BIOQUÍMICA - FARMACIA

Relación entre degradación de colorantes y oxidación de lignina residual causados por Ganoderma applanatum y Pycnoporus sanguineus en el licor negro kraft

Dye degradation and residual lignin oxidation relationship caused by Ganoderma applanatum and Pycnoporus sanguineus in kraft black liquor

 

Ernesto Shimizu¹, Jorge O. Velez Rueda¹, Pedro D. Zapata¹, Laura L. Villalba¹

¹-Programa de Celulosa y Papel. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales, UNaM. Laboratorio de Biotecnología Molecular. Módulo de Bioquímcia y Farmacia, FCEQyN, UNaM. Felix de Azara 1553, (N3300L- QH) Posadas, Misiones, Argentina. laura@fceqyn.unam.edu.ar.

• Ernesto Shimizu¹ Licenciado en Genética graduado en la Universidad de Misiones. Es ex-becario del CEDIT y de la FCEQyN. Actualmente realiza estudios de doctorado mediante una beca Agencia en el INTA EEA Balcarce. Posee presentaciones a congresos nacionales e internacionales.
• Jorge Omar Velez Rueda¹ Es Licenciado en Genética graduado en la Universidad de Misiones. Es ex-becario del CEDIT y de la FCEQyN. Posee presentaciones a congresos nacionales e internacionales.
• Pedro Darío Zapata¹ Doctor por la Universidad de Alcalá de Henares, en el programa Biomedicina. Profesor Regular Adjunto en las Cátedras de Biología Celular y Molecular (Bioquímica), Genética Molecular (Lic. en Genética), Biología Celular (Lic. en Genética) y Biotecnología Molecular (Ingeniería Química, Bioquímica y Farmacia). Posee actualmente la Categoría III en el Sistema Nacional de Incentivos a los Docentes-Investigadores. Se desempeña además como Director y Co-Director de proyectos Incentivados y Subsidiados por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Nación.
• Laura L. Villalba¹ Es PhD de la State University of New York, College of Environmental Science and Forestry. Profesor adjunto de los cursos Pulpados Químicos y Operaciones Fundamentales en la fabricación de la Pulpa y el Papel (Maestría en Ciencias de la Madera, Pulpa y Papel), Cátedras de Coloquio I, II, Organización Industrial y relaciones laborales (Tecnicatura Universitaria en Celulosa y Papel), Transferencia de masa (Ingeniería en Alimentos), Operaciones de Transferencia de masa (Ingeniería Química). Categoría III en el Sistema Nacional de Incentivos a los Docentes-Investigadores. Se desempeña además como Directora y Co-Directora de proyectos Incentivados y Subsidiados por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Nación.

 

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Resumen

El pulpado kraft para la obtención de pulpa para papel es un proceso de gran impacto ambiental, generando efluentes, tóxicos y altamente coloreados. Los hongos de pudrición blanca (WRF) son capaces de degradar eficientemente la lignina contenida en la madera mediante la acción de enzimas extracelulares, razón por la cual son considerados como una alternativa creciente en biotecnología. En este trabajo se analizó la capacidad de crecimiento y decoloración de dos WRF autóctonos de la Provincia de Misiones (Pycnoporus sanguineus cepa 1226 y Ganoderma applanatum cepa F) sobre colorantes y licor negro para evaluar la posibilidad de aplicación en procesos de biorremediación. El licor negro es un efluente del proceso kraft que contiene lignina solubilizada, el principal subproducto de la digestión de material lignocelulósico. Se llevaron a cabo ensayos de degradación de colorantes (medios sólidos) y ensayos de degradación de licor negro (medios sólido y líquido). Los ensayos de decoloración en medio sólido se realizaron en presencia de azul de bromofenol, verde de malaquita y licor negro a pH ácido y alcalino. Los estudios en medio líquido se realizaron mediante barridos espectrofotométricos desde 200 hasta 400 nm de medios conteniendo licor negro a pH ácido tratados con el hongo. Los ensayos de crecimiento y decoloración demuestran que ambos hongos utilizados poseen una buena capacidad degradativa que podría ser aprovechada en aplicaciones biotecnológicas para la industria de la celulosa y el papel.

Palabras Clave: Decoloración de colorantes; Hongos de pudrición blanca; Lignina; Degradación.

Abstract

Kraft pulping for paper production has a significant impact on the environment with the generation of highly colored and toxic effluents. Because white rot fungi (WRF) have a distinctive capacity for efficiently degrading wood lignin by the extracellular enzymes action, they are considered as a growing alternative in biotechnology. The growing and degrading ability of two WRF, Ganoderma applanatum and Pycnoporus sanguineus from Misiones (Argentina) in dyes and kraft black liquor was analyzed as a prospective application on bioremediation processes. Black liquor is a kraft pulping process effluent containing solubilized lignin, the primary organic by-product from the chemical digestion of lignocellulosic raw materials. Dye decolorization experiments (solid culture) and black liquor degrading studies (solid and liquid cultures) were conducted. Decolorization experiments in solid culture were conducted with bromophenol blue, malacchite green and black liquor at acid and alkaline pH. Liquid culture studies were quantified by uV spectrometric measurements. Residual lignin degradation was confirmed as a result of the change in absorbance by spectral scanning over the wavelength range from 200 to 400 nm Decolorization and degrading experiments validated the dye and lignin degrading ability of both fungi in solid and liquid cultures.

Key Words: Dye decolorization; White rot fungi; Lignin; Degradation.

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Introducción

Para la fabricación de pulpa para papel es necesario separar la celulosa y la hemicelulosa de la lignina, y producir la pasta o pulpa, siendo necesario la utilización de métodos químicos, mecánicos y/o una combinación de ambos [1]. La aplicación de estos procesos hace que la industria papelera contribuya a la polución ambiental, generando efluentes, tóxicos y altamente coloreados, con alto contenido de materia orgánica, los cuales presentan una alta demanda bioquímica y química de oxígeno (DBQ y DQO) [2]. Mientras que algunos de estos compuestos contaminantes se encuentran naturalmente en la madera, otros xenobióticos (ligninas cloradas, fenoles, dioxinas, furanos) se generan durante los procesos industriales, siendo en su mayoría recalcitrantes a la degradación y persistentes en la naturaleza [2]. Para eliminar estos agentes contaminantes, los efluentes son tratados por oxidación biológica en lagunas o sistemas de lecho fluido, reduciendo el DBQ y el DQO pero no el color. Esto hace evidente la necesidad de nuevas tecnologías que disminuyan la demanda de energía y sean eficientes en la detoxificación de efluentes, con los consiguientes beneficios para el ambiente.

La utilización de hongos que degradan la madera para la solución de problemas ambientales es una alternativa de creciente expansión en biotecnología. Los hongos de pudrición blanca (white rot fungi o WRF) son capaces de degradar eficientemente la lignina contenida en la madera mediante la acción de enzimas extracelulares [3, 4]. Los primeros estudios acerca de la capacidad degradativa de estos hongos fueron realizados por Kirk y Yang en 1979 sobre el basidiomicete Phanerochaete chrysosporium [5]. El interés acerca de este grupo de hongos y especialmente en sus enzimas ligninolíticas aumentó cuando Bumpus et al., [6], demostraron que P. chrysosporium era capaz de oxidar compuestos xenobióticos recalcitrantes como los compuestos aromáticos policíclicos, cloroaromáticos y tinturas poliméricas. Los estudios actuales demuestran que el tratamiento de efluentes con hongos ligninolíticos no sólo produce decoloración (hasta el 80 %) sino también detoxificación [7], razón por la cual los WRF ofrecen una opción innovadora para minimizar el impacto ambiental de los procesos contaminantes.

La aplicación de WRF y otros organismos en procesos biotecnológicos requiere previamente demostrar su potencial poder degradativo y su adaptación para el crecimiento en presencia de agentes tóxicos [8, 9]. Trabajos previos de nuestro grupo demuestran que algunos hongos xilófagos autóctonos de la Provincia de Misiones podrían ser aplicados a procesos de biorremediación porque producen una cantidad razonable de enzimas oxidativas [10, 11]. En este trabajo se analiza la capacidad de crecimiento y decoloración de dos WRF autóctonos de la Provincia de Misiones (Pycnoporus sanguineus y Ganoderma applanatum) sobre colorantes y licor negro para evaluar la posibilidad de aplicación en procesos de biorremediación.

Materiales y Métodos

Organismos utilizados

Se utilizó la cepa 2126 del hongo Pycnoporus sanguineus, provista por la Cátedra de Micología Experimental de la Universidad de Buenos Aires, y la cepa F de Ganoderma applanatum, provista por el cepario de la Facultad de Ciencias Forestales de Eldorado, Universidad Nacional de Misiones. Ambos hongos se sometieron a los mismos tratamientos para comparar sus respectivas actividades enzimáticas, realizándose todos los ensayos por duplicado.

Medios de cultivo y método de inoculación

Para el cultivo primario se utilizó agar-malta (agar 20 g/L, extracto de malta 12,7 g/L) a partir del cual se extrajeron tacos de agar con micelio para la inoculación de cada experimento. Los tacos fueron extraídos de placas con hongos de 5-7 días de incubación, mediante sacabocados metálico, cuadrangular, de 36 mm², incubándose en todos los casos en estufa a 29 ± 1 ºC.

Ensayos de decoloración

Los ensayos de decoloración fueron realizados en agar-malta glucosado (AMG: agar 20 g/L, extracto de malta 12,7 g/L y glucosa 10 g/L) y en agar-papa glucosado (PGA: agar 20 g/L, glucosa 10 g/L y papa rayada 300 g/L). Los colorantes utilizados fueron rojo fenol 50^µM, verde de malaquita 50^µM (VM) y azul de bromofenol 50^µM (AB). Los controles negativos de degradación fueron los medios de cultivo con el colorante sin inóculo. Todos los ensayos se realizaron por duplicado sobre placas de Petri de 9 mm de diámetro.

Ensayos de decoloración de licor negro

Para estos ensayos se utilizó el licor negro (subproducto viscoso de color oscuro del proceso kraft, compuesto principalmente por residuos de lignina, agua y químicos inorgánicos utilizados en el proceso) obtenido en la Planta Piloto de la FCEQyN-UNaM a partir la cocción alcalina de chips de madera (cocción Kraft).

Los ensayos de decoloración de licor negro en medio sólido se realizaron en agar glucosado (agar 20 g/L y glucosa 10 g/L) a diferentes diluciones del licor negro, 1:1, 1:2, 1:4, 1:15 y 1:30 (v/v) a pH^11 (habitual del licor negro) y pH^4,7 (por adición de H₂SO₄ 4N). Todos los ensayos se realizaron por duplicado sobre placas de Petri de 9 mm de diámetro.

El medio utilizado para los ensayos de decoloración de licor negro en medio líquido contenía 1 % glucosa y licor negro a una dilución de 1:15 v/v pH^4.7 ajustado con H₂SO₄ 4N. Se realizó el filtrado del total del medio de cultivo y se realizó un barrido espectral entre 200 y 400 nm mediante espectrofotómetro Techcomp 8500 II, comparando el medio inoculado con un control sin inóculo y determinando el cambio de absorbancia.

Resultados y Discusión

Primeramente se realizó un ensayo de capacidad oxidativa utilizando medios con colorantes y posteriormente se relacionó esto con la deslignificación evaluando la capacidad de ambos hongos para decolorar el efluente industrial licor negro.

Pycnoporus sanguineus mostró un comportamiento similar en ambos medios utilizados (AMG y PGA), no observándose diferencias significativas entre el crecimiento sin colorante con el crecimiento en presencia de AB, sin embargo el colorante VM produjo una considerable inhibición para el desarrollo del hongo en ambos medios. En todos los casos no se observaron diferencias significativas entre el halo de decoloración observado y el diámetro de crecimiento del hongo. (Figura 1)

Figura 1. a) curva de crecimiento-decoloración de P. sanguineus en medio agar malta glucosado (AMG). b) curva de crecimiento-decoloración de P. sanguineus en medio agar papa glucosado (PGA).

Ganoderma applanatum también mostró similar comportamiento en ambos medios de cultivo, no encontrándose diferencias significativas entre el crecimiento sin colorante y en presencia de colorantes, tanto para AB como para VM. Para este hongo tampoco se observaron diferencias significativas entre el halo de decoloración y el diámetro de crecimiento. (Figura 2)

Figura 2. a) curva de crecimiento-decoloración de G. applanatum en medio agar malta glucosado (AMG). b) curva de crecimiento-decoloración de G. applanatum en medio agar papa glucosado (PGA).

Al comparar la tasa diaria de crecimiento y degradación de ambos hongos en presencia de azul de bromofenol (representados por las pendientes de la curva lineal en ambos casos) se puede observar que G. applanatum crece más lentamente que P. sanguineus (Figura 3), mientras que en presencia de verde de malaquita P. sanguineus casi no produce desarrollo (Figura 1).

Figura 3. a) Curva de crecimiento-decoloración en presencia de AB. b) Análisis mediante regresión lineal. R

Ensayos sobre licor negro

Los ensayos en medios sólidos con licor negro mostraron desarrollo de los hongos únicamente con diluciones de 1:15 a pH^4,7 (Figura 4) y 1:30 a ambos pH analizados (Figura 5).

Figura 4. Curva de crecimiento en licor negro diluido 1:15 a pH 4,7. Referencias: a) P. sanguineus, b) G. applanatum.

Figura 5. Curva de crecimiento en licor negro diluido 1:30 a pH 4,7 y pH 11, para a) P. sanguineus y b) G. applanatum.

Como se observa, ambos hongos mostraron un comportamiento similar en presencia de azul de bromofenol, así como en presencia de licor negro en medio ácido, mostrado por los resultados obtenidos en ensayos con licor negro en medio sólido que se correlacionan con los resultados en cultivos en medio líquido conteniendo el efluente a una dilución de 1:15 a pH^4,7. Sin embargo, al evaluar la decoloración sobre verde de malaquita y sobre licor negro a un pH alcalino únicamente G. applanatum fue capaz de desarrollarse y decolorar, lo que podría indicar la mejor adaptabilidad de este hongo frente a los contaminantes xenobióticos.

Otras cepas de Pycnoporus sanguineus ya han sido ensayadas con anterioridad por otros autores, estando demostrado su potencial biotecnológico [12, 13, 14], razón por la cual se lo tomó como especie de referencia para comparar el comportamiento de otras especies no descriptas como potencialmente útiles en biotecnología, como es el caso de G. applanatum. Por otro lado los ensayos de screening realizados por nuestro grupo con anterioridad sobre estas cepas indican su posible utilidad teórica deducida de las enzimas producidas por estos hongos y su acción sobre Poly R475 [15] corroborada ahora a través de este trabajo mediante el uso directo sobre el efluente principal de este tipo de procesamiento industrial. Los resultados de la barrida espectral realizados en medios líquidos luego de 10 días de cultivo del hongo sobre el medio con licor negro (Figura 6) muestran una disminución significativa de la absorbancia del medio tratado respecto del control al cual no se realizó la inoculación con el hongo. Ambos espectrogramas muestran la misma forma típica de la lignina, con un primer máximo a los 220-230 nm y un segundo a los 270-280 nm originados por grupos fenólicos no-condensados de la lignina [16].

Figura 6. Curva de absorbancia para medio conteniendo licor negro tratado: a) P. sanguineus, b) G. applanatum. Referencias: Medio tratado, Medio de control. Se muestra la media de dos experimentos similares.

La forma conservada del espectro del licor negro inoculado respecto a la de control indica que la estructura básica del polímero de lignina está conservada y específicamente la reducción del pico de 280 nm indica actividad ligninolítica del hongo.

Se puede observar también que la intensidad de la absorbancia está relacionada con la concentración de lignina, siendo menor en el caso de las muestras biotratadas.

Estos resultados permiten vislumbrar la posibilidad de realizar los ajustes a escala piloto e industrial que permitan iniciar experimentos de cara a una aplicación biotecnológica de esta propiedad en el tratamiento de efluentes. En el caso de plantas de pequeña escala esta alternativa se torna interesante ya que los costos de instalación y operación asociados a unidades convencionales de recuperación química son muy elevados.

Conclusiones

Tanto la cepa F de Ganoderma applanatum como la cepa 2126 de Pycnoporus sanguineus poseen la capacidad de crecimiento y decoloración sobre los colorantes azul de bromofenol y verde de malaquita, así como sobre el efluente de la industria papelera licor negro.

Estos estudios demuestran que ambos hongos poseen una buena capacidad degradativa que podría ser aprovechada en aplicaciones biotecnológicas para la industria de la celulosa y el papel.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a la Cátedra de Micología Experimental de la Universidad de Buenos Aires y al cepario de la Facultad de Ciencias Forestales de Eldorado de la Universidad Nacional de Misiones por la cesión gentil de las cepas fúngicas.

Parte de este proyecto fue financiado por la Fundación Banco Río, mediante el otorgamiento del 1º premio al Trabajo Científico Innovador.

Ernesto Shimizu ha realizado este trabajo mediante una beca concedida por el Comité Ejecutivo de Desarrollo e Innovación Productiva (CEDIT) de la Provincia de Misiones, Argentina.

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Recibido: 16/12/08.
Aprobado: 17/02/10.