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Phyton (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1851-5657

Phyton (B. Aires) vol.78 no.2 Vicente López jul./dic. 2009

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Actividad antibacteriana y antifúngica de mieles monoflorales de Quillaja saponaria, especie endémica de Chile

Antibacterial and antifungic activity of the unifloral honeys of Quillaja saponaria, an endemic Chilean species

Montenegro1 G, F Salas1, RC Peña1, R Pizarro1

Departamento de Ciencias Vegetales, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Pontificia Universidad Católica de Chile. Casilla 366 Santiago-22, Chile.
Address Correspondence to: Gloria Montenegro, e-mail: gmonten@uc.cl Te-Fax: (562) 3545702.

Recibido-Received 24.O6.2009.
Aceptado-Accepted 30.09.2009.

Resumen. En mieles monoflorales de la especie chilena Quillaja saponaria se detectaron los compuestos fenólicos: ácido cumárico y ácido salicílico, la flavona naringenina y el flavonol kaempferol, utilizando cromatografía líquida de alta resolución. Estos extractos mostraron actividad antibacteriana contra Pseudomonas aureginosa, Escherichia coli, Staphylococcus typhi, S. aureus, Streptococcus pneumoniae tipo β, y Vibrio cholerae, y actividad antifúngica contra la levadura Candida albicans. En el extracto etanólico, adicionalmente, se identificaron algunos compuestos del aroma y de descomposición.

Palabras clave: Miel; MIC; Quillaja saponaria; "Manuka"; Flavonas; Ácidos fenólicos; Compuestos fenólicos.

Abstract. The detection of phenolics, flavonoids and related compounds by HPLC in extracts of unifloral honey of Quillay (Quillaja saponaria) showed phenolic compounds such as caffeic, coumaric and salicylic acids, the flavanone naringenin and the flavonol kaempferol. These extracts showed antibacterial activity against Pseudomonas aureginosa, Escherichia coli, Staphylococcus typhi, S. aureus, Streptococcus pneumoniae type β, and Vibrio cholerae, and antifungal activity against Candida albicans. Additionally, some aroma and decomposition compounds were identified in the ethanol extract.

Key words: Honey; MIC; Quillaja saponaria; "Manuka"; Flavonols; Flavanone; Phenolic compounds.

INTRODUCCIÓN

El quillay, Quillaja saponaria Molina, es un árbol endémico de Chile, presente entre los 32° Coquimbo y 40° Malleco de latitud sur (IV a IX Región), cuyas flores son muy atractivas para la abeja, Apis mellifera L. (Rougier et al., 1993; Ramírez y Montenegro, 2004). Sin embargo, la mayor probabilidad de encontrar mieles monoflorales de quillay está entre las regiones IV y VII (Montenegro et al., 2008). En dicha zona es posible encontrar poliflorales del tipo llamado mixto, con raps Brassica, Rubus ulmifolius Schott, y Lotus uliginosus Schuhr, entre otros (Montenegro et al., 2006).
La miel de quillay ha sido ampliamente estudiada debido, entre otras cualidades, a la presencia de saponinas en su corteza, compuestos con múltiples usos biotecnológicos: espumante para bebidas, nematicida y antifúngico (Montenegro et al., 2001; San Martín y Briones, 1999).
El uso de la miel de abeja se menciona desde civilizaciones antiguas, como un agente antiséptico, en curaciones y heridas. Varios autores atribuyen al peróxido de hidrógeno como el principal agente antimicrobiano (Wahdan, 1998), compuesto que va perdiendo actividad a medida que pasa el tiempo de almacenaje de las mieles. Secundariamente, se atribuye dicha actividad a características físico-químicas inherentes a las mieles, como son: el alto contenido de azúcar (cercano al 80% w/w) y el pH ácido, entre 3 y 4,5 (Molan, 1992; Bogdanov et al., 1997). Por otra parte, White et al. (1963), atribuyen dicha actividad al ácido glucónico, derivado de la catálisis de la glucosa, cuya concentración varía marcadamente entre tipos de mieles. En las mieles de abeja también existen compuestos de tipo no peroxídicos que generan actividad antibacterial; estos varían según las especies vegetales en que las abejas pecorean el néctar (Cooper, 2007).
Molan (2006) y Cooper (2007) coinciden en señalar que la desodorización rápida de las heridas es probable que ocurra por la acción antibacteriana de la miel.
El objetivo del presente estudio fue determinar la participación de extractos fenólicos de la miel de quillay en la actividad antibacteriana y antifúngica de ésta, comparativamente con la miel de Leptospermum scoparium J.R.Forst. et G. Forst. ("manuka").

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras de mieles. Se utilizaron dos muestras de mieles monoflorales de quillay, la primera proveniente del Río Clarillo (Región Metropolitana), y la segunda de la cordillera de la costa de Curicó (VII Región); además, se analizó una miel monofloral de manuka, Leptospermum scoparium.

Determinación de fenoles y flavonoides. Para la obtención de los extractos fenólicos se filtró utilizando una resina de intercambio catiónico. Se disolvieron 50 g de miel en un volumen de 200 mililitros de ácido clorhídrico a pH 2, de manera de llegar a cuantificar la capacidad antioxidante de las mieles. La solución fue eluída a través de la columna de la resina Amberlita XAD-2 (200 mm x 20 mm de diámetro). Posteriormente, la misma fue lavada con un volumen de 150 mililitros de ácido clorhídrico a pH 2, y 300 mililitros de agua destilada, permitiendo que la fracción fenólica quedara retenida en la columna y desechando la fracción enjuagada. Para recuperar los compuestos fenólicos se eluyó la columna con 300 mililitros de metanol (J. T. BAKER®, grado HPLC). Asimismo, el extracto metanólico fue evaporado hasta sequedad a presión reducida (40°C), redisuelto en metanol (2,0 mL) esterilizado por contrapresión en jeringuillas con un filtro de un diámetro de poro de 0,45µm (Orange® CA-PC Scientific, Gyro disc CA-PC).

Determinación de los compuestos fenólicos. Se utilizó un equipo Hewlett Packard con columna de fase reversa Agilent (15.0 × 4 cm; tamaño de partículas: 5 μm), con detector de arreglo de diodos para determinar los compuestos fenólicos; los cromatogramas fueron registrados a 319 nm. Para la fase móvil de 20 minutos, se utilizaron dos solventes: A) Agua ácida pH 2.0, y B) acetonitrilo. Se efectuó un sistema de gradiente de elución: 0 a 12 minutos: solvente A a 84% y solvente B a 16%; 12 a 14 minutos: solvente A a 40% y solvente B a 60%; 14 a 20 minutos: solvente A a 84% y solvente B a 16% (Markham et al., 1970). Los diversos flavonoides de la miel se identificaron por comparaciones cromatográficas y sus espectros ultravioletas con respecto a los marcadores auténticos (comerciales o previamente aislados e identificados de mieles). Los flavonoides de la miel fueron cuantificados por la absorbancia de sus picos correspondientes en los cromatogramas. Las flavanonas (pinocembrina y pinobanksina) fueron medidas contra un estándar externo de pinocembrina detectado en 290nm; las flavonas con un anillo sin sustituir B (crisina, galangina y tectocrisina) contra crisina a 340nm, y el resto de los flavonoles y las flavonas (quercetina, kaempferol, 8-metoxikaempferol 8, etc.), contra la quercetina a 340nm. Los compuestos derivados deácidos hidroxicinámicos (cafeico, p-cumárico, ferúlico y afines) fueron cuantificados como ácido cafeico, y ácido elágico con marcadores auténticos (Sigma, St. Louis, MO, USA) a 340nm (Tomás-Barberán et al., 2001).

Determinación de los compuestos volátiles. El análisis GC/MS se efectuó en un cromatógrafo Agilent Technologies de modelos 7890A y 5975C, America, una columna capilar DB-1 (30m×0.25mm) y se empleó una fase medio polar (Hewlett-Packard-5 cross- linked 5% fenil metil silicona). El régimen de temperaturas GC se programó como se muestra en la Fig. 1. Inyector 220°C; Detector 240°C; Columna Temp 0: 160°C; Temp 1: 210°C; Temp 2: 240°C; Tiempo 0: 0 minutos, Tiempo 1: 0 minutos, Tiempo 2: 30 minutos; Δ Temperatura 0→1: 2°C/min, Δ Temperatura 1→2: 5°C/min. El rango de masas fue de 35 a 335 m/z con voltaje ionizante de 70eV y una corriente de ionización de 150µA. La velocidad de flujo de He fue 1mL/min. Se utilizó el software NIST 2005.

Fig. 1. Diagrama de programa de temperatura de la columna del cromatógrafo de gases.
Fig. 1. Plot of temperature programme of the chromatographic column.

SPME- Cromatografía gaseosa. Se vertió en un vial de 10 mL, 0,5 g sulfato de sodio anhidro y 25 µL de un estándar interno (solución de 4-nonalol 3568 mg/mL), por cada 10 g de miel. El vial se agitó durante 30 minutos a 70°C para preacondicionamiento. A la misma temperatura se preacondicionó durante 20 minutos una carboxen/polidimetilsiloxano (CAR/PDMS) dotada de una fibra SPME de 75 µm de diámetro, para luego transferirlo al inyector del GC/MS. Para los análisis cromatográficos, la temperatura tanto del inyector como del detector se mantuvieron a 250°C. A su vez, la columna se conservó a 40°C durante 5 minutos y luego se calentó a razón de 3°C por minuto hasta alcanzar 240°C, la cual se conservó durante 10 minutos (Fig. 1). El flujo de gas (helio) fue de 20 mL/min. Los compuestos se determinaron por cálculo de área de los picos y parcialmente identificados por correlación entre los tiempos de retención.

Actividad antibacteriana. Se utilizaron aislados puros de las bacterias proporcionados por el Instituto de Salud Pública de Chile, como: Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922 (American Type Culture Collection), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhi STH 2370, Vibrio cholerae ISP, y bacterias Gram (+): Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 25923 y Streptococcus pneumoniae tipo β, Staphylococcus aureus ATCC 25923. Adicionalmente, se probó la actividad antibacteriana en un aislado de la bacteria fitopatógena Gram (-) Pectobacterium carotovorum Jones emend. (Hauben et al., 1998) (sin. Erwinia carotovora subsp. carotovora), de la colección de Laboratorio de Patología de Cultivos, Facultad de Agronomía e Ingeniería forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile.

Extracción de mieles para pruebas biológicas. El procedimiento utilizado fue el mismo protocolo descrito anteriormente hasta la concentración de compuestos fenólicos, sólo que el extracto fue disuelto en 2mL agua tridestilada, y además se esterilizó por contrapresión en jeringas, con filtro de un diámetro de poro de 0,45µm (Orange® CA-PC Scientific, Gyro disc CAPC). Se aseguró la ausencia de microorganismos en el extracto, sembrando en forma de césped, 100µL del extracto en placas de Petri con Agar - Soya tripticasa. Las placas fueron incubadas por 48 horas a 37°C en cámara de crecimiento.

Determinación de CIM. Para determinar la mínima concentración de extracto, definida como la concentración inhibitoria mínima (CIM) capaz de inhibir el desarrollo bacteriano y fúngico, se utilizó una placa de Elisa de 96 pocillos, con fondo plano, de 8 filas (A-H) y 12 columnas Orange Scientific®, utilizando el método de microdilución (Pontino et al., 2006). En todos los pocillos se colocan 150 μL de caldo de soya tripticasa (BBLTM Trypticase MR Soy Broth); posteriormente, en filas con tratamientos, se colocaron 150 μL de extracto en la primera columna, que se diluyó a mitad de volumen dentro de la misma fila. Posteriormente, se adicionaron 50 μL de solución bacteriana de 1,5 x 106 ufc/mL en agua destilada equivalente a 75000 unidades formadoras de colonias por pocillo, ajustada con un patrón de unidades de turbidez Mc Farland 0,5 (Biomerieux, Chile) en todos los pocillos. La dilución final del extracto se expresó en μg/mL de solución Las placas se incubaron en cámara de crecimiento a 37°C por 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, se evaluó crecimiento o no en cada pocillo, observado la turbidez o transparencia de éste.

RESULTADOS

En las muestras analizadas de extractos de miel de quillay, fue posible determinar que ambos extractos inhibieron el crecimiento in vitro de Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, y Streptococcus β hemolítico. Estos últimos fueron inhibidos con una menor concentración de extracto. La bacteria Escherichia coli y la levadura Candida albicans no fueron inhibidas por los extractos (Tabla 1). La actividad antibacteriana de los extractos de miel de quillay, se pueden explicar por la determinación de compuestos fenólicos por HPLC. En las muestras analizadas de miel de quillay fue posible determinar ácido clorogénico (Fig. 2a), aesculetina, ácido cafeico (Fig. 2b), ácido siríngico, rutina, escopoletina, ácido p-cumárico (Fig. 2c), ácido vanílico, ácido salicílico (Fig. 2d), quercetina y naringerina. La presencia de los compuestos anteriores, corresponde al primer informe obtenido de miel de Quillaja. Los compuestos, ácidos cumárico, ferúlico y salicílico se detectaron también en mieles de ulmo (Montenegro, 2007), encontrados también en mieles de quillay, con lo que hace conjeturar que los compuestos bioactivos antibacteriales son el resultado de un sinergismo entre flavonoides y compuestos fenólicos o entre estos y terpenos (Fontana et al., 2000).

Tabla 1. Valores de concentración inhibitoria mínima de extractos fenólicos de mieles Chilenas expresadas en mg/mL, y diluciones (%) capaces de inhibir in vitro el crecimiento de diferentes especies bacterianas patógenas de humano.
Table 1. MIC values of the phenolic extracts in Chilean honeys expressed as mg/mL, and dilutions able to inhibit the in vitro growth of different bacterial species which are pathogens to humans.

 

Fig. 2. Estructuras compuestos bioactivos: a) ácido clorogénico, b) ácido cafeico, c) ácido cumárico, d) ácido salicílico, e) Beta ionona, f) ácido abscícico, g) feniletilalcohol, h) tabanona o (E)-4-[(1S,4R,6R)-4- hidroxi-2,2,6-trimetil-7-oxabiciclo[4.1.0]heptan-1-il]but-3-en-2-ona.
Fig. 2. Bioactive compounds structures: a) Chlorogenic acid, b) caffeic acid, c) coumaric acid, d) salycilic acid, e) Beta ionone, f) absicic acid, g) phenylethyl alcohol, h) tabanone.

Los compuestos volátiles detectados fueron ácido abscísico (Fig. 2e), 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H piran-4-ona (damasco), 4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3-oxo-1-butenil)- 2ciclohexen- 1-ona, β-ionona-5, 6-epóxido (tipo trans), 4 metoxibenzaldehido, 4-hidroxifeniletanol, 2-(4-metoxi-fenil)-etanol (= p-metoxifenetil alcohol), (E)-4-[(1S,4R,6R)-4-hidroxi- 2,2,6-trimetil-7-oxabiciclo[4.1.0]heptan-1-il]but-3-en-2-ona o tabanona. Estos compuestos pueden servir de marcadores de la flora acompañante a la miel de Quillay, por ejemplo β ionona es indicador de Eucryphia y megastigma, -5, 7, 9-trienona de Quillaja respectivamente (Montenegro et al., 2008) (Tabla 2, Fig. 3).

Tabla 2. Compuestos estudiados en mieles Chilenas.
Table 2. Assayed compounds from Chilean honeys.

Fig. 3. Cromatograma de compuestos volátiles. Análisis de GC/MS de la muestra de miel 337.
Fig. 3. Chromatogram of the volatile compounds. GC/MS of the honey sample 337.

DISCUSIÓN

Los extractos de miel de quillay tienen una mejor actividad in vitro sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus β hemolítico, ambas bacterias que afectan a la piel. El desarrollo de las infecciones en las heridas puede llevar a las interrupciones del proceso curativo, costos de tratamiento incrementados en términos de antibióticos, de preparaciones y de tiempo de personal (Cooper et al., 2002). Esto se puede explicar según los compuestos detectados por HPLC. En este estudio se detectaron las cumarinas aesculetina, escopoletina, los ácidos fenólicos ácido siríngico, ácido p-cumárico, ácido vanílico, y los flavonoides rutina, y naringerina. Al respecto, no existe a la fecha literatura que mencione un efecto biológico de estos compuestos. Sin embargo, hay dos peticiones de patentes químicas para los extractos fenólicos de la miel, que contienen los siguientes compuestos: ácido gálico, ácido cumárico, ácido ferúlico y ácido salicílico y flavonol kaemferol, y flavanona naringenina (Montenegro 2007a, 2008). En el caso de la miel de manuka de este estudio se detectaron el ácido salicílico, ácido cafeico y ácido vanílico como compuestos principales. Letospermum scoporium es la fuente de miel, conocida como manuka, muy reputada en el mercado por su actividad antibacteriana atribuida al compuesto siringato metílico, que sería el principio activo de dicho recurso (Inoue et al., 2005; Henriques et al., 2006). Esta miel conserva actividad antimicrobiana por bastante tiempo, atribuida a compuestos de tipo no peroxídicos (Gehldof et al., 2002).
Diversos trabajos científicos, han atribuido propiedades antibacterianas a compuestos fenólicos, un ejemplo es la galanginina, cuyo mecanismo de acción incluye la inhibición de la girasa de DNA de células bacterianas (Cushnie y Lamb, 2005). La galanginina además inhibiría la enzima topoisomerasa IV (Cushnie y Lamb, 2005); también se ha observado una actividad anti beta lactamasa del mismo compuesto (Denny et al., 2002). La hesperidina es un agente antioxidante (Kelly et al., 2005; Ferreres et al., 1996). Se ha informado recientemente que dimetil cafeato, galangina, quercetina, pinobanksina y pinocembrina son antioxidantes, inclusive en concentraciones inferiores a las muestras examinadas en el presente estudio (Muñoz et al., 2007). Las flavanonas actúan generalmente como fitoalexinas, compuestos que estimulan la respuesta sistémica adquirida de las plantas (SAR), protegiendo a las plantas contra el ataque de microorganismos, de insectos y herbívoros. Un ejemplo es el ácido salicílico, un inductor débil de SAR, en presencia de patógenos (Kawano et al., 2004).

CONCLUSIÓN

Los compuestos aislados no explican efectivamente la actividad microbiológica de la miel. Una interacción de los compuestos flavonoides, terpenos y ácidos fenólicos es la mejor explicación de los resultados microbiológicos. Por su parte los compuestos volátiles detectados podrían servir como marcadores de esta miel, complementando la identificación actual de las mieles (Montenegro et al., 2006) a través de la determinación del origen botánico de las mismas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por los proyectos FONDECYT 1060535, y CORFO INNOVA 06CN12IAD-01 a Gloria Montenegro.

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