro de Pinus maximartinezii por medio de organogénesis. Embriones cigóticos y cotiledones obtenidos de semillas maduras fueron colocados en los medios de cultivo DCR y GD adicionados con 0.3 mgl-1 y 0.5mgl-1 de BAP; 0.01 mgl-1 de NAA, permaneciendo por 6 semanas en condiciones de 26°C ± 2°C y un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h oscuridad. Posteriormente los explantes fueron transferidos a los medios de cultivo (DCR y GD) sin reguladores de crecimiento a intervalos de 15 días, durante 6 semanas. En la siguiente etapa (alargamiento de yemas), la variable evaluada fue número de explantes con yemas. Por último los explantes fueron transferidos a los mismos medios de cultivo sin reguladores de crecimiento, adicionados con 0.1% de carbón activado, permaneciendo por 8 semanas; evaluándose posteriormente el número de brotes por embrión.
Los análisis de varianza mostraron diferencia significativa en medios de cultivo y concentración de reguladores de crecimiento.

Abreviaturas: BAP=Bencilaminopurina; NAA=Ácido Naftalenacético; DMS=Diferencia Mínima Significativa; DCR=(Gupta y Durzan, 1985); GD=(Gresshoff y Doy, 1972); mgl-1= miligramos por litro; gl-1= gramos por litro; h= horas.

Palabras clave: Micropropagación; Coníferas; Piñón azul; Primordios foliares; Organogénesis

Abstract. Pinus maximartinezii (Rzedowski) is an endemic endangered species, confined to a single population of approximately 2000 to 2500 mature trees. It covers about 400 ha in southern Zacatecas, Mexico. The success of tissue culture techniques for germplasm preservation depends on regeneration of cultures. The objective of this study was to achieve an in vitro proliferation protocol using organogenesis technique for Pinus maximartinezii. Mature seeds were surface sterilized in 6% H2O2 v/v. Isolated cotyledons and zygotic embryos were cultured on shoot induction media. DCR and GD media were supplemented with 0.3 and 0.5 mgl-1 BAP; 0.01 mgl-1 ANA and vitamin solution. Explants were incubated at 26 ± 2ºC under a 16h photoperiod. The explants were transferred every 15 days to hormone-free medium (DCR and GD) for a period of 6 wk for bud development. The number of explants forming buds was determined. After induction of buds, the explants were transferred to a hormone-free basal medium, to which 0.1% activated charcoal was added. After 8 wk, the number of shoots per embryo was evaluated. Effects of either basal media or plant growth regulator concentrations were significantly different (p<0.05).

Abbreviations: DCR=Gupta & Durzan, 1985; GD=Gresshoff y Doy, 1972; BAP=bencilaminopurine; ANA=Naftalen acetic acid.

Key words: Micropropagation; Conifers; Piñon Azul; Foliar primordial; Organogénesis

La importancia económica de los bosques de coníferas en México es muy grande; el género Pinus constituye la mayor parte de la riqueza forestal por su amplio rango de distribución (Martínez, 1953). El piñón azul o maxi piñón (Pinus maximartinezii (Rzedowski), ha sobrevivido a una restricción genética extrema ya que está confinado a una sola población de aproximadamente 2000 a 2500 árboles maduros en el sur del estado de Zacatecas, México y se encuentra en la lista de las especies en peligro de extinción (Ledig et al., 1999; Norma Oficial Mexicana, 1994).
En estos casos la propagación in vitro ha demostrado ser un método exitoso para la conservación y mantenimiento de especies en peligro de extinción (Mata et al., 2001). Sin embargo, se han observado diferentes respuestas con la utilización de medios de cultivo y reguladores de crecimiento (Ojeda, 1992). Por lo que, es necesario ajustar el protocolo de regeneración para cada una de las especies (Go et al., 1993; Saravitz, 1990). Diversos investigadores, utilizando cotiledones de embriones maduros encontraron que concentraciones distintas de benciladenina favorecen el desarrollo de brotes in vitro (Go et al., 1993; Hargreaves et al., 2004; Patel y Torphe, 1994). Así mismo, Niella y Rocha (2001) utilizando cotiledones provistos de hipocotilos obtuvieron una mayor respuesta con la utilización de BA. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para la multiplicación in vitro de Pinus maximartinezii, estudiando la variable número de brotes por explante.

MATERIALES Y MÉTODOS

Desinfección de la semilla.- Se obtuvieron semillas intactas de conos maduros de Pinus maximartinezii. Para su desinfección se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio comercial (6% ingrediente activo) y detergente durante 5 min; estas fueron cepilladas y lavadas con agua. Se seleccionaron semillas de aprox. 2.5 cm y se eliminaron las cubiertas. Posteriormente las semillas seleccionadas se llevaron a una campana de flujo laminar colocándose en una solución de H2O2 de 12.5 vol durante 45 min; se enjuagaron con agua bidestilada esterilizada y se transfirieron a etanol 70% por un minuto; a continuación se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio comercial (6% ing. activo) adicionado de 0.5cc de Tween-20 (poliexietileno sorbitan monovalente) durante 5 min. Finalmente se enjuagaron por 5 min con agua bidestilada esterilizada.
Se utilizaron los medios de cultivo DCR y GD (Gresshoff y Doy, 1972; Gupta y Durzan, 1985). Adicionados con 0.3mgl-1 y 0.5mgl-1de BAP, respectivamente; 0.01mgl-1 de NAA; Sacarosa 30gl-1 para DCR y 20gl-1 para GD; 5gl-1 de agar gel y ajustándose el pH a 5.7. Se esterilizaron a 121ºC y 1 atm. de presión durante 15 min. Los tratamientos se muestran en la Tabla 1.

Diseño del experimento.- Se utilizó un diseño totalmente al azar y con arreglo factorial 23 factor A: explantes; factor B: medios de cultivo; factor C: concentración de los reguladores de crecimiento donde la variable dependiente a evaluar fue número de brotes por embrión.

Inducción de yemas.- Cotiledones de embriones maduros y embriones cigóticos completos fueron colocados en los tratamientos señalados, incubándose durante seis semanas por 16/8 h-luz, a 2000 lux y 26ºC ± 2°C para la inducción de yemas.

Alargamiento de yemas.- Los cotiledones y embriones fueron transferidos a frascos con medio DCR ó GD sin reguladores de crecimiento y disminuyendo la sacarosa a la mitad de su concentración. En estas condiciones permanecieron por seis semanas. Al final de esta etapa se evaluó el número de yemas que presentaban al menos 2 primordios foliares bien desarrollados.

Formación de brotes.- Los explantes con yemas desarrolladas se transfirieron a los mismos medios de cultivo pero adicionados con 0.1% de carbón activado manteniéndose estos durante 8 semanas. Para esta etapa se evaluó la variable número de brotes por embrión.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inducción de yemas. En la primera semana de iniciado el cultivo los cotiledones presentaron la formación de estructuras nodulares semejantes a callos. Al transcurrir seis semanas en el medio se hicieron evidentes primordios de yemas.
Sin embargo no se presentaron diferencias significativas (p>0,05) para ningún factor. Los resultados se muestran en la Tabla 2. El tiempo requerido para esta respuesta coincide con lo observado en otras especies de pino (Ojeda, 1992; Patel y Thorpe, 1994; Sen et al., 1994).

Formación de brotes.- Para la evaluación del número de brotes se tomaron en cuenta solamente las yemas que mostraban al menos dos primordios foliares bien desarrollados. En general el medio de cultivo DCR mostró mayores resultados (p<0.05) que el medio GD (Tabla 3). Así mismo, al analizar la concentración de los reguladores de crecimiento se encontró mayor respuesta (p<0,05) con 0.5mgl-1 BAP en comparación con 0.3mgl-1 (Tabla 3).

Aunque no es fácil definir la causa por la cual cotiledones provenientes de un mismo embrión presentan diferencias en su respuesta, es necesario ajustar el protocolo de regeneración para cada especie de pino (Pérez-Bermúdez y Sommer, 1987). Algunas especies responden exitosamente a dosis bajas de BA y otras responden mejor a dosis mayores de citocininas (Saravitz, 1990). La respuesta observada del presente trabajo coincide con lo reportado por Niella y Rocha (2001). Estos Autores obtuvieron una mejor respuesta con altas concentraciones de BA utilizando cotiledones provistos de hipocotilos. Así mismo Ojeda (1992) y Lambardi et al. (1993) encontraron en Pinus halepensis que conforme se incrementó la concentración de BA, la respuesta de los explantes fue mayor.
La mayor ía de las regeneraciones in vitro del género Pinus ha sido el resultado de la utilización de embriones maduros así como de la concentración de los reguladores de crecimiento (Martínez-Pulido et al., 1992; Patel y Thorpe, 1994). En general la mayor respuesta se obtuvo a partir de embriones cigóticos completos en el medio DCR utilizando 0.5mgl-1 de BAP.

REFERENCIAS

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2. Gresshoff PM, CH Doy, Development and differentiation of haploid Lycopersicon esculentun. Planta 107 (1972) 161.        [ Links ]

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4. Hargreaves C, L Grace, S Van der Maas, C Reeves, Cryopreservación of Pinus radiates zygotic embryo cotyledons: effect of storage duration on adventitious shoot formation and plant growth after 2 years in the field. Canadian Journal of Forest Research 34 (2004) 600.        [ Links ]

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