BIOQUÍMICA-FARMACIA

Mejoras en la técnica de cromatografía en capa delgada de ácidos biliares fecales para la identificación de felinos

Improvements in the thin layer chromatography technique for fecal biliary acids for the identification of felines

 

Pablo F. Martina¹, Nora M. Sosa¹, Hernán A. Vilte¹, Gabriel A. Duette¹, Eusebia C. Valdez¹

1. Cátedra de Química Biológica y Química Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones. Félix de Azara n° 1552, Posadas 3300, Misiones, Argentina. CP:N3300LQH. nvaledez@fceqyn.unam.edu.ar

• Pablo F. Martina¹ Licenciado en Genética. FCEQyN - UNaM; Doctorado de Ciencias Exactas (en curso) - Fac. Cs. Exactas -UNLP., JTP-Cátedra Química Biológica. Carreras: Licenciatura en Genética. Profesorado en Biología, FCEQyN, UNaM; Categoría V Sistema de Incentivos Docentes-Investigadores.
• Nora Mabel Sosa¹ Ingeniero Químico. FCEQyN - UNaM; Especialista en Docencia Universitaria. - FHyCS - UNaM., JTP - Cátedra Química Orgánica. Carreras: Licenciatura en Genética. Profesorado en Biología. FCEQyN, UNaM; Categoría V Sistema de Incentivos Docentes-Investigadores.
• Hernán Vilte¹ Estudiante de Licenciatura en Genética. FCEQyN - UNaM; Auxiliar de 2da - Cátedra Química Biológica.- Carreras: Licenciatura en Genética. Profesorado en Biología. - FCEQyN-UNaM.
• Gabriel Duette¹ Estudiante de Licenciatura en Genética. FCEQyN - UNaM; Auxiliar de 2da - Cátedra Química Biológica. Carreras: Licenciatura en Genética. Profesorado en Biología. - FCEQyN-UNaM.
• Eusebia Concepción Valdez¹ Ingeniero Químico. FCEQyN - UNaM; Especialista en Docencia Universitaria. - FHyCS - UNaM., Profesor Adjunto - Cátedra Química Orgánica. Carreras: Licenciatura en Genética. Profesorado en Biología. FCEQyN, UNaM; Categoría III Sistema de Incentivos Docentes-Investigadores.

 

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Resumen

El estudio de los ácidos biliares de heces como un método no destructivo se ha utilizado para estimar tamaño poblacional y hábitos alimentarios en animales carnívoros. Sin embargo las técnicas clásicas demandan varias horas y requieren solventes altamente tóxicos para el operador, por lo cual se buscó optimizar la técnica reduciendo tiempo y evaluando nuevas combinaciones de solventes. Diecinueve muestras de materia fecal de 5 especies de felinos y 1 perro fueron secadas, pulverizadas. Se ensayaron 3 combinaciones de solventes extractores y 4 fases móviles. Las placas TLC corridas y secadas fueron reveladas por inmersión en solución de anisaldehído.

Palabras clave: Cromatografía en capa delgada; TLC; Identificación de felinos; Ácidos biliares fecales.

Abstract

The study of the biliary acids of feces as a non-destructive method was used to estimate population size and eating habits in carnivores. However, the classical techniques are time-consuming and require solvents which are highly toxic to humans. For this reason, we were looking for the optimization of the technique, by reducing time and evaluating new combinations of solvents. Nineteen feces samples of five species of felines and one species of canine were dried and powdered. Three combinations of solvent extractors and four mobile phases were assayed. The run and dried TLC sheets were developed by immersion in an anisaldehyde solution.

Key words: Thin layer chromatography; TLC; Felids identification; Fecal bile acids.

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Introducción

El estudio de las heces como un método no destructivo se ha utilizado para estimar tamaño poblacional y hábitos alimentarios en animales carnívoros [1]. Características tales como tamaño, forma y olor contribuyen a su identificación pero estas evidencias no siempre están presentes, principalmente porque varias de éstas son sensibles a las condiciones ambientales, no así los ácidos biliares fecales y sus concentraciones respectivas, las cuales son especie específicas [2-3].

Se ha demostrado que la cromatografía en capa delgada (TLC) es eficiente para distinguir, a través de los perfiles de ácidos biliares, entre distintas especies de felinos [4 a 8]. El protocolo original y algunas de las modificaciones de la técnica utilizan solventes altamente tóxicos para el operador [9] y [10]. El objetivo del presente trabajo fue la búsqueda de solventes menos tóxicos evaluando su capacidad de extracción y luego la estandarización de una técnica que pueda diferenciar entre nuestros felinos regionales.

Materiales y métodos

Las muestras obtenidas provienen de animales mantenidos en cautiverio en el Centro de Recría de Candelaria (Provincia de Misiones) y en el Complejo Ecológico Municipal de Presidencia Roque Saenz Peña (Provincia del Chaco). Se analizaron 7 Pumas (Puma concolor), 4 yaguaretés (Panthera onca) de ambos sexos, 3 gatos monteses (Oncifelis geoffroyi), 2 gatos del Pajonal (Lyn-chailunus colocolo), 3 gatos domésticos (Felis catus) y 1 perro (Canis domesticus).

Se secaron las heces en estufa a 45 °C y se pulverizaron con mortero, se tamizaron para separar pelos. Se pesaron 0,5 gramos de muestra seca de cada espécimen y se disolvió en 5 ml de las fase extractoras benceno:metanol (1:1), benceno:etanol (1:2) y cloruro de metileno:metanol (1:1), se disolvió por ultrasonido durante 60 segundos y se dejó reposar con agitaciones periódicas cada 30 minutos durante 2 horas a temperatura ambiente en frascos color caramelo, luego se filtró en vidrio poroso y se evaporó el sobrenadante en estufa a 60 °C hasta sequedad. Se redisolvió en 2 ml del mismo solvente y se sembraron de 15 a 20 ul del extracto en placa de silicagel Merck 20x20, G60 de 250 um. Se saturó la cuba cromatográfica con 4 combinaciones por separado para cada método de extracción de fase móvil tolueno:ácido acético :agua (5:6:1), hexano:metiletilcenotna:ácido acético (58:36:8), acetonitrilo:agua:ácido acético (1:1:1) y acetonitrilo:ácido fosfórico (2:1) y se colocaron las placas en el interior de la cuba, dejándolas correr durante 90 minutos. Una vez realizada la corrida se secaron las placas y se revelaron por la técnica de inmersión, con la solución de anisalde-hído: ácido acético glacial: ácido sulfúrico (0,5:50:1) y se colocaron en estufa a 130 °C durante 10 a 15 minutos (reactivos de ANEDRA S.A., Buenos Aires). Se utilizaron como patrones Colesterol 0,2 % (WINNER, USA) y acido desoxicólico 0,1 % (Sigma, USA). Las experiencias se realizaron por duplicado para la mayoría de las combinaciones probadas. Para cada banda observada se calculó el valor Rf promedio como la distancia recorrida por una banda dividida la distancia máxima recorrida por el solvente (frente de corrida).

Resultados y Discusión

Los resultados evidenciaron que la combinación de los solventes benceno-metanol y cloruro de metileno-metanol poseen similar capacidad extractora pero a su vez superior a la mezcla benceno-etanol, verificada en la cantidad de manchas e intensidad de las mismas (ver Figura 1). En cuanto a la capacidad resolutiva de las fases móvil ensayadas acetonitrilo-agua-ácido acético, acetonitrilo-ácido fosfórico y hexano-metiletilcenotna-ácido acético presentaron una baja afinidad por la fase estacionaria, que se evidenció en un menor tiempo de corrida que la fase móvil tolueno-ácido acético-agua, dando como resultado una menor capacidad resolutiva.

Figura 1. Perfil de ácidos biliares de Panthera onca. Solución extrac-tora Benceno-Metanol (a) y Benceno-Etanol (b), resueltas en fase móvil Tolueno-Ac. acético-Agua (izquierda) y Acetonitrilo-Ac. acético-Agua (medio).* corresponde al patrón de colesterol. Comparación entre muestras, almacenada 3 años (c) y fresca (d) (derecha)..

Sólo se obtuvieron resultados reproducibles y claramente interpretables utilizando tolueno-ácido acético-agua en las proporciones mencionadas. Se observó variación aunque no significativa según el análisis comparativos de los Rf, en el patrón de separación entre las manchas de diferentes individuos de la misma especie, pudiéndose deber a la propia variabilidad inherente de la especie [8]. Para evaluar la estabilidad de los ácidos biliares fecales en muestras almacenadas, se realizaron corridas simultánea con muestras frescas del mismo animal. Se observo que el número de las principales manchas detectadas no se modificaron en muestras analizadas de hasta 3 años de antigüedad no así la intensidad de las manchas que en algunas muestras se atenuó (ver Figura 1). Lynchailunus colocolo fue la especie en la cual se detectaron el mayor numero de manchas. Si bien las especies analizadas poseen en común varias de las manchas de su perfil de ácidos biliares, no encontramos 2 perfiles iguales, lo que posibilita la identificación de cada especie a través de un patrón específico (ver Tabla 1). Se evaluó el perfil de corrida de la muestra de perro como un outgroup, observándose claramente distinguible al de todos los felinos, pero se recomienda evaluar otras especies.

Tabla N° 1. Manchas detectadas en las especies estudiadas.

Conclusión

La combinación de solvente extractor cloruro de metileno-metanol y la fase móvil tolueno-ácido acético-agua resultaron ser las más adecuadas ya que mostraron poseer condiciones deseadas y son de menor toxicidad relativa (ver tabla 2).

Tabla N° 2. Clasificación según características químicas de los reactivos utilizados [10].

Esta metodología mostro ser capaz de discriminar claramente entre félidos y cánidos analizados, si bien las condiciones ensayadas son apropiadas para la identificación de felinos a partir de los ácidos biliares de heces, se deberán seguir buscando solventes y combinaciones de ellos que presenten las condiciones aptas buscadas, para una óptima resolución de las diferentes manchas del patrón de ácidos biliares que distingan con mayor precisión entre estas y otras especies simpátricas.

Se recomienda esta metodología por ser sencilla, rápida y precisa para evaluar la presencia de especies carnívoras en nuestra región.

Agradecimientos

Los autores agradecemos al Centro de Recría de Candelaria (Provincia de Misiones) y al Complejo Ecológico Municipal de Presidencia Roque Sáenz Peña (Provincia del Chaco) por las muestras aportadas. A las Dra Cecilia I. Catanesi y Cristina E. Mayol por la corrección del manuscrito. Al Ing. Darío J. Ferreyra (Laboratorio Central de la Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales) y a los estudiantes de Licenciatura en Genética Teresa Espinosa, Germán Traglia, Soledad Soto y Nahuel Rodriguez-Rodrigues por su colaboración técnica. Al Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico (CIDeT).

Referencias bibliográficas

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3. Johnson M.K., Belden R.C. y Aldred D.R. Differentiating Mountain Lion and Bobcat Scats. J. Wildl. Manag. vol. 48, p. 239-244.1984.         [ Links ]

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9. Khorozyan I.G., Cazón A.V., Malkhasyan A.G. y Abramov A.V. Using Thin-Layer chromatography of Fecal Bile Acids to Study the Leopard (Panthera pardus ciscaucasica) Population. Biology Bulletin, 2007, vol. 34, No. 4, p. 361-366. 2007.         [ Links ]

10. Commission Directive 2001/59/Ec on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances. OJEC L225 of 2001-08-21, pp. 1-333. 2001.         [ Links ]

Recibido: 31/08/09.
Aprobado: 18/05/10.