BIOLOGÍA Y GENÉTICA

Diversidad genética y resistencia antimicrobiana de Pseudomonas aeruginosa recuperadas de pacientes fibroquísticos adultos de Argentina

Genetic diversity and antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa recovered from adult cystic fibrosis patients in Argentina

 

Pablo Martina^1,2,4,*, Fernando Mazur², Laura Cazzola³, Claudia Prieto¹, Silvia Perez³, Marina Quiroga², Osvaldo Yantorno¹, Eusebia Valdez², Alejandra Bosch¹

¹ Centro de Investigacion y Desarrollo de Fermentaciones Industriales (CINDEFI-CONICET, CCT-La Plata), Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, calle 50 N° 227, CP 1900, La Plata, Buenos Aires, Argentina.
² Facultad de Ciencias Exactas Quimicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones, Felix de Azara 1552, CP 3300, Posadas, Misiones, Argentina.
³ Hospital Interzonal General de Agudos Prof. “Dr. Rodolfo Rossi”, Calle 37 N°183, CP 1900, La Plata, Buenos Aires, Argentina.
⁴ Instituto de Biologia Subtropical (IBS), Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (CONICET) - Universidad Nacional de Misiones (UNaM), Jujuy N°1745, CP 3300, Posadas, Misiones, Argentina.
* E-mail: pfmartina@hotmail.com

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Resumen

Pseudomonas aeruginosa es un organismo comunmente hallado en la naturaleza que ha sido reconocido como un patogeno oportunista de gran relevancia clinica, particularmente como principal agente infeccioso en pacientes con fibrosis quistica. La elevada resistencia a muchos antibioticos de uso frecuente y la capacidad de formar biofilm convierten a P. aeruginosa en un microorganismo dificil de eliminar. El objetivo de este trabajo fue la tipificacion molecular de 58 aislamientos de P. aeruginosa obtenidos de pacientes adultos con fibrosis quistica, con el fin de analizar si habia una correlacion entre caracteristicas moleculares y el patron de susceptibilidad a agentes antimicrobianos. Mediante analisis de BOX-PCR, se demostro que existe una elevada heterogeneidad genetica entre los aislamientos, sin embargo no pudo establecerse una correlacion con la resistencia a agentes antimicrobianos.

Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa; Fibrosis quistica; Resistencia antibiotica; Diversidad genetica.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is a common organism found in nature which has been recognized as an opportunistic pathogen of great clinical relevance, particularly as the main infectious agent in patients with cystic fibrosis. The high resistance levels to several commonly used antibiotics and the ability to form biofilms make P. aeruginosa a microorganism difficult to eradicate. The aim of this study was to determine the molecular characterization of 58 isolates of P. aeruginosa from adult patients with cystic fibrosis, in order to examine whether there was a correlation between molecular features and the pattern of susceptibility to antimicrobial agents. By BOX-PCR analysis, it was demonstrated that there is a high genetic heterogeneity between isolates, Nevertheless, this could not be correlated with resistance to antimicrobial agents.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa; Cystic fibrosis; Antibiotic resistance; Genetic diversity.

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Introducción

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva potencialmente mortal con una mayor incidencia en la población caucásica ^[1]. Aunque se estima que solo el 50 % de los casos clínicos son diagnosticados, la enfermedad afecta aproximadamente a 1 de cada 6 750 nacidos vivos en Argentina ^[2]. Las infecciones pulmonares, causadas principalmente por Pseudomonas aeruginosa, pueden persistir durante décadas y son la principal causa de morbilidad y mortalidad para estos pacientes ^{[3; 4]}. Después de un período de infecciones recurrentes, los pacientes fibroquísticos se infectan de forma permanente con un único linaje de P. aeruginosa, generalmente adquirida de reservorios ambientales ^[5]. Durante el establecimiento de la infección, este único linaje de P. aeruginosa se diversifica en fenotipos adaptados específicamente para el medio ambiente hostil del pulmón fibroquístico, lo que permite su persistencia a largo plazo ^[6].
Métodos de tipificación genética, tales como ribotipificación ^[7], polimorfismo de ADN amplificado al azar (Random Amplified Polymorphic, DNA - RAPD) ^[8], electroforesis en gel de campo pulsado (pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) ^[9], PCR basada en elementos repetitivos (rep-PCR) ^{[10; 11, 14]} y la tipificación de secuencias multilocus (multilocus sequence type, MLST) ^[12] han demostrado que proporcionan una buena especificidad y sensibilidad para una efectiva vigilancia epidemiológica de aislamientos de P. aeruginosa potencialmente transmisibles entre pacientes con FQ. Estas metodologías han sido aplicadas para deducir la epidemiología de infecciones en individuos infectados y para entender la diseminación de clones multi-resistentes. En el Hospital Interzonal de Agudos “Dr. Rossi” de la ciudad de La Plata, Argentina, se realizó un análisis epidemiológico sobre pacientes con FQ, en base a 700 aislamientos recuperados de secreciones bronquiales durante los años 2006 a 2013. Se observó la siguiente distribución: P. aeruginosa 77,4%, Staphylococus aureus 68,8%, Complejo Burkholderia cepacia 5,7%, Stenotrophomona maltophilia 3,4% y Acrhomobacter xylosoxidans 1,8%. En el 61% de los casos se aislaron dos o más microorganismos simultáneamente, siendo la asociación más frecuente P. aeruginosa - S. aureus ^[13]. Este material biológico constituye una importante fuente de información que decidimos explorar en colaboración con el hospital mencionado.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la diversidad genética dentro de una población de P. aeruginosa aisladas entre los años 2007 y 2011, de muestras de esputo de pacientes adultos con FQ, tratados en el hospital “Dr. Rossi” de La Plata. Además, a partir del análisis de susceptibilidad a distintos agentes antimicrobianos se buscó determinar si existía alguna correlación entre estructura genética de la población y resistencia a antibióticos.

Materiales y métodos

Aislamientos bacterianos
En este trabajo se analizó molecularmente 58 aislamientos de P. aeruginosa recuperados de secreciones bronquiales de 23 pacientes adultos con FQ (entre 16 y 56 años) tratados en el Servicio de Bacteriología del Hospital Interzonal de Agudos “Dr. Rossi” de ciudad de La Plata, Argentina entre los años 2007 y 2011 (tabla 1); para la realización de este estudio se contó con el consentimiento informado de los 23 pacientes. Los aislamientos bacterianos se preservaron liofilizados y pertenecen a la colección de cepas del Laboratorio Vacunas Bacterias del CINDEFICONICET- UNLP. La historia clínica e identidad de cada paciente es reservada.

Tabla 1: Coleccion de aislamientos recuperados de P. aeruginosa de pacientes con FQ.

Condiciones de cultivo y extracción de ADN genómico bacteriano
Los aislamientos de P. aeruginosa se inocularon en 5 ml de medio LB (extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 5 g/l; Laboratorios Britania S.A., Argentina) y se incubaron durante 20 h a 37 °C con agitación. Para la extracción del ADN, 1,5 ml de cada cultivo bacteriano se centrifugó durante 5 min a 12 000 g. El sedimento bacteriano se resuspendió en 200 μl de solución de NaCl 1M y se realizó una nueva centrifugación. Se descartó el sobrenadante y el sedimento fue suspendido en 500 μl de una solución de lisis (glucosa 50 mM, EDTA 70 mM, Tris-HCl 50 mM, lisozima 5 mg/ml (Sigma, USA), pH 8,0). La mezcla se incubó 1h a 37 °C con agitación periódica. Posteriormente, se agregó 100 μl de sarcosil 5% (Sigma, USA) y se mezcló suavemente por inversión. La incubación se repitió una vez más (1 h a 37 °C). Luego, se agregó 100 μl de sílica 5% (Sigma, USA), se mezcló por inversión y se centrifugó a 5 000 g. El pellet se lavó 3 veces con 500 μl de solución de lavado (20 mM EDTA, 30 mM Tris, 5% Etanol 96° y 2% NaCl 1 M), y se descartó el sobrenadante. El sedimento obtenido se dejó secar a temperatura ambiente, se resuspendió en un volumen de 70 μl de agua bidestilada estéril y se incubó a 65 °C por 15 min. Finalmente, se mezcló mediante vortex, se centrifugó 1 min a 12 000 g y se transfirió el sobrenadante, conteniendo el ADN puro, a un tubo nuevo. La concentración de ADN se obtuvo midiendo la absorbancia a 260/280 nm con un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (ThermoScientific, USA). Las extracciones fueron almacenadas a -20 °C o utilizadas inmediatamente.

Tipificación por BOX- PCR fingerprinting
Se empleó para estudiar la diversidad genómica las secuencias repetitivas conservadas de los elementos BOX de Streptococcus pneumoniae (BOX) ^[15]. El estudio de diversidad genética se realizó mediante la técnica de BOXPCR. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 15 μl, constituido por 7 – 9 ng/μl de la muestra de ADN y 11 μl de la mezcla de reacción o master mix (1,5 μl de buffer 10X (Tris-HCl 10 mM pH 9, KCl50 mM, Triton X100 0,1%); 1,5 μl de mezcla de dNTPs, cada uno con 5 μM; 1,8 μl de MgCl2 50 mM; 0,15 μl de Taq DNA polimerasa (5 U/μl) (Fermentas, USA) y 1 μl del cebador BoxAR1 (5´- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG- 3´) [14]. Para la amplificación se utilizó un termociclador Bio-Rad programado con un primer ciclo de desnaturalización inicial a 94 °C durante 1 min; seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 30 s; un ciclo de hibridación a 58 °C durante 1 min; un ciclo de extensión a 70 °C durante 5 min y finalmente 1 ciclo de incubación a 70 °C durante 15 min. Los productos amplificados fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1,5 % suplementados con bromuro de etidio 5 ng/ml en 0,5X TBE. La corrida electroforética se realizó con un tiempo inicial de 6 min a 45 mV y luego 90 min a 85 mV con la finalidad de conseguir una separación óptima de las bandas.

Análisis de imagen
Las imágenes obtenidas de los geles se digitalizaron y convirtieron a formato TIFF con la finalidad de llevar a cabo el análisis de los perfiles de fingerprint obtenidos, para lo que se utilizó el programa informático GEL Compare II (versión 2.1Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). Cada imagen fue convertida con una resolución de calle de 250 ppp (puntos por pulgada) y normalizada (resolución, 900; smoothing, 5; sustracción de background rolling disk intensity, 12) usando el marcador de peso molecular Lambda ladder (Bio-Rad) como referencia. Los perfiles con dos o más bandas de diferencia entre sí, se consideraron no relacionados. La variación en la intensidad de las bandas no se consideró como una diferencia genética. Las bandas evaluadas como demasiado débiles para ser interpretadas, no se incluyeron en el análisis. El análisis de similitud de los resultados para cada ensayo fue calculado utilizando el coeficiente de Dice y el análisis de clusters generados por matrices de similitud se realizó usando el método de UPGMA (Unweighted Pair Group Meted with Arithmetic Mean) ^[16]. El criterio para definir clones relacionados fue considerar perfiles con el ≥ 85% de similitud de bandas.

Susceptibilidad a antimicrobianos
La susceptibilidad a antibióticos fue evaluada por el método de difusión en agar según recomendaciones e interpretación del CLSI [17] para piperaciclina 100 μg (PIP), piperaciclina-tazobactam 100/10 μg (PTZ), ceftazidima 30 μg (CFZ), cefepima 30 μg (FEP), imipenem 10 μg (IMP), meropenem 10 μg (MER), amicacina 30 μg (AMK), gentamicina 10 μg (GEN), ciprofloxacina 5 μg (CIP), colistina 10 μg (COL) (Laboratorio Britania S. A., Argentina).

Estadística
Para el análisis estadístico se utilizó el test de Chicuadrado empleando el programa SPSS statistics 17.0.

Resultados

Empleando el cebador BOX-A1R, las amplificaciones del ADN de los 58 aislamientos estudiados generaron fragmentos de entre 280 pb y 3 200 pb (figura 1). A partir de estos resultados la utilización del programa informático Gel Compare II permitió agrupar los 58 aislamientos analizados en 17 perfiles genotípicos (subtipos BOX-PCR) (figura 2). Los diferentes perfiles fueron designados como BOX-A a BOX-Q y presentaron la siguiente frecuencia: BOX-A 23 aislamientos (39,6%), BOX-D y BOX-I 5 aislamientos (8,6%) cada uno, BOX-J 4 aislamientos cada uno (6,9%), BOX-B y BOX-Q 3 aislamientos cada uno (5,2%) y BOX-C, BOX-M, BOX-N y BOX-P 2 aislamientos para cada uno (3,4%). Los restantes genotipos estuvieron representados por un único aislado (12,2 %).

Figura 1: Perfiles BOX-PCR de P. aeruginosa. Calle A a Q, corresponden a perfiles representativos de aislamientos clinicos estudiados. PM, peso molecular (Axygen, USA). La flecha indica bandas 100 - 500 - 3500pb.

Figura 2: Relacion filogenetica entre los aislamientos clinicos de P. aeruginosa. Letras A - Q corresponden a los perfiles representativos de BOX-PCR. El Dendrograma fue construido por el metodo de UPGMA, empleando los valores de similitud del coeficiente Dice. La linea vertical de puntos indica un 85 % de similitud.

Aislamientos sucesivos en pacientes FQ con infecciones crónicas
La figura 3 muestra la secuencia cronológica de subtipos de BOX-PCR para los 58 aislamientos de P. aeruginosa recuperados de los 23 pacientes con FQ en estudio. En el 78,2% de los pacientes, se mantuvo el genotipo de la cepa colonizadora inicialmente aislada. En 8 de esos pacientes estuvo presente el genotipo BOX-A, 2 pacientes con el genotipo BOX-D, 2 pacientes con el genotipo BOXI, y 6 pacientes con los genotipos BOX-B, BOX-C, BOX-J, BOX-O, BOX-P y BOX-Q. En los 5 pacientes restantes se detectó un cambio de genotipo respecto al primer aislado recuperado o se trató de pacientes con aislado único.

Figura 3: Evolucion de aislamientos de P. aeruginosa recuperadas de pacientes adultos con FQ colonizados cronicamente. Pacientes P1 a P23. Letras A - Q corresponden a los genotipos aislados a lo largo de 5 anos de vigilancia.

Susceptibilidad Antimicrobiana
Se muestra en la tabla 2, los porcentajes de resistencia correspondientes al analisis de susceptibilidad antimicrobiana de los 58 aislamientos aquí estudiados. Es interesante destacar la combinación de piperaciclina-tazobactam (PTZ) reflejo un incremento de la susceptibilidad estadísticamente significativo (p< 0,03) a su forma original (PIP). Todas las cepas analizadas fueron sensibles a colistin y el 10% de las cepas presentaron multirresistencia.

Tabla 2: Resistencia a antimicrobianos en aislados de P. aeruginosa de pacientes con FQ.

En la tabla 3, se muestran los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana de P. aeruginosa que comparten el mismo genotipo (BOX-A). Tanto en los aislamientos isogénicos recuperados de un mismo paciente como de distintos pacientes durante el año 2011, se evidenció un heterogéneo grado de resistencia a los diferentes antibióticos. Sin embargo, para los antibióticos PTZ y COL todos ellos fueron sensibles.

Tabla 3: Diferencia de susceptibilidad antimicrobiana en aislamientos de P. aeruginosa que comparten el mismo genotipo (BOX-A) recuperados de pacientes con FQ durante el ano 2011
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Discusión

La importancia de P. aeruginosa como patógeno de humanos ha sido ampliamente reportada a nivel internacional, sin embargo de acuerdo a nuestros conocimientos poco ha sido lo informado sobre características genéticas y resistencia a antimicrobianos de poblaciones circulantes en Argentina. En el presente trabajo presentamos resultados sobre la diversidad genética observada de una población de 58 aislamientos recuperados de pacientes adultos con FQ. Los resultados obtenidos se buscaron correlacionar con el perfil de resistencia a antibióticos de cada aislamiento. Para el estudio de biodiversidad, se tuvo en cuenta la variabilidad de secuencias repetitivas de ADN bacteriano, la cuales representan hasta un 5% del genoma y han sido el blanco de técnicas de diferenciación como rep-PCR ^{[15; 18; 19]}. En P. aeruginosa y en otras especies de patógenos oportunistas, la técnica de BOX-PCR demostró ser una herramienta adecuada para cuantificar el polimorfismo genético de una población ^{[10; 11; 16; 20]}. La aplicación de esta metodología a nuestra población puso en evidencia la existencia de una gran diversidad genética dentro de los aislamientos locales de P. aeruginosa analizados. Los datos aquí reportados se correlacionan con lo informado por Morelli et al. ^[21], quienes estudiaron una colección de mayor tamaño. Diecisiete variantes genéticas fueron identificadas entre los 58 aislamientos. Dentro de esta diversidad se constató que el 56,9 % de los perfiles observados pertenecían a 3 genotipos (BOX-A, BOX-D y BOXI). Para el caso del genotipo A, el de mayor ocurrencia, podría significar que existe una cepa preponderante en las infecciones de pacientes fibroquísticos de la región, lo que podría estar dado por alguna característica no identificada, que le conferiría una mayor transmisibilidad. La mayor prevalencia de un genotipo particular en las infecciones indicaría un comportamiento epidémico (clonal). No obstante, la diversidad encontrada es un indicador que confirmaría el comportamiento panmíctico ^[22] en los aislamientos estudiados. Esta observación refuerza los resultados locales reportados por Iglesia et al. [8] quienes estudiaron la diversidad genética de P. aeruginosa recuperada de pacientes infantes con FQ mediante RAPD y no encontraron un genotipo prevalente entre los aislamientos obtenidos de pacientes con infección crónica ^[8].
Por otro lado, el poder de discriminación mostrado por BOX-PCR sobre los aislamientos aquí estudiados, permitiría inicialmente emplear esta metodología para analizar la posibilidad de variación genotípica de bacterias recuperadas de un mismo paciente en una línea de tiempo, detectar la ocurrencia de brotes clonales y/o la aparición de nuevos genotipos circulantes ^[20]. Sin embargo esta metodología no permite confirmar clonalidad. Fue reportado que en la mayoría de los pacientes FQ la infección por P. aeruginosa es de tipo crónica, ya que los clones perduran aún después de intensos y sucesivos tratamientos antimicrobianos ^[23]. Asimismo, la infección crónica es producida en general por una sola cepa de P. aeruginosa. Sin embargo, cuando estas infecciones son muy prolongadas, puede ocurrir un evento de co-infección con una o dos cepas adicionales distintas ^[24]. En cuanto a la evolución en el tiempo de los aislamientos de un mismo paciente, analizados por BOX-PCR, se observó en algunos casos que las primeras muestras obtenidas de un determinado paciente (P4, P5 y P13), comparten el perfil genotípico de muestras aisladas luego de 3 o 4 años. Estos datos podrían indicar que dichos clones son capaces de perdurar en el tiempo, gracias a alguna característica que podría conferir alguna ventaja adaptativa (resistencia a antimicrobianos, formación de biofilm, modulación metabólica, etc.), o bien persistir en las fosas nasales del individuo hospedador y volver a los pulmones ante la entrada de algún otro agente viral o bacteriano ^{[25; 26]}. A diferencia, se ha visto para otros pacientes (P2, P7 y P21) que a lo largo de un período menor (6 meses a 2 años) se han recuperado organismos con diferentes características genotípicas al aislamiento inicial. Por otra parte, en los pacientes P18 y P20 se han aislado genotipos intermitentes en el lapso de 36 meses (figura 3). En casos como estos, es probable que normalmente coexistan más de una especie genotípica y que por alguna razón en algún momento de la infección se aísle una y en otro momento se aísle la otra o las dos simultáneamente ^[27].

Resistencia a antibióticos. En pacientes con FQ, los procesos de adaptación de las bacterias asociadas a esta patología y la presión ejercida por el propio tratamiento antibiótico, pueden originar un ambiente propicio para la aparición y selección de mutantes resistentes a las concentraciones clínicas de los antimicrobianos utilizados habitualmente en el tratamiento. En este estudio, los altos niveles de resistencia observados a los antimicrobianos más utilizados en el tratamiento de infecciones graves por Pseudomonas (aminoglucósidos, cefalosporinas, piperaciclina y ciprofloxacina) ^[25] podrían estar vinculados a la presión selectiva ejercida por el uso de antibióticos ^{[22; 28]}. Una observación útil para respaldar la resistencia por mecanismos de presión selectiva es la baja resistencia a la colistina (1 aislado en 600 muestras), un antibiótico cuyo empleo en los pacientes es limitado debido a la nefrotoxicidad que produce ^[29] y que en consecuencia está reservado como última línea de defensa en casos extremos. Nuestros datos muestran valores de resistencia a antimicrobianos superiores a los informados en distintos centros de salud de países cercanos como Brasil ^{[30; 31]} o distantes como Alemania ^[32] e Irán ^[33], así como a la informada en Argentina en pacientes pediátricos con FQ ^[34].
Finalmente, en cuanto a la sensibilidad a antibióticos analizada por genotipo, como se mostró en la tabla 3, no se encontró un patrón de resistencia vinculado directamente con un tipo de genotipo en particular. Este hecho podría deberse a que la técnica de fingerprinting utilizada no es lo suficientemente específica como para discriminar modificaciones del ADN que sean consecuencia de mutaciones cromosómicas implicadas en el mecanismo de resistencia y/o que la adquisición de genes codificadores de resistencia más frecuentes estén relacionado a la presencia de cassettes genéticos e integrones ^[29] los cuales pueden no ser detectados en el patrón de bandeo de BOX-PCR ^[10].
Los resultados de este estudio demostraron que BOXPCR es un ensayo rápido, altamente discriminatorio y reproducible, por lo que resultó ser una poderosa herramienta para revelar la diversidad genética de los aislamientos locales de P. aeruginosa. Si bien los resultados obtenidos pertenecen a un solo centro y la situación epidemiológica es particular para las distintas instituciones del país, dada la alta prevalencia de P. aeruginosa, su alta resistencia a los antimicrobianos estudiados y la cuantiosa diversidad genética, se hace necesario el permanente monitoreo de la flora microbiana y su sensibilidad en los pacientes adultos con FQ para establecer una adecuada terapia antibiótica.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Secretaría de Investigación y Postgrado (SECIP) de la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones. P. Martina es becario Postdoctoral de CONICET y A. Bosch es miembro Investigador de CIC-PBA. A Julio Figari por su excelente asistencia técnica.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Recibido: 15/09/2014.
Aprobado: 17/07/2015.