BIOLOGÍA Y GENÉTICA

Efecto de iones metálicos y compuestos aromáticos sobre la actividad lacasa en Trametes sp. nativo de Misiones

Effect of metal ions and aromatic compounds on laccase activity in Trametes sp. native of Misiones

 

Laura E. Ortellado^1,*, Maria I. Fonseca¹, Monica L. Barchuk¹, Silvana S. Sawostjanik Afanasiuk¹, Laura L. Villalba¹, Pedro D. Zapata¹

¹ Laboratorio de Biotecnologia Molecular (Biotecmol). Instituto de Biotecnologia Misiones “Dra. Maria Ebe Reca” (InBioMis). Universidad Nacional de Misiones - Ruta 12 Km 7 . (3300) Posadas – Misiones.
*E-mail: biotecmol2010@gmail.com

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Resumen

Los hongos de pudricion blanca secretan enzimas oxidativas, como la lacasa, con capacidad de intervenir en procesos amigables con el medioambiente, tales como la biorremediacion. El objetivo del presente trabajo fue formular un medio de cultivo suplementado con compuestos aromaticos e iones metalicos con el fin de aumentar los valores de actividad lacasa expresados por Trametes sp. cepa A. Utilizando un diseno de Plackett-Burman se logro establecer que el Mn2+ fue la unica variable que tuvo un efecto significativo positivo sobre la actividad. La mayor actividad lacasa (272,46 U/L) se obtuvo a una concentracion de 1,5 mM de Mn2+ y la maxima biomasa (0,1272 g) a una concentracion de 4 mM de Mn2+. Asimismo fue posible establecer una correlacion negativa entre la actividad enzimatica y el crecimiento del hongo. Se encontro una isoenzima de 60 kDa de expresion constitutiva y otra de 100 kDa inducible en presencia de 2; 2,5; 3; 3,5 y 4 mM de Mn2+.

Palabras clave: Actividad lacasa; Hongos de pudricion blanca; Trametes; Isoenzimas.

Abstract

The white rot fungi secrete oxidative enzymes, such as laccase, with a capacity to play a part in environmentally friendly processes such as bioremediation. The aim of this study was to develop a culture medium supplemented with aromatic compounds and metal ions in order to increase laccase activity produced by Trametes sp. strain A. By means of a Plackett-Burman design, it was shown that Mn2 + was the only variable that had a significant positive effect on the enzyme activity. The highest laccase activity (272.46 U / L) was obtained at a concentration of 1.5 mM Mn2 + and maximum biomass (0.1272 g) at a concentration of 4 mM Mn2 +. It also was possible to establish a negative correlation between enzyme activity and growth of fungus. An isoenzyme of constitutive expression (60 kDa) and another inducible (100 kDa) were found in the presence of 2; 2.5; 3; 3.5 and 4 mM of Mn2+.

Keywords: Laccase activity; White-rot fungi; Trametes; Isozymes.

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Introducción

Las aguas residuales provenientes de las industrias papeleras, se caracterizan por poseer gran cantidad de contaminantes que se generan en los procesos de pulpado y blanqueo de la pulpa. Estos factores hacen que esta industria contribuya a la polución ambiental ^[1]. Entre estos compuestos contaminantes se encuentran algunos que son naturales de la madera como la lignina. La lignina es un biopolímero aromático, heterogéneo, complejo; y constituye el más recalcitrante de todos los químicos orgánicos producidos naturalmente ^{[2, 3]}.
La utilización de microorganismos que degradan la lignina para la solución de problemas ambientales es una alternativa de creciente expansión e investigación en biotecnología. En este sentido un grupo de hongos denominados de pudrición blanca (del inglés “White rot fungi” o WRF) ^[4] pertenecientes a los Basidiomicetes ^[5] son los únicos capaces de atacar todos los componentes de la pared celular y degradar la lignina hasta CO2 y H2O de manera exitosa. Las lacasas fúngicas (bencenodiol: oxígeno oxidoreductasas; EC 1.10.3.2) son un tipo de oxidasas que forman parte del sistema enzimático ligninolítico y son producidas por casi todos los basidiomicetes degradadores de madera ^[6]. Se trata de una de las principales enzimas implicadas en la deslignificación del material lignocelulósico ^[7]. Tal es su importancia que, en ocasiones, se ha descrito la presencia de lacasa como única actividad ligninolítica en hongos que degradan la lignina u otros compuestos aromáticos con gran impacto ambiental, como Pycnoporus cinnabarinus ^[8] o Coriolopsis rigida ^[9]. Las lacasas catalizan la oxidación monoelectrónica de difenoles y aminas aromáticas, eliminando un electrón y un protón del grupo hidroxilo o amino para dar lugar a un radical fenoxilo o amino, respectivamente ^[10].
Para la utilización de la lacasa con fines biotecnológicos y medioambientales, así como para el conocimiento de las propiedades de la enzima se requieren grandes cantidades de la proteína. La producción, secreción y actividad de la enzima lacasa pueden depender no solo del tipo de hongo sino de las condiciones nutricionales empleadas, de la presencia o ausencia de compuestos aromáticos o metálicos así como el tiempo de exposición a estos, la naturaleza y composición del medio de cultivo ^[11]. Una opción factible para lograr este objetivo es la optimización de los medios de cultivos. Existen numerosos métodos y diseños estadísticos que son aplicados con éxito en la optimización de diferentes sistemas en el área de la microbiología ^[12]. La utilización de métodos de superficie de respuesta permite disminuir el número de ensayos experimentales, se evalúa el efecto individual de los parámetros y se genera también un modelo matemático que describe el proceso global ^[13,14]. Entre estas metodologías se destacan los diseños de Box y Wilson, Box y Hunter, Plackett-Burman ^{[15, 16, 17]}, Box-Behnken, entre otros; que se han utilizado para optimizar la producción de lacasa por hongos basidiomicetos ^{[18, 19, 20, 21]}.
El objetivo del presente trabajo fue formular un medio de cultivo suplementado con compuestos aromáticos e iones metálicos principalmente para aumentar la actividad lacasa (Lac) producida en el hongo de pudrición blanca Trametes sp. cepa A. Asimismo se evaluó el efecto de estos compuestos sobre el perfil de isoenzimas y el crecimiento del hongo utilizado.

Materiales y Métodos

Material Biológico
La cepa A del hongo de pudrición blanca Trametes sp. autóctono de la provincia de Misiones, proveniente del cepario de la Facultad de Ciencias Forestales, Universidad Nacional de Misiones, Argentina, fue el microorganismo objeto de estudio.

Medio de cultivo sólido
El medio de cultivo agar/extracto de malta (MEA) fue utilizado para la reactivación del crecimiento de la cepa, en placas de Petri de 90 mm de diámetro, cuya inoculación fue realizada mediante una punción con ansa aguja en el centro de la placa y para la posterior obtención de los tacos de agar de 2 mm de diámetro con micelio. Este medio está compuesto por 20 g/L de agar y 12,7 g/L de extracto de malta. Los componentes fueron disueltos con agua destilada y esterilizados en autoclave a 121°C y 1 atmósfera durante 15 min.

Medio de cultivo líquido

El medio de cultivo extracto de malta/extracto soluble de maíz (ME) fue utilizado para realizar los diferentes experimentos en medio líquidos. Este medio contiene 12,7 g/L de extracto de malta y 0,5% p/v de extracto soluble de maíz y agua destilada. Todos los componentes fueron disueltos con agua destilada y se distribuyo 25 ml en erlenmeyer de 100 ml, esterilizados en autoclave a 121°C y 1 atmósfera durante 15 min.

Efecto de compuestos aromáticos y metálicos sobre la actividad lacasa y biomasa: Diseño experimental Plackett- Burman
El diseño Plackett-Burman es una herramienta útil para estudiar n variables (n – 3 factores reales y variables falsas para estimar errores) en n + 1 experimentos, lo cual reduce el enorme número de experimentos que se deberían llevar a cabo si se trabajara con un diseño factorial 2n completo ^{[15, 12, 22]}. En el presente estudio para analizar el efecto de compuestos metálicos Cu2+ (CuSO4), Mn2+ (MnSO4) y compuestos aromáticos (ácido siríngico, ácido ferúlico, guayacol) sobre la actividad enzimática lacasa se utilizó un diseño de Plackett-Burman, cada variable fue evaluada en dos niveles, un nivel de presencia y otro de ausencia (Tabla 1).

Tabla 1: Variables ensayadas en el Diseno Plackett-Burman con sus respectivos niveles. Las concentraciones de los diferentes compuestos se encuentran en mM

Para ello el hongo fue crecido en medio ME, incubado en estufa a 29 ºC de manera estática durante 11 días. Luego de 3 días de cultivo fueron suplementados con los compuestos aromáticos y metálicos en una combinación única de variables (Tabla 1). Los niveles de cada una de las variables utilizadas en los ensayos fueron seleccionados en base a experiencias anteriores en los trabajos de Piscitelli y col. (2011); Fonseca y col. (2010); Saparrat y col. (2010); Cambria y col. (2010); Scheel y col. (2000) ^{[11, 23, 24, 25, 26]}. Posteriormente cada 2 días se procedió a retirar cuidadosamente una muestra de 700 μl del sobrenadante para medición de la actividad lacasa. Finalmente el día 11 de cultivo se separó el micelio del sobrenadante por filtración en embudo de Buchner utilizando filtros de fibra de vidrio. Los micelios fueron utilizados para la determinación de la biomasa. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Optimización de la actividad lacasa producida
En base al análisis estadístico y a los resultados obtenidos del Diseño Plackett-Burman, se seleccionó la variable que ejerció un efecto positivo sobre la actividad de la enzima lacasa. Para determinar la concentración óptima en la cual se obtiene la mayor actividad lacasa, se realizaron una serie de experimentos con diferentes concentraciones de 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 y 4 (mM) del compuesto Mn2+ (MnSO4).

Caracterización bioquímica parcial de lacasas secretadas en sobrenadantes de cultivo Determinación de la actividad enzimática Lacasa
La determinación de actividad Lac (EC 1.10.3.2) se realizó empleando la técnica descripta por Field y col. (1993) ^[27], con 2,6- dimetoxifenol (DMP-Fluka Sigma Aldrich-Argentina) 5 mM como sustrato en buffer acetato de sodio 0,1 mM (pH 3,6). El cambio de la absorbancia se monitoreó utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV-3600. La actividad enzimática se expresó en unidades enzimáticas (U), donde 1 U es equivalente a 1 mM /min de producto.

Análisis del perfil de isoenzimas lacasas secretadas en sobrenadantes de cultivo
La existencia de isoenzimas se determinó mediante electroforesis no desnaturalizante en geles de poliacrilamida al 7,5% p/v (ND-PAGE) ^{[24, 28]}. La corrida electroforética se realizó a 100 V por 120 min en buffer Tris-Glicina 1,5 M, pH 8,3. Los geles se fijaron en una solución conteniendo 40% v/v de metanol, 10% v/v de ácido acético, 50% de agua y fueron revelados con una solución de 2,6-dimetoxifenol 5 mM en buffer acetato de sodio 0,1 M (pH 3,6) para detectar las bandas con actividad Lac ^{[24, 28]}.
El peso molecular fue estimado mediante electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) utilizado un patrón de masa molecular preteñido (Prestained Kaleidoscope SDS-PAGE standard broad range, de BioRad) ^{[23, 28, 29]}. La corrida electroforética se realizó a 100 V por 120 min en buffer Tris-Glicina 1,5 M, pH 8,3. Para la detección de las bandas el gel se trató previamente con una solución de acetato de sodio 50 mM y Tritón X-100 0,2% v/v durante 30 min para eliminar el SDS y permitir el replegamiento del dominio catalítico. Luego se reveló con DMP 5 mM en buffer acetato pH 3,6 a 30°C por 10 min ^{[24, 28]}.

Determinación de la Biomasa
Para determinar biomasa, el micelio presente en los sobrenadantes de los cultivos fue retenido por filtración utilizando filtros de papel de fibra de vidrio (GF/C- Sigma Aldrich-Argentina), y luego secado a 80°C por 24 h, tras lo cual se obtuvo el peso seco del micelio por diferencia de pesado ^[23].

Análisis Estadísticos

El análisis estadístico del Diseño Plackett-Burman se realizó utilizando Stat graphics plus de Windows 5.1 ^[30]. El análisis de ANOVA y el test de Bonferroni, se realizaron utilizando el programa Graphpad Prism Program versión 5.3 de Windows (www.graphpad.com).

Resultados y Discusión

El diseño de Plackett-Burman seleccionado incluyó 24 corridas experimentales en las cuales se evaluaron 8 variables (5 reales y 3 falsas). Se estudió la adición de iones metálicos: Cu2+ (CuSO4), Mn2+ (MnSO4) y de compuestos aromáticos: ácido ferúlico, ácido siríngico, guayacol como posibles estimuladores de la actividad enzimática lacasa. Los mayores títulos de actividad enzimática lacasa (80,91 U/L; p< 0,001) con Mn2+ (MnSO4) fueron obtenidos el día 9 para Trametes sp. cepa A. Para evaluar la significancia de cada variable sobre las respuestas buscadas, se utilizó el análisis de la varianza en combinación con la prueba de Fisher con un nivel de confianza del 95% (p<0,05). Para facilitar la visión e interpretación de los análisis estadísticos se utilizaron gráficos de Pareto. (Figura 1 y 2).

Figura 1: Grafico de Pareto para la actividad enzimatica lacasa en el hongo de pudricion blanca Trametes sp. cepa A. El largo de las barras de cada grafico es proporcional al efecto estandarizado, las barras de color fucsia y rojo representan los factores con efectos positivos y negativos sobre las variables de respuesta, respectivamente. La extension de las barras mas alla de la linea vertical representan las variables con influencia significativa sobre la respuesta analizada con un nivel de confianza del 95%. FV: Falsa variable.

Figura 2: Grafico de Pareto para la biomasa en el hongo de pudricion blanca Trametes sp. cepa A. El largo de las barras de cada grafico es proporcional al efecto estandarizado, las barras de color fucsia y rojo representan los factores con efectos positivos y negativos, respectivamente sobre las variables de respuesta. La extension de las barras mas alla de la linea vertical representan las variables con influencia significativa sobre la respuesta analizada con un nivel de confianza del 95%. FV: Falsa Variable.

El análisis de los resultados obtenidos mostró que el Mn2+ (MnSO4) fue la variable con mayor efecto positivo en su nivel presencia (p<0,05) (Figura 1) sobre la actividad enzimática lacasa, mientras que las otras variables Cu2+ (CuSO4), ácido ferúlico, ácido siríngico, guayacol fueron significativas (p<0,05) pero de forma negativa en su nivel ausencia (Figura 1). Se obtuvo un coeficiente de determinación (R2 = 73,88%) lo cual indicó que el modelo no pudo explicar el 26,11% de las variaciones. El Mn2+ (MnSO4) demostró ser un potenciador de la actividad enzimática, resultado que concuerda con los reportados previamente por Galhaup y Haltrich (2001) en Trametes pubescens, quienes observaron que únicamente el cobre y el manganeso (1 mM) incrementaron la producción de lacasa. Soden y Dobson (2001), demostraron que el manganeso actúa como un inductor de transcritos de lacasa en Pleurotus sajor-caju y se ha observado también un efecto similar en otros hongos ^{[26, 31, 32]}.
En cuanto al crecimiento del micelio, los mayores valores de biomasa (0,0797 g; p< 0,001) se obtuvieron también el día 9 para Trametes sp. cepa A. El análisis de los resultados obtenidos mostró que el crecimiento micelial se vio favorecido significativa y positivamente (p<0,05) por la adición de Mn2+ (MnSO4), indicando que su presencia como componente del medio de cultivo en su nivel presencia jugó un rol clave en el desarrollo del micelio. Por otro lado, las variables Cu2+ (CuSO4), ácido ferúlico, ácido siríngico, guayacol fueron significativamente (p<0,05) negativas en su nivel ausencia sobre la biomasa. El Coeficiente de determinación (R2 = 64,80%) indicó que el modelo no pudo explicar el 35,20% de las variaciones (Figura 2).
La capacidad de las cepas fúngicas para crecer en presencia de compuestos aromáticos está directamente relacionada con la habilidad del hongo de desarrollar mecanismos y/o reacciones que favorezcan su adaptación a diversos sustratos. Entre los mecanismos pueden mencionarse diversas reacciones de transformación parcial, una completa degradación de hidrocarburos en presencia de un sustrato secundario compatible y la utilización independiente de los hidrocarburos como una única fuente de carbono para el crecimiento ^[33]. El efecto negativo en el crecimiento fúngico desarrollado en la cepa estudiada puede deberse a una ausencia en la capacidad de tolerar los compuestos aromáticos empleados ^[34].

Optimización de la Actividad Lacasa
En base a los resultados obtenidos del diseño de Plackett-Burman se logró identificar y seleccionar la variable Mn2+ (MnSO4) como la única variable con efecto significativo y positivo sobre la actividad lacasa producida para Trametes cepa A. Para determinar la concentración óptima en la cual se obtiene el mayor incremento de la actividad lacasa se evaluaron diferentes concentraciones: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 y 4 (mM) de Mn2+ (MnSO4). Para evaluar esta variable se utilizó medio líquido ME como medio de prueba, suplementado con las diferentes concentraciones de Mn2+ (MnSO4) cultivado a 29ºC de manera estática durante 9 días.
Todos los tratamientos realizados con diferentes concentraciones de MnSO4 demostraron un incremento (p<0,001) en la actividad lacasa producida de Trametes sp. cepa A. El mayor incremento se obtuvo con la concentración de 1,5 mM (p<0,05), siendo de 272,46 U/L seguido por los ensayos con 2 y 2,5 mM (p<0,05) con 192,06 U/L y 195,63 U/L respectivamente. La menor actividad lacasa registrada fue en el tratamiento efectuado con 4 mM (p<0,05) con 99,69 U/L (Figura 3).

Figura 3: Grafico de barras de los resultados obtenidos de actividad enzimatica lacasa con diferentes concentraciones de Mn2+ (MnSO4).

La determinación de biomasa en todos los tratamientos, mostró que la mayor cantidad (0,1272 g) se produjo a una concentración de 4 mM (p<0,05), seguida por los ensayos con 3 y 2 mM (p<0,05) obteniéndose 0,090 g y 0,088 g respectivamente. Los niveles de biomasa más bajos registrados correspondieron a los tratamientos efectuados con 1 y 1,5 mM (p<0,05) con 0,038 g y 0,0363 g respectivamente (Figura 4).

Figura 4: Grafico de barras de los resultados obtenidos de la biomasa con diferentes concentraciones de Mn2+ (MnSO4).

Del análisis de correlación entre la actividad enzimática y la biomasa pudo observarse que cuando aumentó la biomasa, disminuyó la actividad enzimática (r = -0,7). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en el trabajo realizado por Manubens y col. (2007) en el basiomicete Ceriporiopsis subvermispora ^[35]. Otros autores también coinciden en afirmar que la producción de lacasa generalmente no está directamente relacionada con el crecimiento fúngico ^{[36, 37]}.

Detección de Isoenzimas Mediante Zimografía

El perfil electroforético del zimograma reveló la presencia de una enzima presente en todos los tratamientos de mayor movilidad y otra de menor movilidad que únicamente apareció en presencia de 2; 2,5; 3; 3,5 y 4 mM de MnSO4 (Figura 5). Para estimar el peso molecular de las isoenzimas observadas en los tratamientos realizados anteriormente, se procedió a su separación electroforética mediante SDSPAGE y posterior detección según la técnica ya descripta previamente (ver sección materiales y métodos) (Figura 6).

Figura 5: Zimograma de los tratamientos con diferentes concentraciones de Mn2+ (MnSO4); 1: 0,5 mM; 2: 1 mM; 3: 1,5 mM; 4: 2 mM; 5: 2,5 mM; 6: 3 mM; 7: 3,5 mM; 8: 4 mM; 9: control en ausencia del compuesto. Las flechas indican las isoenzimas.

Figura 6: Estimacion del peso molecular (SDS-PAGE) de isoenzimas lacasa de Trametes sp. cepa A en los tratamientos con diferentes concentraciones de Mn2+ (MnSO4); PM: Peso molecular (kDa); 1: 0,5 mM; 2: 1 mM; 3: 1,5 mM; 4: 2 mM; 5: 2,5 mM; 6: 3 mM; 7: 3,5 mM; 8: 4 mM; 9: control en ausencia del compuesto. Las flechas indican las isoenzimas.

Se evidenció la presencia de una isoenzima de 60 kDa, presente en todos los tratamientos realizados incluyendo al control en ausencia de MnSO4. Además fue posible visualizar una segunda isoenzima de aproximadamente 100 kDa detectada únicamente con 2; 2,5; 3; 3,5 y 4 mM de MnSO4. Cabe destacar que esta segunda isoenzima estuvo presente en solo algunos de los tratamientos realizados, por lo que es probable que esta sea una isoenzima inducible. En concordancia con los resultados obtenidos, Palmieri y col. (2000) publicaron que la adición de MnSO4 produce patrones isoenzimáticos diferentes de lacasas en Pleurotus ostreatus ^[38]. También la suplementación de cultivos de Coprinus comatus con Mn2+ revelaron mediante electroforesis la presencia predominante de la isoenzima Lac 1, y en los ensayos con una concentración de entre 0,3 a 1 mM de Mn2+ se observaron dos bandas difusas y poco claras correspondientes a las isoenzimas Lac 2 y Lac 3 ^[39].

Conclusiones

El hongo de pudrición blanca Trametes sp. cepa A demostró ser una fuente para la producción de lacasa influenciada por la presencia de manganeso.
También fue posible determinar, que la existencia de una disminución en la biomasa conlleva al aumento de la actividad lacasa. Con los ensayos realizados en este trabajo para la determinación del perfil enzimático, se logró la caracterización del perfil de isoenzimas lacasas existente, cuyo patrón dependió de la concentración del manganeso, revelándose la presencia de dos isoenzimas, una de 60 kDa cuya expresión es constitutiva y otra de 100 kDa de expresión inducida.
Estas características evidencian en la cepa estudiada un potencial para la producción de lacasa con aplicaciones biotecnológicas y una viabilidad de realizar posteriores estudios en vistas de lograr un incremento de su producción.

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Recibido: 20/08/14.
Aprobado: 26/02/16.