BIOQUÍMICA - FARMACIA

Aeromonas spp. involucradas en infecciones extraintestinales diagnosticadas en centros de salud de posadas, Misiones

Aeromonas spp. involved in extraintestinal infections diagnosed in health centers of posadas, Misiones

 

Marina, Quiroga¹; María Teresa Lezcano¹; Bibiana Martín Talavera¹

¹-Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones. Av. Mariano Moreno 1375. (3300) Posadas, Misiones.

• Marina Quiroga¹ Bioquímica. Especialista en Microbiología Clínica. Doctor de la Universidad de Buenos Aires, área microbiología. Profesor Adjunto. Cátedra Bacteriología, Carrera de Bioquímica, FCEQyN. UNaM. Categoría III. marinaquiroga@fceqyn.unam.edu.ar.
• María Teresa Lezcano¹ Bioquímica. Becaria Investigación CEDIT. Cátedra Bacteriología, Carrera de Bioquímica, FCEQyN. UNaM. Sin Categoría. terelezmaciel@yahoo.com.ar.
• Bibiana Martín Talavera¹ Bioquímica. JTP. Cátedra Microbiología General, Carrera Ingeniería Química, FCEQyN. UNaM. Categoría IV. bmartin@fceqyn.unam.edu.ar.

 

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Resumen

Estudiamos 21 cepas de Aeromonas involucradas en infecciones extraintestinales diagnosticadas en centros de salud de Posadas en el período 2002-2006. El 90,5 % de los aislamientos provenían de infecciones de piel, partes blandas y hueso. La edad promedio de los pacientes fue de 53 años, con predominio del sexo masculino. Se determinó la sensibilidad a diferentes antimicrobianos. La hidrólisis de ß-lactámicos y la presencia de ß-lactamasas se investigaron por el método iodométrico en agar y por métodos fenotípicos, respectivamente. Todas las cepas mostraron actividad hidrolítica frente a dos o más ß-lactámicos. Se detectó fenotípicamente la producción de ß-lactamasas inducibles no así la de ßLEE ni de metalo-ß-lactamasas. Nuestros resultados apoyan las hipótesis de que sería posible que la resistencia adquirida en Aeromonas spp. esté asociada al uso de antimicrobianos y mediada por mecanismos enzimáticos y presión selectiva causada por exceso de prescripciones.

Palabras Clave: Aeromonas; Infecciones extraintestinales; Susceptibilidad; Antimicrobianos.

Abstract

We studied 21 Aeromonas strains involved in extraintestinal infections diagnosed in health centers of Posadas in the period 2002-2006. A 90.5 % of the isolations were coming from skin, wounds and bone infections. The average age of the patients was 53 years old, with predominance of males. The susceptibility to different antimicrobial agents was determined. Hydrolysis on ß-lactams and the presence of ß-lactameses were investigated by the iodometric method on agar and by phenotypic methods, respectively. All of the strains showed hydrolytic activity in front of two or more ß-lactams. By phenotypic methods, the production of inducible ß-lactamases was detected but no ßLEE and metallo-ß-lactamases were detected. Our results support the hypotheses that it would be possible that the resistance acquired in Aeromonas spp. is associated to the use of antimicrobial agents and mediated by enzymatic mechanisms and selective pressure caused by excess of prescriptions.

Key Words: Aeromonas; Extraintestinal infections; Susceptibility; Antimicrobial agents.

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Introducción

Los miembros de la familia Aeromonadaceae han sido reconocidos hace más de 100 años. Durante muchos años, el mayor foco de atención respecto a esta familia se centró en su rol como patógenos de reptiles, anfibios y en especial, peces.

En 1968, una publicación de Von Graevenitz y Mensch [1] hizo que el estudio de estos microorganismos derivara hacia su rol como potenciales patógenos humanos.

Actualmente, la participación de estos microorganismos en gran variedad de infecciones humanas ha sido documentado mundialmente [2, 3], sugiriendo una etiología compleja en que las cepas poseen una variedad de factores de virulencia en diferentes asociaciones [4].

De entre los síndromes clínicos documentados destacan: bacteriemias y septicemias en pacientes inmunodeprimidos [5, 6, 7]; meningitis tanto en niños como en adultos [8]; peritonitis [9]; infecciones de tejidos blandos y huesos [6]; infecciones del tracto respiratorio en inmunocompetentes [10] e inmunocomprometidos [11,12]; raras infecciones oculares [13, 14]; y síndrome urémico hemolítico [15].

En los últimos años, ha sido informado su aislamiento en prostatitis y shock séptico [16]; fascitis necrotizante [17]; traqueobronquitis [18]; cistitis [19], entre otras infecciones humanas.

Respecto a su resistencia a antimicrobianos, diversos autores han propuesto que las especies de Aeromonas son capaces de adaptarse rápidamente a las drogas usadas comúnmente en medicina, representando un riesgo a la salud pública [20].

Por otra parte, ya ha sido informado [21, 22] que en estos microorganismos el inóculo bacteriano y la producción de múltiples ß-lactamasas, que se caracterizan por ser inducibles, es crítica para la manifestación de un fenotipo de resistencia.

En la última década, han aumentado los informes acerca de una alta mortalidad relacionada a infecciones extraintestinales causadas por Aeromonas spp., en especial en pacientes inmunocomprometidos [17, 23, 24].

Algunos microbiólogos [25] opinan que esto podría ser debido al poco conocimiento existente acerca de los patrones de resistencia que exhiben estas cepas extraintestinales, lo que impediría establecer un tratamiento empírico exitoso.

Por lo antes expuesto, hemos desarrollado este trabajo con el objetivo de conocer algunos rasgos epidemiológicos, estudiar la sensibilidad a antimicrobianos y detectar la presencia de enzimas ß-lactamasas en cepas de Aeromonas involucradas en infecciones extraintestinales diagnosticadas en pacientes internados en distintos centros de salud de la ciudad de Posadas, Misiones, Argentina.

Materiales y Métodos

Microorganismos

Se incluyeron en el estudio 21 cepas de Aeromonas spp. aisladas de infecciones extraintestinales en el período 2002-2007, en pacientes internados en el Hospital Central "Dr. Ramón Madariaga" y sanatorios privados de la ciudad de Posadas, Misiones.

Las cepas, conservadas en agar blando (caldo tripticasa soya, CTS + 7 0/00 agar-agar) a temperatura ambiente y en la oscuridad, fueron transferidas a placas de agar sangre, con técnica para aislamiento, a fin de corroborar su viabilidad y pureza.

La identificación bioquímica se realizó según metodología convencional [26].

Estudio de sensibilidad a antimicrobianos

Se determinó la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) por el método de dilución en medio líquido según normas y puntos de corte definidos por el CLSI [27].

Se ensayaron los siguientes antimicrobianos (droga pura de potencia conocida): ampicilina (AMN), gentamicina (GEN), trimetoprima-sulfametoxazol (TMS) y ciprofloxacina (CIP) de laboratorios Bagó, sulbactama (en asociación con ampicilina) (AMS) y cloranfenicol (CMP) de laboratorios Pfizer, cefalotina (CTN) y ceftazidima (CAZ) de Glaxo, cefotaxima (CTX) de Hoechst Marion Roussel, cefepima (FEP) y amicacina (AKN) de Bristol- Myers Squibb e imipenem (IMP) de Merck-Sharp and Dohme, todos ellos de Argentina.

Como controles se utilizaron cepas patrones: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35218 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Los ensayos se realizaron por duplicado.

Estudio de la actividad hidrolítica frente a ß-lactámicos Los ensayos de hidrólisis de ß-lactámicos de las cepas en estudio se realizaron por el método iodométrico en agar [28] trabajando con extractos enzimáticos crudos.

Para la obtención del extracto enzimático, una ansada de un cultivo de 24 hs de cada microorganismo fue transferida a un tubo estéril conteniendo 5 ml de caldo tripticasa soya (CTS) el que se incubó en incubador Shaker a 120 r.p.m, 35 ºC durante 6 hs. Luego del período de incubación, 1 ml del CTS fue transferido a un tubo cónico estéril conteniendo 9 ml de CTS fresco que se incubó a 120 r.p.m, 35º C durante 18 hs adicionales.

Cumplidos estos pasos se procedió a centrifugar los tubos a 5000 r.p.m. durante 20 minutos, con enfriamiento a 4 ºC cada 5 minutos.

El sobrenadante fue descartado y el sedimento se resuspendió en 5 ml de buffer fosfato 20 mM, pH 7 y se reiteró el proceso de centrifugación descrito.

Se descartó el sobrenadante y los pellets fueron resuspendidos en 3 ml de buffer fosfato 20 mM, pH 7 y sometidos a agitación con vórtex.

La ruptura celular se realizó por un proceso de congelación (-20 ºC)/descongelación (temperatura ambiente), 10 veces.

Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 12000 r.p.m. a 4 ºC durante 15 minutos.

Los extractos enzimáticos crudos fueron alicuotizados y conservados a -20º C hasta su utilización.

Para realizar el método iodométrico en agar [28], a 20 ml de medio de agar-almidón (0,5 gr de almidón soluble + 1,5 gr de agar-agar en 100 ml de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0), fundido y termostatizado a 45 ºC, se adicionó el substrato en concentración adecuada y 320 µl de una solución de I₂ / I- (2 % I₂, 55 % IK). La mezcla se homogeneizó y se volcó en placas de vidrio de 9 cm de diámetro. Una vez solidificado, se sembraron en cada placa 20 µl de los extractos enzimáticos crudos. Las placas fueron incubadas a 4 ºC, al abrigo de la luz durante 18 hs. Las lecturas se realizaron cada 4 hs.

Se ensayaron los siguientes substratos (concentración final): ampicilina (AMN, 500 µg/ml), cefalotina (CTN, 500 µg/ml), oxacilina (OXA, 500 µg/ml), cefoxitina (FOX, 1000 µg/ml) e imipenem (IMP, 1000 µg/ml).

La formación de un punto de decoloración en el sitio de depósito de la gota, debida a la reducción del iodo en presencia de los productos originados por la hidrólisis enzimática de los distintos antibióticos, fue considerada indicativo de la presencia de enzimas ß-lactamasas en los extractos (reacción positiva).

Los ensayos se realizaron por duplicado.

Búsqueda de ß-lactamasas

La búsqueda de la presencia de ß-lactamasas se realizó por métodos fenotípicos.

Los discos de antimicrobianos utilizados CTN (30 µg), FOX (30 µg), CAZ (30 µg), CTX (30 µg), cefotaxima -clavulánico (CTX-clav, 30/10 µg) y ceftazidima-clavulánico (CAZ-clav, 30/10 µg) así como los discos con los inhibidores ácido etilendiaminotetracético (EDTA, 372 µg) y ácido borónico (BOR, 300 µg) fueron provistos por Laboratorios Britania, Argentina. Los discos de IMP fueron provistos por OXOID, Argentina y los de amoxicilina-clavulánico (AMC, 20/10 µg) por BBL, Argentina.

Como control positivo se utilizó la cepa Aeromonas hydrophila AE036.

La producción de ß-lactamasas inducibles tipo AmpC se investigó con la técnica propuesta por Sanders [29] con discos de IMP y FOX, y el ensayo de sinergia con ácido borónico [30] con discos de CTN y FOX.

Para la búsqueda de ß-lactamasas de espectro extendido (ßLEE) se utilizaron: la metodología descripta por Jarlier [31] con discos de CAZ, CTX y AMC; y la propuesta por el CLSI con discos de CTX, CAZ, CTX-clav y CAZ-clav [32].

La búsqueda de metalo-ß-lactamasas se realizó utilizando el ensayo de Hodge modificado [33] con discos de IMP; el método descripto por Yong con discos de IMP e IMP/EDTA [34] y el ensayo de sinergia con discos de IMP y EDTA [33].

Resultados

Durante el Período 2002-2006 se recuperaron, de muestras clínicas extraintestinales, 21 cepas de Aeromonas spp. En el 76,2 % de dichas muestras, Aeromonas spp. fue el único microorganismo recuperado.

Diecinueve aislamientos (90,5 %) provenían de infecciones de piel, partes blandas y hueso: 6 de heridas cortantes, 6 de traumatismos óseos, 3 de úlceras infectadas, 2 de heridas quirúrgicas y 1 de pie diabético. En 1 caso sólo se informó herida sin mayor especificación. Las cepas restantes fueron recuperadas, 1 de líquido abdominal y 1 de absceso pulmonar.

La edad promedio de los pacientes involucrados fue de 53 años (rango 11-71 años), predominando los de sexo masculino (81 %).

Se identificaron: 19 A. hydrophila (90,4 %), 1 A. jandaei (4,8 %) y 1 A. schubertii (4,8 %).

Los resultados obtenidos en los estudios de sensibilidad (CIM90) se muestran en la Tabla 1. Todos los extractos enzimáticos de las cepas en estudio mostraron actividad hidrolítica frente a dos o más ß-lactámicos. AMN, IMP, OXA y FOX fueron los antimicrobianos más afectados.

Tabla 1. CIM₉₀ a distintos antimicrobianos de 21 cepas extraintestinales de Aeromonas spp.

El 100 % de los extractos hidrolizaron a AMN e IMP simultáneamente. De ellos, 11 (52,4 %) hidrolizaban también OXA y FOX, 3 (14,3 %) CTN, OXA y FOX, 2 (9,5 %) CTN y OXA, 1 (4,8 %) FOX y 1 (4,8 %) CTN (Tabla 2).

Tabla 2. Hidrólisis de ß-lactámicos por el método iodométrico de extractos crudos de 21 cepas extraintestinales de Aeromonas spp.

Utilizando FOX e IMP como inductores, en 12/21 (57,1 %) de los aislamientos se detectó la presencia de ß-lactamasas inducibles, comportándose FOX (10/12; 83,3 %) como mejor inductor que IMP (6/12; 50 %). Cuatro (4) aislamientos dieron resultado positivo con ambos antimicrobianos.

La sinergia con ácido borónico y cefalotina (11/21, 52,4 %) fue mejor indicador de la presencia de ß-lactamasas inducibles que dicha sinergia con cefoxitina (6/21, 28,6 %). Cinco (5) de estos aislamientos dieron un resultado positivo con ambos antimicrobianos.

Ninguna de las cepas de Aeromonas estudiadas mostraron fenotípicamente la producción de ßLEE ni de metalo-ß-lactamasas.

Discusión

Aeromonas spp., microorganismos ubicuos de medios acuáticos, presentan una distribución mundial.

Son agentes etiológicos de enfermedades en peces, reptiles y anfibios, siendo recuperados frecuentemente de agua, suelos y alimentos [2, 35].

El rol de estos microorganismos en gran variedad de infecciones humanas ha sido documentado mundialmente [2, 36, 37], siendo poco frecuente su aislamiento en infecciones extraintestinales tanto adquiridas en la comunidad como hospitalarias.

A pesar de las dificultades que implica su caracterización fenotípica [38], la diferenciación de cepas individuales de Aeromonas a nivel de especie es de importancia clínica y epidemiológica dada la variabilidad inter-especie en sus factores de virulencia, en los perfiles de susceptibilidad a antimicrobianos y en la distribución geográfica [39].

La identificación de los aislamientos incluidos en este estudio coincide con lo referido en la literatura, donde se informa que sólo cinco especies: Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas veronii biotipo sobria y biotipo veronii, Aeromonas jandaei y Aeromonas schubertii, han sido incuestionablemente establecidas como patógenos humanos, en virtud a su aislamiento (en cultivo puro) de infecciones extraintestinales. De ellas Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii biotipo sobria representan más del 85 % de los aislamientos clínicos [2].

Analizando los resultados, observamos que la edad promedio de nuestros pacientes (53 años, rango 11-71 años) coincide con lo referido por otros autores [40, 41]. Por otro lado, el predominio de las infecciones en hombres en nuestro trabajo (81 %), también es coincidente con lo relatado en la literatura [40, 41, 42, 43].

Esta relación de infecciones extraintestinales por Aeromonas, edad adulta y sexo masculino, podría deberse a la mayor posibilidad, en dicha franja etaria y género, de sufrir enfermedades malignas y enfermedades de base asociadas como enfermedades crónicas del hígado y cirrosis [44].

El mayor porcentaje (90,5 %) de nuestros aislamientos provenían de infecciones de piel, partes blandas y hueso. Probablemente, los principales factores de riesgo pueden haber sido las lesiones en contacto con agua contaminada, el suelo o cuerpos extraños. Hallazgos que han sido ampliamente descriptos en la literatura [45, 46].

En nuestro estudio, sólo en el 23,8 % de los casos, Aeromonas spp. se encontraban asociadas a otros microorganismos. Dicho porcentaje es menor a otros informes de la literatura [40, 45, 47].

La sensibilidad a antimicrobianos tanto de aislamientos clínicos, particularmente de origen intestinal, como ambientales de Aeromonas spp. ha sido ampliamente estudiada [35, 48, 49] presentándose como intrínsecamente susceptible a todos los antimicrobianos activos frente a bacilos Gram negativos no fastidiosos, con excepción de los ß-lactámicos.

En este estudio, la sensibilidad de los aislamientos extraintestinales refleja lo informado por otros autores [2, 49, 50]. Los hallazgos mostraron ser uniformemente resistentes a ampicilina y susceptibles a las cefalosporinas de 3º y 4º generación, carbapenemes, aminoglucósidos, cloranfenicol y ciprofloxacina, presentando un bajo nivel de resistencia a trimetoprima-sulfametoxazol y alta resistencia a cefalotina y al inhibidor sulbactama.

En cepas de Aeromonas ha sido descripta la presencia de múltiples ß-lactamasas (cefaloporinasas de clase molecular C, oxacilinasas de clase molecular D, metalo-ß-lactamasas de clase molecular B) [51, 52, 53], cada una de las cuales muestra selectividad frente a distintos sustratos, pero que al expresarse en conjunto se superponen.

La presencia de mecanismos enzimáticos participantes en la resistencia a ß-lactámicos de nuestras cepas, también fue observada en este estudio.

Se demostró la presencia de ß-lactamasas inducibles, por métodos fenotípicos, en más del 50 % de las cepas.

Ya ha sido descrito [54, 55] que muchas especies bacterianas, entre ellas Aeromonas spp., poseen ß-lactamasas cromosómicas inducibles que normalmente se expresan a muy bajos niveles. Sin embargo, en presencia de un inductor dicha producción enzimática se incrementa.

Los antibióticos ß-lactámicos difieren en su poder inductor, siendo cefoxitina e imipenem los más potentes. En este estudio, cefoxitina se comportó como mejor inductor que imipenem.

El aspecto clínico más importante de este fenómeno, es la emergencia de cepas resistentes que se asocian a fallas terapéuticas, ya que, por presión antibiótica, podrían emerger mutantes resistentes con síntesis de ß-lactamasas genéticamente desreprimida [56].

Respecto a la producción de ßLEE en cepas de Aeromonas, no es un evento frecuente. En la Argentina, recién en el año 2007, se realizó el primer informe de aislamiento de Aeromonas spp. portadora de ßLEE [57], hecho que no hemos detectado en este estudio.

Los extractos celulares mostraron actividad hidrolítica frente a penicilinas, cefalosporinas e imipenem, lo que indicaría la presencia de al menos dos enzimas diferentes, entre ellas una capaz de hidrolizar imipenem.

Esta conclusión se basa en el hecho de que en Aeromonas spp., las enzimas capaces de hidrolizar imipenem son consideradas verdaderas carbapenemasas, ya que poseen escasa actividad hidrolítica frente a sustratos diferentes a los carbapenemes [21].

La ausencia de su detección fenotípica podría deberse a que la expresión de metalo-ß-lactamasas en Aeromonas tiene niveles basales, siendo necesaria su inducción ó desrepresión para detectarlas fenotípicamente, aspecto que hemos observado en nuestras cepas [58] y que fuera ya descrito por otros autores [59].

Conclusiones

Nuestros resultados apoyan las hipótesis de otros autores quienes refieren que sería posible que la resistencia adquirida en Aeromonas spp. esté asociada al uso de antimicrobianos [60] y mediada por mecanismos enzimáticos y presión selectiva causada por un exceso de prescripciones [20].

Si bien las infecciones extraintestinales por Aeromonas spp. no son frecuentes y las enzimas que producen, al ser de origen cromosómico, no resultan particularmente preocupantes todavía, la amplia difusión de estos microorganismos en el medio ambiente los transforma en excelentes reservorios.

Por otra parte, el uso de antibióticos no ha disminuido, menos aún en áreas en desarrollo, por lo que no sería descabellado imaginar un futuro donde la presión selectiva nos enfrente a aislamientos multirresistentes, con el consecuente problema terapéutico.

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Recibido: 28/08/09.
Aprobado: 26/09/09.