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Revista de Ciencia y Tecnología

On-line version ISSN 1851-7587

Rev. cienc. tecnol.  no.25 Posadas June 2016

 

SALUD

Epidemiología de la Proteína de Superficie Neumocócica a (PspA), en Streptococcus pneumoniae Causantes de Infecciones Invasivas en un Hospital Pediátrico de la Argentina

Epidemiology of Pneumococcal Surface Protein a (PspA) IN Streptococcus pneumoniae Causing Invasive Infections in a Paediatric Hospital in Argentina

 

Sandra L. Grenon1, Monica E. Martinez1,2, Martha H. von Specht1,2,*

1 Departamento de Microbiologia, Facultad de Ciencias Exactas Quimicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones, Av. Mariano Moreno y Av. Lopez Torres, CP 3300, Posadas, Misiones, Argentina.
2 Hospital Provincial de Pediatria “Dr. Fernando Barreyro”, Av. Mariano Moreno 110, CP 3300. Posadas, Misiones, Argentina.
* E-mail: mvonspecht@fceqyn.unam.edu.ar


Resumen

Se ha puesto enfasis en la Proteina A de superficie neumococica (PspA) como componente principal para el desarrollo de una vacuna, con el potencial de ofrecer una amplia proteccion no relacionada a los serotipos. El objetivo de este trabajo fue conocer la frecuencia y distribucion de las familias de PspA, 1 y 2 de Streptococcus pneumoniae causantes de infecciones invasivas pediatricas. Se trabajo con 91 aislamientos del periodo 2005-2012. Se determino la sensibilidad a los antibioticos conforme al Clinical and Laboratory Standards Institute, el serotipo mediante la tecnica de Quellung, y mediante reaccion en cadena de la polimerasa las variantes del gen de PspA. De los aislamientos estudiados, 48 (52,7%) fueron identificados como familia 1, 28 (30,8%) como familia 2 y en 6 (6,6%) no se detecto ninguno de los amplicones buscados. La co-expresion de ambas familias se constato en 9 (10%) aislamientos. La familia 2 presento frecuencias superiores a las esperadas entre los ninos < 2 anos y en casos de meningitis (p>0,05). Se evidenciaron 16 serotipos diferentes. El serotipo 14 se asocio a ambas familias. No se detecto diferencia entre la distribucion de las familias y los resultados de concentracion inhibitoria minima a penicilina y cefotaxima. La distribucion detectada, muestra que el desarrollo de una vacuna basada en las PspA que contenga antigenos de ambas familias 1 y 2, podria ser efectiva en la region.

Palabras clave: Streptococcus pneumoniae; PspA; Enfermedad invasiva; Pediatria.

Abstract

It has been emphasized Pneumococcal Surface Protein A (PspA) as a main component for developing a pneumococcal vaccine with the potential to offer a broad protection unrelated to serotype. The aim of this work was to determine the frequency and distribution of PspA families 1 and 2 of Streptococcus pneumoniae causing invasive pediatric infections. We worked with 91 isolates from the period 2005-2012. Antibiotic sensitivity was studied according to the Clinical and Laboratory Standards Institute, serotyping by Quellung technique, and the presence of PspA variant gen was determined by polymerase chain reaction. From the studied isolates, 48 (52.7%) were identified as family 1, 28 (30.8%) as family 2 and in 6 (6.6%) none of the desired amplicon was detected. Expression of both families was found in 9 isolates (10%). Family 2 frequencies were higher than expected among children <2 years and in cases of meningitis (p> 0.05). Sixteen different serotypes were detected; serotype 1 was related to family 1 and serotype 7F to family 2. Serotype 14 was associated with both families. No difference between the distribution of families and the results of minimum inhibitory concentration of penicillin and cefotaxime was detected. Our findings showed that the development of a PspA antigens based vaccine, containing both families 1 and 2 would be effective in the region.

Keywords: Streptococcus pneumonia; PspA; Invasive disease; Pediatrics.


 

Introducción

Las infecciones invasivas por Streptococcus pneumoniae representan un serio problema de Salud Pública por las altas tasas de morbilidad y mortalidad que provocan [1, 2]. La Organización Mundial de la Salud [3], estima que éstas causan alrededor de 1,6 millones de muertes anuales, de las cuales, aproximadamente 800.000 se dan en niños menores de 5 años [4]. En los países en desarrollo, las tasas son de 4 a 10 veces mayores [1, 5, 6]. S. pneumoniae, es la primera causa de neumonía extra hospitalaria, provoca el 80-90% de los casos de bacteriemia oculta en niños menores de 23 meses, y es el primer agente etiológico de meningitis bacteriana en niños, en los países que incluyen la vacunación frente a Haemophilus influenzae b en su calendario, y en años de ausencia de brotes epidémicos por Neisseria meningitidis [1, 5, 6].
La vacuna de polisacáridos 23 valente y las vacunas a base de polisacáridos conjugados a proteínas, disponibles desde el año 2000, han demostrado ser efectivas contra la infección invasiva neumocócica y para reducir la tasa de resistencia antibiótica [5, 8]. Sin embargo la protección restringida a un número limitado de serotipos, la variación de la distribución de éstos tanto espacial como temporalmente, el reemplazo ocasionado por la presión selectiva de aquellos incluidos en la vacuna y los altos costos de producción, limitan su uso en los países en desarrollo donde la incidencia de esta patología es mayor [4, 9]. Se ha vuelto prioritaria la formulación de una vacuna independiente de serotipos, orientándose el interés hacia las proteínas de superficie [8, 9].
La PspA, es un importante factor de virulencia que interfiere con la deposición del complemento sobre la superficie neumocócica [10, 12]. Ha demostrado ser inmunogénica, y poseer reactividad cruzada en humanos y en varios modelos animales [11, 16]. Basados en las distintas secuencias que adopta la región α-hélice, es posible dividir a las PspA en tres familias (50% de homología entre sí). Las familias 1 y 2 representan cada una casi el 50% de los neumococos estudiados, mientras que la familia 3 comprende alrededor del 1% [7, 14, 15, 17]. Varios estudios han puesto de manifiesto diferencias geográficas en la prevalencia de las familias [18, 30].
Teniendo en cuenta que S. pneumoniae es un patógeno relacionado a alta morbi-mortalidad, que la PspA es un inmunógeno estudiado por numerosos grupos a nivel mundial para el desarrollo de nuevas vacunas y considerando su alta variación en las diversas áreas geográficas, se abordó el presente trabajo con el objetivo de conocer la distribución y epidemiología de las familias 1 y 2 de la PspA en los aislamientos de S. pneumoniae causantes de infecciones invasivas en un hospital pediátrico de referencia del Norte de la Argentina.

Materiales y Métodos

El Hospital Provincial de Pediatría de Misiones (HPPM; Posadas, Argentina), cuenta con 110 camas, y es centro de referencia en la región. Recibe derivaciones de las localidades del interior de la provincia, del norte de la provincia de Corrientes, y del sur de la República de Paraguay. Atiende en promedio 76.000 consultas ambulatorias y se generan 5.000 egresos por año (Servicio de Estadísticas del HPPM). Se estudiaron 91 aislamientos de neumococos causantes de enfermedad invasiva en pacientes pediátricos (>1mes y <14 años), internados en el HPPM durante el enero de 2005 y diciembre de 2012 inclusive. Los pacientes se clasificaron según su edad en: lactantes (<2años), preescolares (≥2 y <5 años) y escolares (≥5años). Se definió como enfermedad invasiva, a toda aquella afección en la cual se haya recuperado S. pneumoniae desde un sitio normalmente estéril. Los aislamientos fueron caracterizados por procedimientos fenotípicos convencionales [31], y remitidos al Instituto Nacional de Referencia “Dr. Carlos G. Malbrán” para ser serotipificados de acuerdo al Sistema de Nomenclatura Danés, Statens Serum institut de Copenhague, Dinamarca [32]. La sensibilidad a los antibióticos se determinó mediante técnicas de difusión y dilución conforme a las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)[33].
Se trabajó con monodiscos (Britania, Argentina) de los siguientes antibióticos: oxacilina (OXA, 1μg), trimetoprima-sulfametoxazol (TMS, 1,25/23,75μg), eritromicina (ERY, 15μg), clindamicina (CLI, 2μg), tetraciclina (TET, 30μg), cloranfenicol (CMP, 30μg), vancomicina (VAN, 30μg), levofloxacina (LEVO, 5μg) y rifampicina (RIFA, 5μg). Se realizó el método de doble disco (D-test, CLI - ERY) para investigar los fenotipos M y MLSB [33]. Se efectuó la determinación de la concentración inhibitoria mínima de penicilina (Richet, Buenos Aires, Argentina) y de cefotaxima (Bristol-Myers Squibb, Buenos Aires, Argentina) mediante macrodilución en caldo [33]. Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) siguiendo el protocolo propuesto por Vela y col. [22]. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron: LSM12/SHK63, y LSM12/SHK52, para la familia 1 y familia 2 respectivamente [13]. Como controles, se utilizaron las cepas de referencia R36A y BG11703, provistas por el Laboratorio Nacional de Referencia Instituto “Dr. Carlos G. Malbrán” de Buenos Aires, Argentina [30]. Los productos de PCR se clasificaron como PspA familia 1, PspA familia 2 y PspA familia 1 y 2, o no detectado (PspA-ND). Para variables categóricas se utilizó la prueba de c2 con la corrección de Yates, mediante el programa EpiInfo (TM) 3.5 del CDC Atlanta, Estados Unidos (http://wwwn.cdc.gov/epiinfo/html/downloads.htm). Se consideró estadísticamente significativo un valor de p<0,05.

Resultados

De los aislamientos ensayados, 48 (52%) fueron identificados como familia 1, 28 (31%) como familia 2 y en 6 (7%) no se detectó ninguno de los amplicones buscados. La co-expresión de ambas familias se detectó en 9 (10%) aislamientos.
Las dos familias de PspA se relacionaron con todos los grupos etarios y con todos los diagnósticos,la familia 1 fue la preponderante en todos los grupos (p>0,05). Se observaron frecuencias superiores a las esperadas para la familia 2 entre los niños menores de 2 años y para la familia 1, entre los niños mayores de 2 años. En los pacientes diagnosticados con neumonía y sepsis se observó una frecuencia superior a la esperada de aislamientos de la familia 1 (p>0,05), y en los casos de meningitis y sepsis, de la familia 2 (tabla 1).

Tabla 1: Distribucion de familias de PspA detectadas en aislamientos invasivos pediatricos de S. pneumoniae segun las variables: genero, grupo etario y diagnostico clinico. 2005-2012 (N=91).

La información respecto al serotipo se obtuvo de 65 casos. Se evidenciaron 19 tipos capsulares diferentes y un aislamiento resultó no tipificable. Los aislamientos portadores del serotipo 1 y del serogrupo 6, se clasificaron casi exclusivamente como de la familia 1 y los del serotipo 7F como de la familia 2 (tabla 2). El serotipo 14 se identificó en aislamientos pertenecientes a ambos tipos familiares, además en 3 aislamientos PspA-ND (Tabla 2).

Tabla 2: Distribucion de serotipos de S. pneumoniae segun familias de PspA

El 60% de los aislamientos presentó CIM de PEN<0,06 mg/ml y el 96% CIM de CTX<0,5 mg/ml. Se detectó un 29% de resistencia a TET, un 54% a TMS, 26 % a ERY y 1,5% a CLI. No se observó resistencia a LEVO, a RIFA ni a VAN. La distribución de las familias de PspA conforme a los perfiles de sensibilidad de los antibióticos se presentan en la tabla 3 y en la en la figura 1.


Figura 1:
Resistencia porcentual a antibioticos no β-lactamicos en las familias pspA. 1A: tetraciclina, 1B: trimetoprima/sulfametoxazol, 1C: eritromicina, 1D: clindamicina. N=91

Trece pacientes relacionados a los aislamientos estudiados fallecieron a causa de la infección neumocócica, 7 de ellosse vincularon a PspA1, 3 a PspA2, 1 a ambas familias y 2 a PspA-ND.

Discusión

Los datos de la prevalencia y caracterización de las familias de la PspA, están condicionados por diferencias geográficas en las poblaciones, diversidad de métodos de estudio, dificultad para el aislamiento de este microorganismo y la falta de estudios etiológicos con estrictos criterios de selección. Estos aspectos hacen sumamente difícil consensuar los resultados obtenidos hasta el momento[18, 23, 26, 30, 34]. La mayoría de los aislamientos de este trabajo se pudieron clasificar dentro de alguna de las dos familias evaluadas, en un porcentaje menor al comunicado a nivel nacional por Mollerach M. y col [30]. La existencia de aislamientos PspA-ND es consistente con otras publicaciones donde se encuentran en un rango entre el 0 y el 20% [18, 20, 26, 27, 29, 30].
Según algunos autores, esta proporción parece ser mayor entre los aislamientos no invasivos [23]. Los trabajos llevados a cabo en nuestro país, así como también en el extranjero, dan cuenta de una mayor prevalencia de aislamientos portadores de PspA1 [21, 22, 24, 29, 30, 35]. Sin embargo, algunos investigadores observaron resultados totalmente opuestos [19, 25], con una mayor proporción de aislamientos que expresan PspA2. Alternativamente a estos hallazgos, ambos tipos familiares han sido detectados de manera equitativa en un estudio multicéntrico que involucró a varios países, y en trabajos realizados en Alemania, Brasil y Finlandia [15, 18, 20, 23, 27].
La co-expresión de ambas familias, ya ha sido citada tanto por autores nacionales como extranjeros, aunque con diferentes frecuencias [15, 20, 27, 29]. PspA es un factor de virulencia bajo presión selectiva y podría recombinarse independientemente del background genético, por lo que se podrían formular hipótesis sobre algún tipo de ventaja selectiva para la evasión del sistema inmune del hospedador e infección posterior [15]. Se ha descrito que las familias de PspA no se relacionan a grupos etarios, género o al origen de los aislamientos [19- 21, 27, 29, 35], hallazgos que resultan concordantes con nuestro estudio dado que la mayor frecuencia observada de familia 1 entre las neumonías y pacientes mayores de 2 años, como así de la familia 2 entre las meningitis y pacientes menores de 2 años, no presentan diferencias estadísticamente significativas. En lo referido a los serotipos, se han notificado ciertas asociaciones, aunque con discrepancias entre los diferentes autores [18, 20, 21, 23, 26, 30, 35]. Al igual que lo observado en el presente estudio, investigadores extranjeros encontraron relación entre el serotipo 1 y la familia 1 [22, 27, 29] y del serotipo 7F con la familia 2 [29]. La distribución fue equitativa para el serotipo 14 en ambos tipos familiares [20, 22, 29]. Brueggemann y col., encontraron que los serotipos para los cuales existe una aparente asociación tienden a ser aquellos de los cuales existen pocos clones circulantes. Es decir que cuando los aislamientos de un determinado tipo capsular están similarmente distribuidos entre ambas familias, usualmente representarían linajes clonales diferentes, reduciendo la eventualidad de poseer cualquiera de las familias PspA [36]. Otros investigadores, sin embargo, no encontraron relación alguna entre serotipos y PspA [15, 19, 25], aunque sí entre estas últimas y ciertos genotipos de S. pneumoniae [19, 25, 27, 37].
La relación entre el perfil de sensibilidad a PEN y la distribución de las familias de PspA es controversial. Se ha propuesto que podría existir una tendencia, dentro de clones específicos de resistencia, de heredar un tipo familiar en particular. Pimenta y col. [26, 27], hallaron una relación entre la familia 1 y la resistencia a PEN; por otra parte, Brandileone y col. [38] observaron la asociación inversa. Al igual que Hollingshead y col. [20] no obtuvimos hallazgos que avalen estos supuestos [20]. Las diferencias de diseño de los trabajos de Pimienta y Brandileone, podrían estar condicionando esos resultados. En cuanto a la distribución de las familias de PspA según los perfiles de sensibilidad a antibióticos no β-lactámicos, Ito y col. propusieron, que los aislamientos sensibles y con resistencia moderada a ERY tienden a expresar la familia 2, y los que presentan resistencia alta, la familia 1 [21], situación que no observamos en el presente estudio.
La distribución detectada, muestra que el desarrollo de una vacuna basada en las PspA que contenga antígenos de ambas familias 1 y 2, podría ser efectiva en la región.

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Recibido: 28/10/2014
Aprobado: 12/11/2015

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