ARTÍCULOS ORIGINALES

Trichoderma spp. promotoras del crecimiento en plántulas de Capsicum chinense Jacq. y antagónicas contra Meloidogyne incognita

Trichoderma spp. fostering growth on Capsicum chinense Jacq. seedlings and antagonistic against Meloidogyne incognita

 

Candelero DJ¹, AJ Cristóbal¹, RA Reyes¹, SJM Tun¹, AMM Gamboa², SE Ruíz¹

¹ Instituto Tecnológico de Conkal, Km. 16.3 antigua carretera Mérida-Motul, Conkal, Yucatán. C.P. 97345, México. Tel. 52 999 912 4135.
² Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Calle 43 No. 130, Col. Chuburná de Hidalgo, Merida, Yucatan, Mexico. C.P. 97200. Tel. 52 999 981 39 23.
Address Correspondence to: Dr. Jairo Cristóbal Alejo; e-mail: jairoca54@hotmail.com

Recibido / Received 16.V.2014.
Aceptado / Accepted 23.VII.2014.

 

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Resumen. Se evaluaron 14 cepas nativas de Trichoderma spp. provenientes de patosistemas silvestres y agrícolas del estado de Yucatán, México, con capacidad promotora del crecimiento en plántulas de Capsicum chinense Jacq. y su efecto antagónico de sus filtrados contra juveniles de segundo estadio (J2) de Meloidogyne incognita. Las cepasT05-02 y T27-08 mostraronlos mejores efectos significativos en la variable altura de planta con incrementos del 55,57 y 47,62%, la T07-04 con 29,48% más de longitud en la raíz, los aislamientos T02-01 y T07-04 aumentaron del 84,61 al 48,71% en el volumen radical y 53,40% de biomasa seca total. El análisis estadístico (p≤0,001) de los filtrados T43-13 y T43-14 causaron 100% de mortalidad a las 24 y a las 48 h. En la prueba de reversibilidad a las 24 h después de haber sustituido los filtradosT43-13, T43-14, T09-06 y T20-07 por agua destilada estéril, los J2 no recuperaron su viabilidad, por lo que se consideraron como las mejores cepas potenciales de Trichoderma spp. con capacidad antagónica de J2 de M. incognita.

Palabras clave: Filtrados; Chile habanero; In vitro; Agallador.

Abstract. Fourteen native strains of Trichoderma spp. from wildand agricultural pathosystems in the state of Yucatan, Mexico, with growth-promoting ability of Capsicum chinense Jacq. seedlings were evaluated and antagonistic effect of their filtrate against second-stage juveniles (J2) of Meloidogyne incognita. The strains T05-02 and T27-08 showed the best significant effects on plant hight variable increments 55.57 and 47.62%, theT07-04 with 29.48% more root length, theT02-01 and T07-04 isolates increased from 48.71 to 84.61% in volume radical and 53.40% of total dry biomass. Statistical analysis (p≤0.001) of T43 and T43-13-14 filtrates caused 100% mortality at 24 and 48h. In the test of reversibility to 24 h after replacing the filtrates T43-13, T43-14, TH09-06 and TH20-07 by sterile distilled water, the J2 did not recover their viability, so they were considered as the best potential strains of Trichoderma spp. with antagonistic capacity in J2 of M.incognita.

Keywords: Filtrates; Habanero chilli; In vitro; Knot-root.

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INTRODUCCIÓN

Las especies saprófitas de Trichoderma son microorganismos benéficos competitivos; por su plasticidad tienen la capacidad de actuar en forma oportunista y simbionte de plantas que predominan en los ecosistemas terrestres y acuáticos (Zhang et al., 2005). La capacidad de competencia por espacio, nutrimentos, reproducción y colonización en distintos ambientes, favorecen el contenido de materia orgánica,la protección contra infecciones al sistema radical y la resistencia a metabolitos tóxicos en respuesta a la invasión de un organismo extraño (Benítez et al., 2004; Harman et al., 2004; Ulacio et al., 2002). Dicha capacidad también tiene un efecto inductor sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas, debido a la formación de sideróforos quelatantes de hierro, y la presencia de hormonas reguladoras de crecimiento que actúan como estimulantes en tejidos meristemáticos primarios en partes jóvenes (Liu et al., 1995; Castro y Revillas, 2005). En algunos casos esta promoción de crecimiento resulta como consecuencia de la reducción de microorganismos patógenos mediante una acción antagónica contra el agente causal (Harman, 2006). Además las especies de Trichoderma establecen largos períodos de colonización en el interior de la epidermis produciendo compuestos capaces de inducir una respuesta local o sistémica de defensa para las plantas, en la que se involucran la síntesis y acumulación de fitoalexinas, flavonoides y derivados fenólicos (Harman et al., 2004; Vinale et al., 2006). Hay cepas de Trichoderma spp. que tienen un efecto antagonista contra M. incognita y M. javanica, al inhibir la eclosión de huevos, y la inmovilidad y muerte de Juveniles (J2) (Rosso et al., 2004; Siddiqui y Shaukat, 2004). Con el objetivo de contar con especies nativas, se aislaron 14 cepas de zonas agroecológicas del estado de Yucatán, y se estimó su efecto promotor de crecimiento en plántulas de C. chinense Jacq. y la capacidad antagónica de sus filtrados contra J₂ de M. incognita.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ubicación del experimento. El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Fitopatología e invernadero del área de producción e investigación del Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán, antigua carretera Mérida-Motul, Km 14,5 (21° 4' N, 89° 31' O).

Evaluación de la promoción del crecimiento en plántulas de C. chinense Jacq. Se aislaron 14 cepas del género Trichoderma del estado de Yucatán, México, con la técnica de partículas de suelo sin lavar (Bills et al., 2004). Cuatro de estas cepas pertenecieron a patosistemas agrícolas y diez a patosistemas silvestres. Los aislamientos crecieron en medio de cultivo papa-dextrosa agar (PDA) durante siete días con 12 h luz y 12 h oscuridad a 28 °C, y se realizaron cultivos monospóricos para la purificación de las cepas. Los morfotipos del género Trichoderma spp. se identificaron en base al tipo de colonia, al micelio con abundante ramificación, a los conidióforos en forma cónica o de pirámide, y a las fialosporas producidas individualmente o acumuladas en el ápice de las fiálides.
Con los cultivos monospóricos de cada cepa, se obtuvieron concentraciones de 1 x 10⁶ esporas/mL (Cubillos et al., 2009). Se estimó su efecto promotor de crecimiento en plántulas deC. chinense Jacq. Inicialmente las semillas se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% (Soria et al., 2002) y se depositaron en charolas de poliestireno de 200 cavidades, en sustrato comercial Sunshine. Posteriormente, se realizaron tres aplicaciones con la concentración de esporas indicada por cavidad: la primera al momento de la siembra, y la segunda y la tercera a los 15 y 30 días, respectivamente, después de la germinación. Cada cepa constituyó un tratamiento más un testigo sin la aplicación del hongo. La unidad experimental la constituyeron diez plantas con diez repeticiones, distribuidas en un diseño experimental completamente al azar en condiciones protegidas a 28 ± 2 °C en promedio. Las variables respuesta las conformaron: altura de planta, biomasa seca aérea, longitud de raíz, volumen y biomasa seca radical. Con la información se hicieron análisis de varianza y para la comparación de medias se utilizó el método de Scott y Knott (p=0,05) con el paquete estadístico INFOSTAT ver. 2011 (Di Rienzo et al., 2013).

Obtención del nematodo agallador M. incognita. Se colectaron raíces con agallas inducidas por M. incognita en plantas de Solanum lycopersicum L. cv Rio Grande y C. chinense Jacq. cv Criollo. Las raíces agalladas se depositaron en bolsas de papel estraza del número 8 conservadas a 6 °C en refrigeración durante 24 h. Posteriormente se lavaron con agua y se disectaron bajo el microscopio estereoscópico para extraer masas de huevos y obtener juveniles de segundo estadio (J₂) (Cristóbal et al., 2006; Arévalo et al., 2012).

Obtención de filtrados de cepas nativas de Trichoderma spp. De cada cultivo monospórico de ocho días de crecimiento en PDA, se obtuvo un disco de micelio de 5 mm de diámetro y se depositó en matraces de 250 mL de capacidad con medio de cultivo caldo de papa dextrosa (CPD), para su desarrollo durante 15 días a 28 °C. Después de este tiempo, el CPD se filtró con gasas estériles, luego se tomaron 50 mL del líquido sobrenadante y se filtraron a través de papel Whatmann No. 1 para luego centrifugarse a 3600 rpm durante diez minutos. Por último, el sobrenadante se filtró a través de un filtro Milipore de 0,45 μm (Nico et al., 2003). Los filtrados se almacenaron en refrigeración durante cinco días a 6 °C para su empleo en evaluaciones in vitro contra J₂ de M. incognita.

Antagonismo de filtrados de Trichoderma spp. contra J₂ de M. incognita. Para el ensayo in vitro se utilizaron siracusas a las cuales se les adicionó 1 mL de filtrado de cultivos monospóricos de Trichoderma spp. Se incorporaron 20 larvas (J₂) viables de M. incognita como unidad experimental con cuatro repeticiones, distribuidos en un diseño experimental completamente al azar en condiciones de laboratorio a 28 C. Se utilizaron 14 tratamientos correspondientes a cada una de las cepas de Trichoderma spp. Además, se consideró un tratamiento testigo sin filtrado fúngico, solo con agua destilada estéril. Como variable respuesta a la exposición del filtrado se consideró el porcentaje de inmovilidad de los nematodos a las 24 y 48 h de exposición; cada filtrado fue sustituido por agua destilada estéril, con el propósito de estimar el porcentaje de reversibilidad o viabilidad a las 24 h. La inmovilidad se corroboró empleando un pincel con el cual se estimuló al nematodo en su región cefálica. Cuando la respuesta al estímulo fue inmóvil, se consideró inviable al nematodo (Cristóbal et al., 2006).

RESULTADOS

Efecto en la promoción de crecimiento en plántulas de C. chinense Jacq. A los 45 días después de la siembra, la altura de plántula mostró altas diferencias significativas (p≤0,001). Las cepas nativas de Trichoderma spp. registradas como T05-02, T27-08, T09-06, T02-01 y T07-04, promovieron los mayores promedios con rangos que oscilaron entre 11,01 y 13,82 cm. Con la cepa T05-02 se estimó el mayor promedio con un incremento de al menos 55,57% respecto al testigo sin hongos, el cual alcanzó el valor más bajo con 6,14 cm (Tabla 1).

Tabla 1. Cepas nativas de Trichoderma en la promoción del crecimiento en altura y biomasa seca aérea en plántulas de C. chinense Jacq. en invernadero.
Table 1. Native strains of Trichoderma in stimulating height and aboveground dry biomass on seedlings of C. chinense Jacq under greenhouse conditions.

Nota: Medias con la misma letra dentro de columnas son estadísticamente iguales (p>0,05). Suelo de patosistemas silvestres¹ o agrícolas² del estado de Yucatán, C.V (Coeficiente de Variación).
Note: Means with the same letter within the same column are statistically equal (p>0.05). Soil of wild¹ or agricultural² systems in the state of Yucatán. C.V. (variation coefficient).

En relación a la ganancia de biomasa seca aérea (tallos y hojas), no se mostraron diferencias estadísticas entre tratamientos (p≤0,001). Sin embargo, los mayores promedios se obtuvieron con las cepas T05-02, T07-05 y T09-06, con 0,34; 0,32, y 0,32 g/planta, respectivamente. Esto representó un 41,17 y 47,05% más en la ganancia de biomasa aérea respecto al testigo.
Los tratamientos biológicos que incluyeron las cepas nativas T07-04, T02-01 y T05-02 provenientes de patosistemas agrícolas y silvestres promovieron incrementos en el crecimiento de raíces en plántulas de Capsicum chinense Jacq. Sin embargo, aun cuando no se detectaron diferencias estadísticas, permitieron aumentos del 26,49 al 29,50% en la longitud de la raíz con respecto al testigo que presentó un escaso crecimiento con 8,25 cm. En el volumen radical la T02-01 fue superior al resto de los tratamientos (84,61% de incremento). Luego se encontraron T07-04, T07-05, T20-07, T27-08 y T05-02 con valores que oscilaron entre 26,92 y 39,74% más en relación al testigo sin inoculantes. Dicho testigo tuvo el valor más bajo con 0,12 cm³ en el volumen radical. Al estimar la biomasa seca de la raíz, las cepas T07-05, T02-01, T09-06, T05-02, T07-04 y T20-07 fueron estadísticamente iguales, con incrementos del 37,50 al 62,50% en la ganancia de biomasa seca de raíz comparado con el resto de los tratamientos. El tratamiento testigo, sin inoculantes, alcanzó los promedios más bajos en la biomasa seca de la raíz con 0,03 g/planta (Tabla 2).

Tabla 2. Cepas nativas de Trichoderma en la promoción de la longitud, volumen y biomasa seca radical en plántulas de C. chinense Jacq. en invernadero.
Table 2. Native strains of Trichoderma in stimulating length, volume and root dry biomass on seedlings of C. chinense Jacq under greenhouse conditions.

Nota: Medias con la misma letra dentro de columnas son estadísticamente iguales (p>0,05). Suelo de patosistemas silvestres¹ o agrícolas² del estado de Yucatán, C.V (Coeficiente de Variación).
Note: Means with the same letter within the same column are statistically equal (p>0.05). Soil of wild¹ or agricultural² systems in the state of Yucatán. C.V. (variation coefficient).

Antagonismo de filtrados de Trichoderma spp. contra juveniles de segundo estadio de M. incognita. El análisis estadístico para estimar la capacidad de antagonismo de los filtrados de cepas nativas de Trichoderma spp. contra juveniles de segundo estadio (J₂) de M. incognita a las 24 y 48 h mostraron diferencias estadísticas (p≤0,01). A las 24 h, los filtrados provenientes de las cepas T43-13 y T43-14 ejercieron un 100% de inmovilidad; le siguieron los tratamientos T02-01 y T07-05 con 96,25 y 93,75%, respectivamente. A las 48 h de exposición, los tratamientos con las cepas T43-13, T43-14, T32-09 y T20-07 mostraron una efectividad del 95,50 al 100% de inmovilidad de J₂, seguido por los fltrados provenientes de las cepas T09-06, T07-05, T05-02 y T02-01.Éstas últimas mostraron entre 88,75 y 92,50% de inmovilidad de J₂. En las pruebas de reversibilidad después de 24 h sin exposición a los filtrados se demostró el efecto nematicida para las cepas: T43-13, T43-14, T02-01, T07-05, T09-06 y T27-08, ya que los J₂ fueron incapaces de recuperar su viabilidad (Tabla 3).

Tabla 3. Efecto de filtrados provenientes de cepas nativas de Trichoderma spp. en la inmovilidad de juveniles de segundo estadio de M. incognita.
Table 3. Filtrate effects from native strains of Trichoderma spp. on the juvenile immobility (second stage) of M. incognita.

Nota: medias con la misma letras dentro de columnas son estadísticamente iguales (p>0,05). Suelo de patosistemas silvestres¹ o agrícolas² del estado de Yucatán, A las 243 h después de cambiar los filtrados por agua destilada estéril. C.V. (Coeficiente de Variación).
Note: Means with the same letter within the same column are statistically equal (p>0.05). Soil of wild¹ or agricultural² systems in the state of Yucatán. After 243 h of changing the filtrates by deionized distilled water. C.V. (variation coefficient).

DISCUSIÓN

Algunas cepas nativas de Trichoderma spp. provenientes de patosistemas agrícolas y silvestres mostraron un efecto significativo en la promoción del crecimiento vegetal. Efectos similares fueron informados por Danger et al. (2000) en Solanum lycopersicun L. cuando evaluaron cepas nativas de Trichoderma spp. en concentraciones de 5 x 10⁹ esporas/mL. Estos autores determinaron incrementos de 9,87 a 11,39% en la altura de plántula con relación al testigo sin la aplicación de inoculantes. Guigón et al. (2004) observaron en C. annuum L. ganancias del 38% en biomasa aérea con cepas nativas de Trichoderma spp. comparadas con el testigo sin hongos fúngicos. Ortuño et al. (2013) lograron un aumento del volumen radical y la biomasa seca de Lactuca sativa L. de 67,5 y 82%, respectivamente, usando filtrados de cepas de Trichoderma spp. productoras deácido indolacético con dosis de 500 μL por planta. Contreras et al. (2009) en plantas de Arabidopsis, tratadas con T. atroviride y T. virens obtuvieron incrementos de cuatro a seis veces en el número de raíces laterales y una mayor actividad celular en el periciclo y el primordio de las plantas.
El efecto promotor del crecimiento en plántulas con las aplicaciones de Trichoderma spp. se ha atribuido a la presencia de ácido indolacético, que actúa como regulador de crecimiento, y de ácidos orgánicos, que retienen cationes y acidifican la rizosfera, lo cual solubiliza nutrimentos para su absorción por las plantas (Harman, 2000; Valencia et al., 2005). La estimulación del crecimiento también se atribuye a la liberación de estructuras quelatantes o sideróforos que favorecen la asimilación de iones como Ca, Fe₂0³, Mn0₂, Cu y Zn (Altomare, 1999).
En relación con la actividad antagónica de filtrados de las cepas nativas de Trichoderma spp. (T43-13 y T43-14), éstos mostraron efectividad biológica contra larvas del segundo estadio (J₂) de M. incognita. Estos resultados coinciden con lo realizado por Xalxo et al. (2013). Estos autores mostraron que al usar filtrados de T. viride, aisladas de la rizosfera en patosistemas agrícolas, inhibieron la movilidad de J₂ de Meloidogyne sp. del 65 al 93,75% a las 48 y 72 h, respectivamente. Mascarin et al. (2012), con una suspensión de 1 x10⁸ conidias/mL de T. harzianum (ESALQ-1306), redujeron la movilidad de J₂ de M. incognita al menos 59,40 ± 15,4% en bioensayos in vitro.
El efecto antagónico de los filtrados está relacionado con (1) el tipo de cepa, (2) la composición del sustrato empleado para su crecimiento (Vinueza et al., 2006), y (3) el tiempo de exposición de los juveniles de segundo estadio de este nematodo a los metabolitos secundarios contenidos en los filtrados de Trichoderma spp. (Sharon, 2007).
El 2,4-diacetilfloroglucinol aislado de Trichoderma spp. ejerce un efecto antagónico contra J₂ de Meloidogyne incognita (Siddiqui y Shaukat, 2004; Vinale et al., 2010). La producción de enzimas como quitinasas también inhibe la formación de la quitina sintasa, proteína asociada a la membrana plasmática de la pared celular, que en presencia de iones calcio altera la integridad de la membrana y reduce la viabilidad de los J₂ deMeloidogyne spp. (Pérez et al., 2006).
Las especies nativas de Trichoderma spp. T43-13 y T43-14 aisladas de suelos de patosistemas silvestres son prometedoras contra las poblaciones de J₂ de M. incognita al causar in vitro el 100% de mortalidad del nemátodo.

CONCLUSIONES

Las cepas nativas T05-02, T09-06, T07-05, T27-08 y T07-04 del género Trichoderma spp., aisladas de los patosistemas silvestres, ejercieron un efecto promotor de crecimiento al (1) obtener plantas más vigoras y altas de C. chinense Jacq., y (2) al conseguir mayor biomasa seca total (0,34 g/planta) comparadas con el testigo sin inoculantes. Asimismo, las cepas provenientes de los patosistemas silvestres T43-13 y T43-14 son potencialmente prometedoras para emplearse como antagónicas contra juveniles de segundo estadio de M. incognita. Esto se debe a que sus filtrados indujeron el 100% de mortalidad durante las primeras 24 h de exposición.

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