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Phyton (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1851-5657

Phyton (B. Aires) v.77  Vicente López ene./dic. 2008

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Germinación in vitrode semillas de Encyclia adenocaula (La Llave & Lex.) Schltr (Orchidaceae) (Con 3 Tablas y 5 Figuras)

In vitro germination of Encyclia adenocaula (La Llave & Lex.) Schltr (Orchidaceae) seeds(With 3 Tables and 5 Figures)

Ruíz1,2* BC, CA Laguna2, ALG Iglesias3, A Damon4, HTNJ Marín5, RHS Azpíroz5, MJL Moreno1

1 Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Autónoma de Chiapas. Entronque carretera costera. Huehuetán Pueblo. C.P. 30660. Huehuetán, México.
2Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Autónoma del Estado de México. Campus El Cerrillo Km. 15 Carr. Toluca-Ixtlahuaca, Estado de México, México.
3 Lab. Biotecnología y Ecología Aplicada (LABIOTECA), Universidad Veracruzana. Campus para la Cultura, las Artes y el Deporte, Xalapa, Veracruz, C.P. 91001, México.
4 El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), carretera antiguo aeropuerto Km 2.5 C.P. 30700 Tapachula, Chiapas. México.
5 Laboratorio de Biotecnología. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Progreso # 5 Coyoacán, C.P. 04010. México, D.F. México.
Address Correspondence to: Carmen Ruíz Bello, Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Autónoma de Chiapas. Entronque carretera costera.   Huehuetán Pueblo.   C.P. 30660. Huehuetán, Chiapas. México; e-mail: carubel16@yahoo.com.mx   Teléfono y fax: (964) 6270128.

Recibido/Received 30.12.2007. Aceptado/Accepted 5.08.2008.

Resumen. Encyclia adenocaula (La Llave & Lex.) Schltr. (Orchidaceae), es una orquídea epifita que utiliza como huésped natural a los árboles de encino (Quercus sp), por lo que es considerada como un recurso forestal no maderable. Por la belleza de sus flores es altamente depredada. La Norma Oficial Mexicana (NOM-059-SEMARNAT-2001) la reporta como una especie endémica de México en la categoría de amenazada. La presente investigación tuvo como objetivo establecer un protocolo efectivo para la germinación in vitro de semillas inmaduras de esta especie, así como conocer el efecto del estado de maduración de las cápsulas sobre su germinación. Los medios de cultivo in vitro estudiados fueron: Murashige y Skoog; Vacin y Went; Dalla Rosa y Laneri K07, y Phytamax (medio de mantenimiento de Orquídeas). Las etapas de madurez de las cápsulas fueron defini­das con base a su coloración (verde, verde amarillenta, amarilla sin dehis­cencia, y café con inicio de dehiscencia) en una escala de 4 valores. La germinación y el crecimiento de las plántulas fueron evaluados durante 70 días: se determinaron los días a inicio de germinación, el porcentaje de germinación, el vigor y la altura de las plántulas. Los resultados obtenidos indicaron que el mayor porcentaje de germinación se obtuvo en el medio Phytamax cuando se emplearon cápsulas de color verde y verde amarillenta. Además, las plántulas tuvieron mayor velocidad de crecimiento.

Palabras clave: Encyclia adenocaula; Orchidaceae; Germinación in vitro; Cápsulas.

Abstract. Encyclia adenocaula (La Llave & Lex.) Schltr. (Orchidaceae) is an epiphyte orchid, which uses oak (Quercus sp) trees as a natural host and is thus considered a non timber-yielding forest resource. Predation of this species is high because of the beauty of its flowers. The Official Mexican Norm (NOM-059-SEMARNAT-2001) reports it as an endemic endangered species in Mexico. The objective of this research was to (1) establish an effective protocol for in vitro germination of immature seeds of this species, and (2) determine the effect of the capsule maturity state on seed germination. The in vitro cultivation mediums were: Murashige and Skoog; Vacin and Went; Dalla Rosa and Laneri K07, and Phytamax (Orchid maintenance medium). Capsule maturity stages were based on a color scale of 4 values: (1) green, (2) yellowish green, (3) yellow without dehiscence, and (4) brown with dehiscence initiation. Seed germination and seedling growth were evaluated during 70 days determining: (1) days to germination, (2) ger-mination percentage, (3) seedling vigor and height. The obtained results indicated that the Phytamax medium showed the greatest germination percentage when green and yellowish green capsules were used. In addition, seedlings showed a greater growth rate.

Key words: Encyclia adenocaula; Orchidaceae; In vitro germination; Capsules.

INTRODUCCIÓN

Las flores de las orquídeas han sido apreciadas desde tiempos remotos. Los Mayas y los Aztecas las utilizaban tanto como plantas ornamentales como medicinales, y algunas otras para elaborar pegamentos. Ossenbach (2005) ha informado algunos de los múltiples usos que proveían estas plantas. La biología reproductiva de las orquídeas es compleja. Sus flores desarrollan mecanismos de atracción a los polinizadores que les permite producir semillas y perpetuar su especie (Anderson et al., 2005; Huber et al., 2005). La propagación natural de las orquídeas se dificulta porque sus semillas son diminutas y carecen de endosperma. Por esta razón, requieren de una relación obligada con hongos micorrízicos que permita la germinación de las semillas (Arditti, 1984). Entender esta simbiosis micorrízica es de gran importancia ya que existe una especificidad micorrízica para la germinación de semillas de orquídeas (Taylor et al., 2003; Otero et al., 2004). La disponibilidad de hongos simbiontes para la distribución y diversidad de las orquídeas también es de gran importancia (Otero et al., 2002).
Debido a la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar en forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación asimbiótica bajo condiciones in vitro (Arditti y Ernst, 1993; Serna, 1999; Mckendrick, 2000; Cavalcante et al., 2001; Damon et al., 2004; Pedroza et al., 2005; Yamazaki y Kasumitzu, 2006; Pedroza y Mican, 2006; Haddix et al., 2006; Steele, 2007). Sin embargo, cada especie de orquídea tiene diferentes necesidades de nutrientes para germinar, por lo que hay que investigar cual es el medio de germinación adecuado para cada una de ellas. Damon et al. (2004), informaron que la madurez de las semillas al momento de la germinación es un factor importante y poco estudiado en la propagación de las orquídeas.
Encyclia adenocaula (La Llave & Lex.) Schltr (Orchidaceae) es una orquídea endémica de México. Su nombre común es "Trompillo" ó "Trompillo morado". Por la belleza de sus flores se encuentra amenazada [Norma Oficial Mexicana -059-SEMARNAT-2001(2002)] con riesgo de llegar a extinguirse; su principal utilidad es como planta ornamental. Se distribuye en los estados de: México, Michoacán, Jalisco, Nayarit, Guerrero y Oaxaca. Su hábitat varía desde 1200 a 2000 msnm. Su floración es de Mayo a Junio. Es una planta epifita que vive sobre los encinos (Quercus sp) (Fig. 1). Las epifitas son plantas que crecen sobre otras plantas adheridas a los troncos y ramas de árboles y arbustos principalmente (Granados et al., 2003). Las orquídeas epifitas son el grupo de plantas que han podido colonizar con más éxito las copas de los árboles (Hágsater et al., 2005). Sin embargo, éstas son altamente depredadas por lo que se considera que se les debe brindar una protección especial (Hágsater y Soto, 2002). Además, se debe contribuir a su conservación y restauración, mediante el desarrollo de metodologías eficientes de propagación. El presente trabajo es parte de un estudio encaminado a la conservación de esta especie de orquídea, en la búsqueda de productos alternativos económicamente rentables para los productores del municipio de Temascaltepec, estado de México. Con el propósito de contribuir a evitar su extinción, hemos trabajado en su cultivo in vitro a fin de establecer un protocolo efectivo para la germinación asimbió-tica de las semillas de E. adenocaula. Con este objetivo, se propuso conocer el efecto de 4 medios de cultivo, y el estado de madurez de las cápsulas, sobre la germinación y el crecimiento de las plántulas de esta especie. Los resultados a obtener contribuirán a encontrar estrategias efectivas de propagación y de conservación de este valioso recurso genético.


Fig. 1. E. adenocaula. a) en su hospedero natural (Quercus sp), b) Flores.
Fig. 1. E. adenocaula. a) on its natural host (Quercus sp), b) flowers.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material Vegetal. En el Ejido "El Peñón" (19° 02' 33.5'' N, 100° 07' 41.7'' O, 1689 m.s.n.m), del municipio de Temascaltepec, estado de México, se obtuvieron cinco plantas de E. adenocaula en floración. El municipio se localiza en el Sudoeste del Estado. El clima se clasifica como Semicálido con lluvias en verano A(C) (w2); los meses más cálido y más frío son mayo y diciembre, con 18 ºC y 8 ºC, respectivamente. La temperatura media anual es de 15 a 20 ºC. La precipitación media anual es de 1100 mm (Morales, 2006).
Las plantas obtenidas crecieron luego bajo condiciones de invernáculo. Como producto de la fecundación natural se obtuvieron cuatro cápsulas que maduraron en diferente tiempo. Las semillas de estas cápsulas se sembraron en diferentes medios de cultivo.
Selección de medios de cultivo. Se seleccionaron cuatro medios de cultivo, de uso común para la germinación de semillas de orquídeas: M1. Murashige y Skoog (1962); M2. Vacin y Went (1949); M3. Dalla Rosa y Laneri K07 (Dalla Rosa y Laneri, 1977), y M4. Phytamax Orchid Maintenance Médium (SIGMA®). El pH se ajustó de acuerdo a la recomendación para cada uno de los medios de cultivo previo a la adición del gelificante (agar bacteriológico marca Bioxon). Se
utilizaron frascos gerber de 100 ml a los cuales se agregaron 20 ml de cada medio de cultivo. Éstos se esterilizaron en un autoclave vertical AESA (modelo CV30) a 120 °C (15 libras de presión) durante 20 minutos.
Desinfección de las cápsulas. Las cápsulas se cortaron entre los siete y ocho meses de edad, considerando su tamaño, textura y coloración (Fig. 2). Cada una de ellas se clasificó, conforme a su madurez establecida en base a su coloración, en una escala de 4 valores: (C1) Cápsula verde (195 días), (C2) Cápsula verde amarillenta (210 días), (C3) Cápsula amarilla sin dehiscencia (240 días), y (C4) Cápsula café con inicio de dehiscencia (255 días). Éstas se llevaron al laboratorio para llevar a cabo su desinfección, la que se realizó bajo condiciones asépticas, dentro de una cámara de flujo laminar horizontal ALDER (modelo CFH-13). Cada cápsula se tomó con una pinza, y se sumergió en alcohol etílico al 75%. Inmediatamente luego se la flameó, hasta consumirse el alcohol impregnado en la misma. Cambiando la posición de la pinza, el procedimiento se repitió tres veces. Una vez desinfectadas, éstas se dejaron enfriar en placas de Petri previo a la extracción de sus semillas para efectuar la siembra.


Fig. 2. Cápsulas y semillas germinadas in vitro de E. adenocaula.
Fig. 2. In vitro germinated capsules and seeds of E. adenocaula.

Siembra de las semillas en cuatro medios de cultivo. Se cortaron los extremos de las cápsulas, y seguidamente se efectuó un corte longitudinal procurando introducir el bisturí en una de las hendiduras de las mismas. Una vez abiertas se esparció una delgada capa de semillas en la superficie de cada uno de los frascos conteniendo los medios de cultivo: M1, M2, M3, o M4. Los frascos se sellaron con parafilm, y se identificaron con su fecha de siembra, número de la cápsula y el medio de cultivo correspondiente.
Condiciones del cultivo. Los cultivos se llevaron a una cámara de incubación ordenándolos linealmente por tratamiento. Éstos se mantuvieron durante todo el experimento bajo un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h o de oscuridad a una temperatura de 24 ± 2 
° C y una intensidad lumínica de 2000 lux (Fig.2).
Diseño del experimento y análisis estadístico. Se utilizó un diseño de bloques al azar con cuatro tratamientos (medios de cultivo), cuatro bloques (cápsulas con diferente grado de maduración: C1-C4), y 11 repeticiones (frascos) por cada bloque. Esto hizo un total de 176 frascos o unidades experimentales. Los datos obtenidos [días a inicio de germinación, porcentaje de germinación, vigor de plántula (escala de 1 a 10) y altura de plántula (mm)] fueron analizados estadísticamente con el programa SAS. Previo al análisis de varianza (ANOVA), los datos de porcentaje de germinación y vigor de plántula se transformaron a Arc Sen (√ %) y √ (x+0,5), respectivamente. La comparación de medias cuando las pruebas de F fueron significativas fueron analizadas por la prueba de Tukey (p=0,05). Se realizó además un análisis de correlación lineal entre las variables en estudio.

RESULTADOS

El estado de madurez de las cápsulas y el medio de cultivo tuvieron un efecto altamente significativo (p=0,01) sobre el porcentaje de germinación de las semillas (Tabla 1). No se encontraron, sin embargo, diferencias significativas (p>0,05) del efecto de la madurez de las cápsulas, pero sí de los medios de cultivo (p=0,01), sobre el vigor y la altura de las plántulas (Tabla 1).

Tabla 1. Valores de F calculados del análisis de varianza de las variables estudiadas.
Table 1. Calculated F values from the analysis of variance of the study variables.

Los días a inicio de germinación de las semillas fueron estadísticamente iguales (p>0,05) en los medios 1,3 y 4 (Tabla 2). No se observó germinación en el medio 2 (sólo se apreció hidratación de las semillas; Tabla 2). Los porcentajes de germinación fueron similares (p>0,05) en M1, M3 y M4, y mayores (p<0,05) en éstos que en M2 (Tabla 2). Mientras el vigor fue mayor (p<0,05) en M1 y M4 que en M2 y M3, la altura fue similar (p>0,05) en M1, M3 y M4, y mayor (p<0,05) en éstos que en M2 (Tabla 2).

Tabla 2. Efecto de los medios de cultivo sobre las variables de germinación y crecimiento evaluadas.
Table 2. Effect of the cultivation media on the germination and growth study variables.

Los mayores (p<0,05) porcentajes de germinación (68.94%) se observaron al emplear las cápsulas C1 (verde) y C2 (verde-amarillenta) (Fig. 3). Las cápsulas C3 y C4 tuvieron un porcentaje de germinación similar (p>0,05) (Fig. 3).


Fig 3. Porcentaje de germinación por cápsula de E. adenocaula. 1- 4 Cápsulas con diferente grado de madurez. Valores con la misma letra son estadísticamente iguales, según la prueba de Tukey (p=0,05).
Fig 3. Percentage germination per capsule of E. adenocaula. 1-4 capsules with different maturity degrees. Values followed by the same letter are statistically equal, according to Tukey's test (p=0.05).

Las variables de altura y vigor de plántula no presentaron diferencias significativas entre cápsulas pero si (p<0,05) entre los medios de cultivo evaluados (Fig. 4).


Fig 4. Variación en el porcentaje de germinación de las semillas, altura y vigor de las plántulas de E. adenocaula en los cuatro medios de cultivo evaluados [M1. Murashige y Skoog (1962); M2. Vacin y Went (1949); M3. Dalla Rosa y Laneri K07 (Dalla Rosa y Laneri, 1977), y M4. Phytamax Orchid Maintenance Medium (SIGMA®)]. Valores con la misma letra son estadísticamente iguales, según la prueba de Tukey (p=0,05).
Fig 4. Variation in seed germination percentage, height and vigor on seedlings of E. adenocaula in the four study media [M1. Murashige and Skoog (1962); M2. Vacin and Went (1949); M3. Dalla Rosa and Laneri K07 (Dalla Rosa and Laneri 1977), and M4. Phytamax Orchid Maintenance Medium (SIGMA®)]. Values followed by the same letter are statistically equal, according to Tukey's test (p=0.05).

En la actualidad se han venido desarrollando numerosos estudios encaminados a definir los medios de cultivo más adecuados para propagar cada especie de orquídeas. Esto se ha efectuado con el fin de incrementar la variabilidad genética y rescatar especies raras, que estén amenazadas o en peligro de extinción (Stephenson y Fahey, 2004). Sin embargo, pocos estudios al respecto se han llevado a cabo en E. adenocaula.
En la Fig. 5 se pueden observar plántulas de E. adenocaula cultivadas en medio de cultivo in vitro Phytamax (Orchid maintenance medium), aptas para ser transplantadas en un sustrato adecuado y proceder a su aclimatación en fase de invernadero.


Fig. 5. Plántulas de E. adenocaula en invernáculo aptas para su aclimatación.
Fig. 5. Greenhouse seedlings of E. adenocaula ready for acclimation.

Análisis de correlación. Los mayores (p<0,01) valores de correlación se obtuvieron entre el porcentaje de germinación de semillas y el vigor de las plántulas (r=0,87**), y entre la altura y el vigor de las plántulas (r=0,79**) (Tabla 3). También fue significativa (p<0,05) la correlación entre el porcentaje de germinación de las semillas y la altura de las plán­tulas (r=0,60*) (Tabla 3).

Tabla 3. Valores de correlación lineal entre las variables evaluadas
Table 3. Linear correlation values among the study variables.

DISCUSION

Existe preocupación por conservar las orquídeas que se encuentren en peligro de desaparecer (Szalanski et al., 2001; Avila y Oyama, 2007). El cultivo de tejidos vegetales constituye una herramienta poderosa. El mismo permite la germinación de semillas in vitro, que de otra forma no sería posible, como es el caso de E. adenocaula (que se encuentra registrada como amenazada).
Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran la utilidad de emplear el medio Phytamax Orchid maintenance medium SIGMA® (M4) para lograr mayores porcentajes de germinación de las semillas inmaduras de E. adenocaula. Sin embargo, los medios Murashige y Skoog (M1) y Dalla Rosa y Lanery K07 (M3) también obtuvieron resultados favorables de germinación. El vigor de las plántulas fue ligeramente superior en M4, en el mismo grupo de respuesta de M1 y M3. Las plántulas obtenidas en M4 fueron de mayor calidad y se observó mayor velocidad en su crecimiento. El análisis comparativo de los diferentes medios de cultivo in vitro aportó resultados para su utilización inmediata para la germinación de semillas de esta orquídea y la época de aprovechamiento de las cápsulas. Estos resultados son importantes a fines de obtener el mayor número de plántulas para conservar la especie, evitando su extinción. La utilización de semillas como fuente de propagación mantiene la variabilidad genética natural. Por lo tanto, las plantas obtenidas pueden destinarse para la repoblación de las áreas naturales, o bien para su venta legal, beneficiando a los productores de la zona. El medio Phytamax se comer
cializa en polvo, lo cual representa una ventaja para quien no desea preparar todo el medio de cultivo. Hurtado y Merino (1987) mencionan que el medio nutritivo desarrollado por Murashige y Skoog (1962) es utilizado con éxito en casi todas las especies. Estos resultados coinciden con esta investigación, ya que también resultó favorable para la germinación de semillas inmaduras de E. adenocaula. Damon et al. (2004) informan que se sabe muy poco de la propagación de la gran mayoría de las orquídeas que son epifitas. Estos autores utilizaron con éxito el medio de cultivo Dalla Rosa y Laneri K07 para germinar semillas inmaduras de tres especies de orquídeas de la región del Soconusco, Chiapas, México. Este mismo medio fue utilizado en este experimento obteniendo buenos resultados en el porcentaje de germinación de las semillas; los resultados fueron similares a los que se obtuvieron cuando se utilizó el medio Murashige y Skoog. La ventaja de utilizar semillas inmaduras es que las semillas dentro de la cápsula se encuentran estériles. Cuando las semillas son liberadas de la cápsula y almacenadas, y se requiere utilizarlas posteriormente, hay que buscar una metodología para desinfectarlas, y en este proceso se desconoce si la germinación resulta afectada. Hay que tener presente que no es fácil conseguir cápsulas de semillas y éstas tardan muchos meses en madurar en algunas especies. Las cápsulas de E. adenocaula pueden ser obtenidas en el campo sin necesidad de extraer las plantas. El aprovechamiento de las plantas bajo estas condiciones contribuye a la propagación de la especie, y a reducir la actual extracción de plantas bajo condiciones de campo naturales.
Este trabajo reporta un procedimiento muy sencillo y práctico para la desinfección de las cápsulas, menos complicado que lo reportado por algunos autores (Damon et al., 2004; Mckendrick, 2000), obteniendo altos porcentajes de germinación de semillas in vitro. En este trabajo también se define el medio de cultivo más adecuado para la propagación de este valioso recurso genético. Así, se cumple una de las primeras etapas efectuadas con el propósito de lograr la conservación y mantenimiento de la variabilidad genética de esta especie.

CONCLUSIONES

El uso de cápsulas verde y verde amarillenta (de 195 a 210 días) de E. adenocaula permitió obtener los mayores porcentajes de germinación.
El medio de cultivo M4 (Phytamax orchid maintenance, medium SIGMA®) fue el más adecuado para obtener el mayor porcentaje de germinación de semillas (69,16%).
La estrategia de germinación de semillas de E. adenocaula in vitro contribuye al manejo sustentable de esta especie, conservando su variabilidad genética y evitando su depredación y extinción.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al M. en F. César Vences Contreras por las instalaciones y servicios otorgados en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México. Ruíz BC desea agradecer el apoyo financiero de una beca otorgada por la Universidad Autónoma de Chiapas y PROMEP, México, para realizar esta investigación.

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