INGENIERÍA, TECNOLOGÍA E INFORMÁTICA

Efecto de cultivos lácticos sobre el desarrollo a bajas temperaturas de microorganismos causantes de ETA

Effect of bioprotective lactic cultures on the growth of food-borne pathogenic microorganisms at low temperatures

 

Silvia G. Ortiz^1,*, Laura B. Duverne¹, Oscar C. López¹, Silvia Raffellini¹, María C. Mans¹

¹ Universidad Nacional de Luján, Departamento de Tecnología, Buenos Aires, Argentina.
* E-mail: ortizs@unlu.edu.ar

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Resumen

El incremento de la demanda de vegetales mínimamente procesados trajo aparejada una mayor incidencia de brotes de ETA asociados con su consumo. La aplicación de bacterias lácticas podría limitar el desarrollo de microorganismos patógenos en estos alimentos durante su almacenamiento en frío. El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto de cultivos lácticos aislados de vegetales mínimamente procesados sobre el desarrollo de microorganismos patógenos e indicadores en sistema modelo a bajas temperaturas. Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidis y Escherichia coli se inocularon en caldo triptona soja (104 ufc/ml) en cocultivo con cepas nativas de bacterias lácticas, y se incubaron 4 días a temperaturas entre 5 y 15 ºC. Periódicamente se hicieron recuentos de microorganismos sobrevivientes. L. monocytogenes, en los controles sin cultivos lácticos, presentó fase lag solamente a 5 ºC, y a 15 ºC alcanzó la fase de crecimiento estacionario a las 48 h de incubación. Con la adición de cultivos lácticos se prolongó la fase lag, disminuyó la velocidad de crecimiento y no se alcanzó la fase de crecimiento estacionario durante los 4 días de incubación. S. Enteriditis se mantuvo estable a 5 ºC, sin diferencia significativa entre los tratamientos en cocultivo con bacterias lácticas y el control. En cambio, a 15 ºC en cocultivo con bacterias lácticas se observó menor velocidad de crecimiento. E. coli no presentó diferencias significativas entre los tratamientos control y en cocultivo con bacterias lácticas. Se concluye que los cultivos lácticos nativos podrían funcionar como barrera adicional para limitar el desarrollo de patógenos en alimentos a bajas temperaturas, sin incidir en el desarrollo de los indicadores.

Palabras clave: Bioprotección; Bacterias lácticas; Listeria monocytogenes; Salmonella Enteritidis; Escherichia coli.

Abstract

Increasing demand for minimally processed vegetables brought about a higher incidence of outbreaks of foodborne illnesses associated with their intake. Lactic acid bacteria may limit the development of pathogens in these foods during cold storage. The objective of this work was to evaluate the effect of lactic acid bacteria isolated from minimally processed vegetables on the growth of pathogenic and indicator bacteria in a model system at low temperatures. Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidis and E. coli were inoculated into tryptone soy broth (concentration: 104 cfu / ml) in coculture with native lactic acid bacteria strains, and incubated for 4 days at temperatures between 5 and 15 °C. Periodically, bacteria survivors were determined by the plate-count technique. Control treatments of L. monocytogenes (without lactic cultures added) showed only lag phase at 5 °C, and reached the stationary growth phase at 15 °C - 48 h. With lactic cultures added, L. monocytogenes showed a longer lag phase, a slower growth rate and did not reach the stationary-phase during the 4 days of incubation. S. Enteritidis remained stable at 5 °C, without significant difference between control and treatments in coculture with lactic bacteria. In contrast, at 15 °C S. Enteritidis showed slower growth rate in coculture with lactic acid bacteria. E. coli showed no significant differences between treatments in control and co-culture with lactic acid bacteria. In conclusion, the native lactic cultures could function as an additional barrier to limit the growth of pathogens in food at low temperatures, without affecting the growth of indicators.

Keywords: Bioprotection; Lactic acid bacteria; Listeria monocytogenes; Salmonella Enteritidis; Escherichia coli.

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Introducción

Las hortalizas y frutas frescas son vulnerables a la contaminación con microorganismos que pueden provocar enfermedades trasmitidas por alimentos (ETA) debido a su consumo sin ningún tipo de procesamiento térmico ⁽¹⁾. El riesgo de producción de ETA se ve agravado por la ausencia de controles microbiológicos sistemáticos en estos productos y por los cambios operados en los últimos años en los sistemas de comercialización, como por ejemplo el expendio bajo nuevas formas de presentación, tales como los llamados productos frescos cortados o productos de IV GAMA mínimamente procesados ⁽²⁾. El incremento de la demanda de vegetales de IV GAMA trajo aparejada una mayor frecuencia de incidencia de brotes de ETA asociados con su consumo, producidos por virus, parásitos y bacterias ^{(3, 4)}. Entre las bacterias involucradas en dichos brotes se destacan Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7 y Shigella spp. ^{(5, 6, 7)}. En respuesta a la preocupación respecto a la inocuidad microbiológica de frutas y hortalizas mínimamente procesadas, las agencias de salud pública están estableciendo especificaciones microbiológicas para el control de estos productos en las que se estipula la investigación de estos patógenos o de microorganismos que pudieran ser indicadores de la presencia de los mismos ⁽⁸⁾. Paralelamente, la industria de los vegetales mínimamente procesados se encuentra en constante búsqueda de nuevas tecnologías para el mantenimiento de la calidad y para la inhibición del crecimiento de microorganismos indeseables en todos los pasos de la cadena de producción y distribución ⁽⁹⁾. Entre las alternativas disponibles se destaca la utilización de tecnologías basadas en la "bioconservación" o "bioprotección", que se define como la aplicación de microorganismos antagónicos o sus productos metabólicos para inhibir o destruir la microbiota indeseable (autóctona o contaminante, patógena o deteriorante) de un alimento, produciendo por consiguiente el incremento de la inocuidad y la vida útil sin modificar en forma perceptible la calidad sensorial del mismo ⁽¹⁰⁾.
La aplicación de cultivos lácticos bioprotectores concentrados podría ser una herramienta para inactivar o limitar el desarrollo de microorganismos patógenos en vegetales frescos o mínimamente procesados durante su almacenamiento en frío ^{(11, 12)}, pues a bajas temperaturas las bacterias lácticas ejercerían su capacidad antagónica por ocupación espacial de nicho ecológico y excreción de metabolitos antimicrobianos (por ejemplo bacteriocinas), pero sin producir procesos fermentativos que modifiquen la calidad sensorial del producto alimenticio ⁽¹³⁾. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de cultivos lácticos, aislados de vegetales mínimamente procesados, en el desarrollo de microorganismos patógenos e indicadores en sistema modelo (medio de cultivo líquido) a bajas temperaturas.

Materiales y métodos

Microorganismos, condiciones de almacenamiento y preparación de inóculos
En este trabajo se utilizaron Listeria monocytogenes ATCC 7644 y Salmonella enterica subsp. enterica serov. Enteritidis MA 44 como cepas representativas de patógenos causantes de ETA en vegetales frescos y mínimamente procesados, y Escherichia coli ATCC 35218 como cepa representativa de microorganismos indicadores de contaminación fecal y de probable presencia de microorganismos patógenos entéricos en estos alimentos. Las cepas se conservaron a - 20 °C en caldo triptona soja (TSB, Biokar Diagnostic, Beauvais, Francia) suplementado con 0,6% de extracto de levadura y adicionado con 15% de glicerina. Antes de ser empleadas en los ensayos correspondientes, las cepas se inocularon en TSB suplementado con 0,6% de extracto de levadura y se incubaron durante 24 h a 37 °C. Los cultivos resultantes se emplearon como inóculo en los ensayos.
Como cultivos lácticos bioprotectores se utilizaron las cepas mesófilas Leuconostoc sp. LL R15 y Pediococcus sp. LL R106 (heterofermentativa y homofermentativa respectivamente), aisladas a partir de radicheta (Cichorium intybus) mínimamente procesada ⁽¹⁴⁾. Las cepas se conservaron a -20 °C en caldo MRS (Biokar Diagnostic, Beauvais, Francia) adicionado con 15% de glicerina. Antes de ser empleadas en los ensayos correspondientes, las cepas se inocularon en caldo MRS y se incubaron durante 24 h a 30 °C. Los cultivos resultantes se concentraron por centrifugación y se emplearon como inóculo en los ensayos correspondientes.

Evaluación del efecto de la aplicación de cultivos lácticos bioprotectores en el crecimiento de bacterias patógenas e indicadora a bajas temperaturas en sistemas modelo
L. monocytogenes ATCC 7644, S. Enteritidis MA 44 y E. coli ATCC 35218 se inocularon por separado en erlenmeyers con 100 ml de TSB suplementado con 0,6% de extracto de levadura (concentración final ≈ 104 ufc/ml), a los cuales se les adicionaron los cultivos lácticos concentrados (homofermentativo o heterofermentativo) en ensayos independientes (concentración final ≈ 108 ufc/ml). Como controles se emplearon erlenmeyers inoculados solamente con cada una de las cepas en estudio. Los erlenmeyers se incubaron a 5, 10 y 15 °C durante 4 días. Las temperaturas se eligieron por ser la óptima para el almacenamiento de vegetales mínimamente procesados (5 °C) o por implicar condiciones de abuso para la conservación de alimentos que deben almacenarse refrigerados (10 y 15 °C) ⁽¹⁵⁾. Periódicamente los tratamientos se sometieron a recuentos de células viables en placas con medios agarizados Oxford, Salmonella Shigella y Violeta Rojo Bilis Lactosa, según corresponda, que se incubaron 24 h a 37 °C. Los recuentos de bacterias lácticas se realizaron en agar MRS incubado 48 h a 30 °C bajo condiciones de anaerobiosis. Todos los ensayos y recuentos se realizaron por triplicado y se reportan los valores promedio obtenidos en log ufc/ml. Las curvas experimentales de crecimiento se representaron como log ufc/ml en función del tiempo.

Determinación de duración de las fases de crecimiento y de velocidad de duplicación en fase exponencial
La duración de las distintas fases de desarrollo y la velocidad de duplicación (VD) de las poblaciones microbianas en cada tratamiento se estimaron a partir de sus respectivas curvas experimentales de crecimiento.
Se consideró "velocidad de duplicación" (VD) al número de duplicaciones por unidad de tiempo (día) durante la fase exponencial, y se calculó mediante la aplicación de la ecuación 1 ⁽¹⁶⁾:

VD = [(log N - log No) 3,33]/t (1)

donde: N = población microbiana al final de la fase exponencial o del período bajo análisis
No = población microbiana al inicio de la fase exponencial o del período bajo análisis
t = tiempo de duración de la fase exponencial o del período bajo análisis (días)

Análisis estadístico
Los análisis de varianza y de comparaciones múltiples (test de mínimas diferencias significativas de Fisher), empleados para establecer diferencias significativas entre los tratamientos (P < 0,05) se realizaron usando el paquete estadístico STATGRAPHICS PLUS (StatPoint Inc., USA).

Resultados y discusión

Las cinéticas de crecimiento de los cultivos puros (controles) de Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella Enteritidis MA 44 y Escherichia coli ATCC 35218, y en cocultivo con bacterias lácticas (específicamente con Leuconostoc sp. LLR 15), expuestos a bajas temperaturas (5, 10 y 15 °C) en sistema modelo líquido (medio TSB con 0,6 % de extracto de levadura), se visualizan en la Figura 1.

Figura 1: Efecto de la temperatura (5, 10 y 15 °C) y del cocultivo con Leuconostoc sp. LLR 15 (+ CL) en las curvas de crecimiento de Listeria monocytogenes ATCC 7644 (a), Salmonella Enteritidis MA 44 (b) y Escherichia coli ATCC 35218 (c), en medio líquido.
▬▲▬ 5 °C; - -▲- - 5 °C + CL; ▬●▬10 °C; - -●- - 10 °C + CL; ▬■▬ 15 °C; - -■- - 15 °C + CL

Analizando el comportamiento de estos microorganismos en los sistemas modelo sin adición de bacterias lácticas se observa que a 5 °C, L. monocytogenes presentó una fase de latencia de solamente 2 días a partir de la cual la población inició la fase de multiplicación exponencial (Figura 1 a), de acuerdo con la naturaleza psicrótrofa del microorganismo (17).
En cambio, en los tratamientos controles de S. Enteritidis y E. coli a 5ºC, sus poblaciones se mantuvieron estables en fase de latencia durante todo el período de incubación (Figura 1 b y c).
A mayores temperaturas (10 °C y 15 °C), ninguna de las tres especies en cultivo puro sin adición de bacterias lácticas presentó fase de latencia (Tabla 1). No obstante, a 10 °C sus cinéticas de crecimiento difirieron significativamente (P < 0,0001) entre sí, debido a las diferencias en sus respectivas velocidades de duplicación (L. monocytogenes > E. coli > S. Enteritidis), según se visualiza en la Tabla 1, lo cual condujo a diferencias significativas en las poblaciones alcanzadas hacia el final del período de incubación (8,51 log en L. monocytogenes, 7,00 log en E. coli y 6,05 log en S. Enteritidis).

Tabla 1: Efecto del cocultivo con Leuconostoc sp. LLR 15 (CL) y la temperatura de incubación en la duración de la fase de latencia (días) y en la velocidad de duplicación en fase exponencial (duplicaciones/día) de L. monocytogenes ATCC 7644, S. Enteritidis MA 44 y E. coli ATCC 35218 en medio líquido

(1) Desarrollo del microorganismo sin adición de Leuconostoc sp. LLR 15;
(2) Desarrollo del microorganismo en cocultivo con Leuconostoc sp. LLR 15.

Ninguna de las tres especies alcanzó la fase estacionaria a 10 °C durante los 4 días de incubación si bien, teniendo en cuenta la población alcanzada, L. monocytogenes posiblemente ya estaría en el inicio de la misma (Figura 1).
A 15 °C, las velocidades de duplicación durante la fase exponencial de crecimiento se incrementaron 87%, 155% y 195% con respecto a las observadas a 10 °C para L. monocytogenes, S. Enteritidis y E. coli, respectivamente (Tabla 1). Además, las tres especies alcanzaron la fase estacionaria (a las 48 h L. monocytogenes y E. coli, y a las 72 h S. Enteritidis), con poblaciones máximas de ≈ 8,5 log (Figura 1).
El cocultivo con bacterias lácticas (cuyas cargas se mantuvieron estables durante todo el ensayo y en todos tratamientos) tuvo efectos disímiles en los tres microorganismos.
En Listeria monocytogenes, los cultivos lácticos provocaron modificaciones en las cinéticas de crecimiento a las tres temperaturas ensayadas (Figura 1a). A 5 °C, las bacterias lácticas homofermentativas y heterofermentativas prolongaron significativamente (P = 0,0001) la fase de latencia de Listeria durante todo el período de incubación (4 días), en comparación con el control, en el que dicha fase duró solamente 2 días (Tabla 1).
A 10 °C y 15 °C, la diferencia significativa entre la cinética de crecimiento en el tratamiento control y la observada en los cocultivos con bacterias lácticas se mantuvo durante todo el periodo de incubación (P < 0,0001), ya sea porque en los cocultivos se produjo una notable prolongación de duración de la fase de latencia de L. monocytogenes a 10 °C o una disminución de su velocidad de duplicación a 15 °C (Tabla 1), lo cual condujo a menores poblaciones del patógeno al final de la incubación y a que no se haya llegado a la fase estacionaria de crecimiento (Figura 1 a).
Además, no se observaron diferencias significativas entre los efectos producidos por los distintos cultivos lácticos en el comportamiento de L. monocytogenes (P entre 0,0559 y 0,8964). Por consiguiente, tanto los cultivos lácticos homofermentativos como los heterofermentativos podrían actuar como bioprotectores contra Listeria monocytogenes en condiciones de refrigeración pues producen retardo en el crecimiento del patógeno. La actividad antagónica observada producida por los cultivos lácticos podría deberse a la competencia por la ocupación espacial de nicho ecológico, o bien, a la excreción de metabolitos antimicrobianos (por ejemplo, compuestos de bajo peso molecular y bacteriocinas) que estos generarían a los cuales L. monocytogenes sería sensible ^{(13, 18)}.
Con respecto al comportamiento de S. Enteritidis en cocultivo con bacterias lácticas, a 5 °C la población de Salmonella se mantuvo estable durante el período de incubación, y no hubo diferencias significativas entre el control y los tratamientos con adición de los diferentes cultivos lácticos (Figura 1 b). En consecuencia podría deducirse que la aplicación de temperaturas de 5 °C es de por sí suficiente para mantener a S. Enteritidis en fase de latencia.
A 10 °C solamente se observó diferencia significativa entre el control y los tratamientos con bacterias lácticas en el primer día de incubación (P: 0,0054), debido a que tanto los cultivos heterofermentativos como los homofermentativos, sin diferencias significativas entre ellos (P: 0,6286), provocaron que S. Enteritidis presentara una fase de latencia de 1 día (Tabla 1). Una vez superada la misma, no hubo diferencias significativas entre el control y los tratamientos con bacterias lácticas durante el período de incubación restante (P entre 0,5007 y 0,6588), y sus velocidades de duplicación fueron prácticamente iguales (Tabla 1).
En cambio, a 15 °C se observaron diferencias significativas entre el control y el cultivo con bacterias lácticas heterofermentativas durante todo el período de incubación y en la población máxima alcanzada (P entre 0,0374 y 0,0001), debido a que la presencia de estas bacterias provocó una disminución del 40% de la velocidad de duplicación de S. Enteritidis, comparada con la observada en el cultivo control (Tabla 1). Por el contrario, a dicha temperatura no se observaron diferencias significativas entre el cocultivo con bacterias lácticas homofermentativas y el tratamiento control (P entre 0,0655 y 0,1813) durante todo el período de incubación.
Por consiguiente, solo los cultivos lácticos heterofermentativos presentarían efecto bioprotector contra S. Enteritidis, aunque de menor magnitud que el observado en L. monocytogenes.
En E. coli, no se observaron diferencias significativas entre las curvas de crecimiento de los tratamientos control y en cocultivo con bacterias lácticas (P entre 0,1216 y 0,7618) bajo ninguna de las condiciones ensayadas (Figura 1 c), ni en los parámetros que caracterizan a dichas curvas, como por ejemplo la velocidad de duplicación en fase exponencial (Tabla 1). Por consiguiente los cultivos lácticos empleados no producen efecto bioprotector contra este microorganismo que es ampliamente utilizado en microbiología como índice de la probable presencia de bacterias patógenas de origen entérico, por ejemplo Salmonella ssp., en alimentos y en productos y/o ambientes relacionados con su producción, y como indicador de contaminación fecal en vegetales frescos y mínimamente procesados ⁽⁸⁾. El comportamiento de E. coli ante estos cultivos lácticos bioprotectores presenta como ventaja que con el empleo de los mismos no se enmascara su presencia y por consiguiente permanece inalterable su cualidad de indicador de patógenos entéricos.
Por otro lado, en la industria alimentaria se están utilizando cepas de referencia de E. coli como subrogantes de Salmonella sp. para las evaluaciones de procesos a escala piloto o industrial, en la cuales no se puede introducir el patógeno ⁽¹⁹⁾. Una de las condiciones que debe cumplir una cepa para poder ser empleada como subrogante es presentar un comportamiento similar al patógeno que remplaza frente al proceso en estudio (20). Desde este punto de vista, la cepa E. coli ATCC 35218 utilizada en este trabajo no sería un adecuado subrogante de Salmonella en la evaluación de cultivos bioprotectores pues ha presentado diferencias significativas con el comportamiento observado en S. Enteritidis MA 44 frente a bacterias lácticas heterofermentativas a 10 y 15 °C (valores de P entre 0,0295 y 0,0001).

Conclusiones

Se concluye que, de acuerdo con los comportamientos observados en sistema modelo, los cultivos lácticos nativos podrían funcionar como barrera adicional para limitar el desarrollo de patógenos en alimentos conservados a bajas temperaturas, como por ejemplo vegetales frescos o mínimamente procesados, sin incidir en el desarrollo de los indicadores recomendados para estos productos alimenticios, lo cual alienta la realización de estudios futuros para la evaluación de su efectividad en matrices vegetales. No obstante se considera necesario probar otras cepas de E. coli u otras especies bacterianas para ser empleadas como subrogante de enterobacterias patógenas en la evaluación a escala industrial de la aplicación de cultivos bioprotectores en alimentos.

Agradecimientos

Los autores agradecen el subsidio otorgado por el Departamento de Tecnología de la Universidad Nacional de Luján para la realización de este trabajo.

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Recibido: 12/12/2012
Aprobado: 23/10/2013