BIOQUÍMICA Y FARMACIA

Diseño de péptidos inhibidores de interacciones de la subunidad GluN2B del receptor NMDA en isquemia

 

Edwin Alfredo Reyes Guzmán^1,*, Nohora Angélica Vega Castro¹, Edgar Antonio Reyes Montano¹

¹ Universidad Nacional de Colombia, Colombia.
* E-mail: eareyesm@unal.edu.co

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Resumen

El receptor NMDA constituye el principal subtipo de receptores de glutamato implicados en procesos fisiológicos tales como desarrollo neuronal, plasticidad sináptica, memoria y aprendizaje y numerosas condiciones patológicas como daño isquémico, dolor crónico, psicosis, y otros trastornos degenerativos. Se ha sugerido la regulación por fosforilación como un mecanismo de alteración de la permeabilidad relativa del NMDAR a Ca2+ durante la isquemia. En este trabajo se diseñó una serie de péptidos basados en interacciones de la subunidad GluN2B con las proteínas DAPK1, SRC y D2R, relacionadas con los efectos generados tras un evento isquémico. La identificación de sitios de unión entre estas moléculas y GluN2B permitió hacer un diseño in silico de péptidos que eventualmente pueden bloquear dichas interacciones y reducir los efectos nocivos de patologías como la isquemia. Nuestros resultados demuestran que el diseño racional de péptidos es una buena estrategia para la generación de nuevos agentes terapéuticos.

Palabras clave: NMDA; Isquemia; Péptidos; Diseño; In silico.

Abstract

The NMDA receptor is the major subtype of glutamate receptors involved in physiological processes such as neuronal development, synaptic plasticity, learning and memory and numerous pathological conditions such as ischemic damage, chronic pain, psychosis, and other neurodegenerative disorders. It has been suggested regulation by phosphorylation as a mechanism altering the relative permeability of the NMDAR to Ca2 + during ischemia. This paper presents a series of peptides that were designed based on GluN2B subunit interactions with proteins DAPK1, SRC and D2R related to the effects generated after an ischemic event. The identification of binding sites among these molecules and GluN2B allowed to make an in silico design of peptides that can eventually block these interactions and reduce the harmful effects of diseases such as ischemia. Our results demonstrate that the rational design of peptides is a good strategy to generate new therapeutic agents.

Keywords: NMDA; Ischemia; Design; Peptides; In silico.

Resumo

O receptor de NMDA é o subtipo de receptores de glutamato envolvidos em processos fisiológicos tais como o desenvolvimento neuronal, plasticidade sináptica, aprendizagem e memória e numerosas condições patológicas tais como lesão isquémica, dor crónica, psicose, e outras desordens neurodegenerativas. Tem sido sugerido por regulação da fosforilação de um mecanismo de alterar a permeabilidade relativa do NMDAR ao Ca2 + durante isquemia. Este artigo apresenta uma série de peptídeos com base em interações de subunidades GluN2B com proteínas DAPK1, SRC e D2R relacionados com os efeitos gerados após um evento isquêmico foi projetado. A identificação de sítios entre estas moléculas e GluN2B ligação permissão para fazer um desenho em silico de péptidos que podem, eventualmente, bloquear estas interacções e reduzir os efeitos prejudiciais das doenças tais como a isquemia. Os nossos resultados demonstram que a concepção racional de péptidos é uma boa estratégia para gerar novos agentes terapêuticos.

Palavras-chave: NMDA; Isquemia; Peptídeos; Design; In silico.

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Introducción

El receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA) constituye el principal subtipo de receptores de glutamato y normalmente participa en la transmisión sináptica excitatoria rápida. Estos receptores se expresan ampliamente, y han sido implicados en procesos fisiológicos tales como el desarrollo neuronal, plasticidad sináptica, memoria y aprendizaje y numerosas condiciones patológicas ^[1]. También se ha involucrado al NMDAR, en procesos como el daño isquémico [2], dolor crónico, psicosis, y los principales trastornos degenerativos como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer ^{[3, 4]}.
Los receptores NMDA se presentan principalmente como conjuntos de tetrámeros de dos subunidades GluN1 de unión de glicina y dos subunidades de unión a glutamato, de los cuales hay cuatro tipos (GluN2A, GluN2B, GluN2C y GluN2D). Ambos tipos de subunidades GluN2A y GluN2B son consideradas como las principales para el funcionamiento de los receptores NMDA en las neuronas del sistema nervioso central (SNC) ^[5].
La subunidad GluN2 controla una amplia gama de propiedades funcionales de los receptores NMDA, y se expresa diferencialmente en todo el Sistema Nervioso Central (SNC) ^{[6, 7]}. Cada subunidad del receptor NMDA está compuesta de cuatro dominios, que incluyen el dominio amino terminal extracelular (ATD), el dominio de unión a ligando extracelular (LBD), el dominio transmembranal (TMD) y el dominio carboxilo-terminal intracelular (CTD) ^[8]. El dominio CTD media las interacciones del receptor NMDA con múltiples proteínas sinápticas y de citoesqueleto que permiten la regulación del tráfico a nivel sináptico y la función del receptor ^[9].
A nivel fisiológico los receptores NMDA están bloqueados en el poro de permeación por un ion Mg2+ mecanismo que es voltaje-dependiente. La funcionalidad del NMDAR está dada por la unión del ligando glutamato y el coagonista glicina, así como del desbloqueo voltaje-dependiente a nivel del poro ^[4].
Los receptores NMDA son altamente permeables a Ca2+ y Na+. La permeabilidad iónica de Na+ producto de la activación de otra familia de receptores de glutamato (AMPA) contribuye a la despolarización de la membrana, y el influjo del calcio exógeno vía NMDAR genera el calcio transitorio responsable de los efectos fisiológicos ^[10]. Sin embargo los receptores NMDA están involucrados en procesos que resultan tóxicos para la funcionalidad celular, particularmente la capacidad de permeación de Ca2+, el cual se convierte en un mediador de la muerte neuronal.
Dado el complejo funcionamiento del receptor NMDA en la transmisión sináptica, procesos de memoria y aprendizaje y que está altamente implicado en procesos patológicos como el daño isquémico, la farmacología en relación a la regulación del receptor se ha centrado en probar antagonistas dirigidos al sitio de unión de glutamato, al sitio de unión de la glicina, al canal y a sitios de regulación alostérica del receptor, todos como agentes neuroprotectores en múltiples ensayos preclínicos, sin embargo estos acercamientos han fallado ^[11-17]. En el caso de agentes bloqueadores del canal (aptiganel, Cerestat; CNS 1102), y del sitio de unión a glutamato, los niveles de antagonismo necesarios para generar neuroprotección, afectan la función cardiovascular y alteran la cognición (efectos psicóticos) ^{[15, 17]}. Gavestinel (GV150526), dirigido al sitio de unión a glicina, también falló en la neuroprotección deseada ^[18]. Un antagonista selectivo de la subunidad GluN2B CP-101,606 es aparentemente insuficiente para protección del daño isquémico severo ^[19]. En otro tipo de patologías como Alzheimer y Parkinson el agente Memantina ha presentado resultados prometedores dada su baja afinidad y rápida cinética de disociación, características que no presentan los antagonistas clásicos ^[20].
El complejo GluN1/GluN2B extrasináptico del NMDAR, juega un papel importante en la isquemia cerebral. Se ha sugerido la regulación por fosforilación como un mecanismo de alteración de la permeabilidad relativa del NMDAR a Ca2+ durante la isquemia [21]. La isquemia aumenta diferencialmente la fosforilación de tirosinas y serinas en el CTD de la subunidad GluN2B, reclutando proteínas como DAPK1 al complejo GluN1/GluN2B, DAPK1 interactúa física y funcionalmente con el C-terminal a nivel de la Ser 1303 de la subunidad GluN2B, ésta interacción actúa como un mediador central para el daño excitotóxico ^[21]. Así mismo, SRC, un miembro de la familia de proteínas quinasas (SFKs), contribuye al daño cerebral y potencia la actividad de los receptores NMDA en la isquemia a través de la fosforilación de la Tyr 1472 de la subunidad GluN2B ^{[22, 23]}. Por su parte el receptor de dopamina D2 (D2R) interactúa directamente con la Ser 1303 de GluN2B, afectando la fosforilación de la Ser 1303 que está mediada por la proteína quinasa II dependiente de calmodulina (CaMKII), y que regula la actividad y el tráfico del receptor NMDA ^{[24, 25]}.
Dado que a la fecha no hay un tratamiento farmacológico eficaz para regular los procesos involucrados en las patologías dependientes del receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA), se hace necesaria la búsqueda de nuevos fármacos o farmacoterapia dirigida hacia los diferentes sitios moduladores del receptor NMDA.
En este estudio se generó una pequeña librería de péptidos candidatos como inhibidores de interacciones proteína-proteína, mutando sistemáticamente los residuos de péptidos derivados de las interacciones de las proteínas DAPK1, SRC y D2R con la subunidad GluN2B del receptor NMDA, la cual ha sido altamente involucrada en el daño isquémico y otras patologías ^{[21, 26, 27]}. Los residuos aminoacídicos se sustituyeron por residuos con los que comparten características químicas similares y las mutaciones fueron evaluadas a través de una simulación de acoplamiento molecular para determinar si se aumen
taba la afinidad de unión de los péptidos mutados respecto a los péptidos originales. Los complejos péptido-receptor que presentaron valores de energía de unión mayor, fueron refinados optimizando el esqueleto peptídico y la orientación de la conformación de cada péptido y se analizó las interacciones que favorecieron ese complejo: con base en lo anterior se propusieron 12 péptidos para ser evaluados funcionalmente en trabajos posteriores.

Materiales y Métodos

Identificación de las interacciones entre proteínas
Se conoce experimentalmente que hay interacción directa entre las proteínas DAPK1 ^[21], SRC ^[23] y D2R ^[24] con el dominio carboxilo terminal intracelular de la subunidad GluN2B del receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA). Para validar esas interacciones directas entre las proteínas mencionadas con la subunidad GluN2B, se hizo uso de la herramienta String versión 9.05 (http://string-db.org/) ^[28], que es una base de datos que permite una selección de interacciones directas (físicas) e indirectas (asociaciones funcionales) entre proteínas. La base de datos String, presenta interacciones conocidas entre proteína-proteína a partir del contexto genómico y resultados experimentales.
La búsqueda de interacciones se realizó introduciendo los nombres de los pares de proteínas en el espacio de búsqueda para múltiples proteínas (ejemplo; GluN2B y DAPK1), se escogió como organismo "Homo sapiens, Mus musculus y Rattus norvegicus" en todas las búsquedas, ya que corresponden a los organismos para los cuales String tiene mayor información. Una vez String arrojó el mapa de resultados, que presenta las interacciones a través de líneas conectoras entre cada proteína junto con un puntaje (score) de cada interacción, se realizó la selección de las interacciones de nuestro interés (GluN2B-DAPK1, GluN2B-SRC, GluN2B-D2R) y se obtuvo la secuencia de cada proteína y las secuencias específicas de interacción de acuerdo a los reportes de literatura obtenidos por String. Para determinar si los segmentos o zonas de interacción entre proteínas estaban conservados en las tres especies mencionadas anteriormente, se realizaron alineamientos múltiples usando el programa Clustal Omega V1.2.1 (matriz PAM 250) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) ^[29].

Selección de las estructuras "PDB" y/o generación por modelamiento estructural
Para la selección de las estructuras tridimensionales de las proteínas GluN2B y DAPK1 se realizó una búsqueda en la base de datos Protein Data Bank, PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)^[30]. La proteína GluN2B no presentó estructura tridimensional reportada en PDB de forma que se realizó modelamiento de la estructura tridimensional mediante el servidor I-TASSER (server for protein structure and function prediction. http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)^[31]. El resultado del modelamiento fue sometido a validación del modelo estructural mediante la herramienta PDBsum (http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/) ^[32], que permite determinar una serie de parámetros como los perfiles de hidrofobicidad de cada modelo, accesibilidad a solvente, predicción de sitios de unión a ligandos y análisis de diagramas de Ramachandran (Procheck) para evaluar correspondencias en estructura secundaria, esto se hizo para todos los modelos descritos a continuación.
- GluN2B. Se realizó modelamiento de toda la proteína (1482 a.a), así como de la zona extracelular (dominios LBD y ATD, aminoácidos 1-817) y del dominio intracelular (aminoácidos 839-1482) de forma independiente usando las secuencia para Rattus norvegicus, código de secuencia en Ensembl ENSRNOP00000011697.
-APK1. Se utilizó una de las estructuras con mejor resolución reportada en PDB para ésta proteína, código PDB 1IG1 con una resolución de 1.80 Å ^[33] que contiene el dominio catalítico y unión a GluN2B. Ésta estructura corresponde para Homo sapiens, de manera que se realizó un alineamiento múltiple usando el programa Clustal Omega V1.2.1 (Matriz PAM 250) entre la secuencia de Homo sapiens (código de secuencia en Ensembl: ENSP00000350785), la secuencia de rata (Rattus norvegicus, código de secuencia en Ensembl: ENSRNOP00000062122) y la secuencia para Mus musculus (código de secuencia en Ensembl: ENSMUSP00000040825), para determinar si el contenido de aminoácidos del dominio catalítico involucrados en el mecanismo de acción de DAPK1 (Val 96, Glu 94, Glu 100, Lys 42, Phe 24, Asp 161 y Gln 23) estaban conservados en las tres secuencias.

Identificación de péptidos e inserción de mutaciones
La secuencia de los péptidos se obtuvo a partir de la zona de interacción entre cada proteína y la subunidad GluN2B como se mencionó en un apartado anterior y se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1: Péptidos seleccionados de acuerdo a las interacciones de las proteínas SRC, DAPK1 (GluN2Bp) y D2R con la subunidad GluN2B.

Se generó el modelo estructural de cada péptido usando UCSF Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)^[34], y se realizó minimización de energía de cada estructura para lo cual se adicionaron los hidrógenos y estados de protonación, el proceso incluyó 100 pasos descendentes de minimización iterativos hasta un mínimo local energético usando el campo de fuerza Amber.
A las secuencias de los péptidos presentados en la tabla 1, se les realizó una serie de mutaciones en cada péptido con el fin de evaluar la afinidad en la interacción entre cada péptido y proteína, y así obtener péptidos adicionales con efecto bloqueador de la interacción entre las proteínas mencionadas previamente.
Se construyó una librería de péptidos haciendo mutaciones de cada una de las secuencias de la tabla 1. Para los péptidos GluN2Bp, SRCp y D2Rp algunos residuos en posiciones específicas se mutaron de acuerdo a resultados de hidrofobicidad usando la herramienta Peptide Property Calculator (www.genscript.com), así; residuos con carácter hidrofóbico fueron reemplazados por residuos con características químicas similares en sus cadenas laterales, en otros casos esos residuos hidrofóbicos se mutaron por residuos aminoacídicos con cadena lateral cargada.
Para realizar una selección preliminar o filtrado de la librería de péptidos se evaluó el índice de hidrofobicidad (GRAVY) de cada péptido usando ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/), se seleccionaron por cada clase de péptido al menos dos péptidos con alto grado de hidrofobicidad y dos con bajo grado de hidrofobicidad, de esta forma la librería de redujo a 43 péptidos.
La interacción y la afinidad de unión de los péptidos mutados con su respectivo receptor fueron evaluadas a través de una Simulación de Acoplamiento Molecular "Docking".

Simulación de Acoplamiento Molecular "Docking"
La evaluación de las interacciones y afinidad de unión tanto de los péptidos originales como de las mutaciones se realizó mediante "Autodock Vina" (http://vina.scripps.edu/)^[35].
Para realizar los dockings fue necesario hacer una preparación del receptor (proteínas) y ligandos (péptidos) usando la interfaz gráfica Autodock tools. Para las estructuras provenientes de PDB, la preparación de las estructura incluyó la eliminación de las moléculas de agua, iones y cofactores, así como la asignación de átomos de hidrógeno y cargas formales a las estructuras. Para los modelos estructurales obtenidos por I-Tasser, solamente se asignaron los átomos de hidrógeno y las cargas formales.
Se generó una caja de cribado o "Grid Box" con dimensiones específicas centrada en la secuencia de interés del receptor como blanco para el Docking. Las configuraciones de la caja de cribado para cada par ligando-receptor se presentan en la tabla 2, la columna "ligando" hace referencia a los péptidos originales y a las mutaciones derivados de éstos, también se incluyó los péptidos GluN2Bp1 y GluN2Bp2 cuyo blanco son las proteínas SRC y D2R respectivamente. El espaciado (Grid Box) fue de 1 Å, la exhaustividad y el número de resultados por Docking fue de 10 en todos los casos.

Tabla 2: Coordenadas y tamaño de la caja de cribado (Grid Box) para todos los Dockings (incluido mutaciones). El ligando hace referencia a los péptidos y el receptor a las proteínas.

Los resultados que arrojó Autodock Vina fueron visualizados en Autodock Tools v.1.5.4. y corresponden a las mejores poses (configuración y orientación) con valores de energía de unión más bajos en Kcal/mol, junto con los valores de la desviación de la media cuadrática o RMSD (root-mean-square deviation) entre conformaciones.
De acuerdo a los resultados del docking, se seleccionaron tres péptidos con valores de energía más baja que el péptido original o péptido control por cada clase de interacción. Se diseñó también una serie de péptidos con el mismo contenido aminoacídico de los péptidos seleccionados, pero con la secuencia en orden aleatorio (scramble) esto con el fin de tener controles negativos en las pruebas funcionales. De esta forma por cada clase de interacción (GluN2B-DAPK1, GluN2B-SRC, GluN2B-D2R) se tuvo un total de 15 péptidos, 5 por cada interacción, incluido los tres péptidos mutados seleccionados, el péptido original o control y el péptido scramble.
Los resultados de Docking fueron refinados usando el programa Rosetta FlexPepDock web server (http://flexpepdock.furmanlab.cs.huji.ac.il/index.php)^[36], es un programa en línea que permite hacer un refinamiento de complejos péptido-proteína optimizando el esqueleto peptídico y la orientación de la conformación de cada péptido mediante el método de Monte-Carlo y un enfoque de minimización. Para la estructura de partida se realizaron 200 simulaciones FlexPepDock independientes. 100 de las simulaciones se llevaron a cabo estrictamente en el modo de alta resolución, mientras las otras 100 simulaciones incluyeron una etapa de pre-optimización de baja resolución, seguido por el método de refinamiento de alta resolución. De este modo se generó un total de 200 modelos que se clasificaron energéticamente en base a la función de puntuación de Rosetta ^[37].
Los mejores resultados obtenidos del refinamiento (complejos .pdb péptido-proteína) se visualizaron con UCSF Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)^[34] y se generaron la imágenes de los dockings. Para la determinación de las interacciones péptido-proteína se usó el programa Discovery Studio Visualizer v4.1. (http://accelrys.com/products/discovery-studio/visualization.html).

Resultados y Discusión

Identificación de las interacciones entre proteínas
La base de datos String presenta las interacciones directas entre proteínas mediante una red con líneas de color que conectan cada proteína (Tabla 3), de esta forma se puede ver que de los pares de interacciones, la interacción GluN2B-SRC corresponde a la de mayor puntuación en las tres especies; Mus musculus (0.988), Homo sapiens (0.979) y Rattus norvegicus (0.910) (Tabla 3, Resultado String).

Tabla 3: Identificación de las Interacciones de las proteínas D2R, SRC, DAPK1 con GluN2B. Se presenta el mapa de resultados obtenidos por String y el puntaje por cada interacción (en amarillo) un valor cercano a 1 indica mayor fiabilidad (evidencia) de la interacción. TE transferencia de especie. Código de color: Minería de datos Datos Experimentales Bases de datos Coexpresión.

Del resultado de alineamiento múltiple para SRC en los tres organismos, se puede ver que el segmento que se ha identificado para la interacción con GluN2B (segmento 40-58 en Homo sapiens y Mus musculus; segmento 40-59 en Rattus norvegicus) presenta una serie de sustituciones (color magenta, Fig. 1) ligeramente conservadas entre los organismos y presenta también deleciones entre las secuencias que sin embargo no parecen alterar la interacción con GluN2B de acuerdo al método de determinación experimental de la interacción como lo presenta String.

Figura 1: Alineamiento múltiple de segmentos de las secuencias de la proteína SRC de Homo sapiens, Mus musculus y Rattus norvegicus. En amarillo se presenta el segmento de interacción con GluN2B. En magenta las deleciones y los residuos que no están conservados en las tres especies.

Por su parte la interacción GluN2B-D2R en Mus musculus (0.623) y Homo sapiens (0.551) ha sido extraída mediante minería de datos (línea verde), en este caso la interacción ha sido tomada como transferencia de especie "TE", es decir, que la interacción ha sido determinada experimentalmente en Rattus norvegicus, y dado que el sitio de interacción está conservado en Mus musculus, Homo sapiens y Rattus norvegicus, se predice que habrá interacción entre la proteína D2R y GluN2B en los organismos relacionados.
Para la interacción GluN2B-DAPK1, la determinación experimental de la interacción fue en Mus musculus (0.924) y debido a que los residuos de interacción también están totalmente conservados en la proteína DAPK1 entre los tres organismos, por transferencia de especie se espera la interacción GluN2B-DAPK1 en Homo sapiens (0.883) y Rattus norvegicus (0.724).
Los residuos y segmentos de aminoácidos involucrados en las interacciones (GluN2B-DAPK1, GluN2B-SRC y GluN2B-D2R) se muestran en la tabla 3, en la casilla de "Interacción", esos segmentos se tomaron como los péptidos iniciales o péptidos control.

Selección de las estructuras "PDB" y/o generación por modelamiento estructural
En total por proteína I-Tasser generó 5 modelos con los mejores resultados C-score y TM-score, de los cuales se escogió el modelo con el C-score más positivo y que presentara correspondencia estructural con el tipo de proteína analizada de acuerdo al TM-score, los resultados son presentados en la tabla 4.

Tabla 4: Resultados (función de puntuación) C-score, TM-score y RMSD de cada modelo generado por I-Tasser. Se presentan tres modelos para la proteína GluN2B, un modelo para la proteína completa (all), otro para el dominio extracelular (ext) y otro para el dominio C-terminal intracelular (int). El homólogo estructural corresponde a la estructura cristalográfica principal tomada por I-TASSER como estructura de referencia para generar los modelos.

De acuerdo a los parámetros expuestos anteriormente, se puede observar (Tabla 4) que para los modelos GluN2B_model_all, GluN2B_model_ext, D2R_model y SRC_model presentan valores tanto de C-score (-0.20, 0.01, -0.97 y -1.90, respectivamente) como de TM-score (0.69, 0.71, 0.59 y 0.49, respectivamente) que hacen que los modelos sean tomados como modelos de buena calidad. Para el modelo GluN2B_model_int, el valor de C-score es el más negativo de todos los modelos, y el TM-score está por debajo de 0.5, indicando que el modelo no tiene un homólogo estructural con similitud cercana. En este sentido se debe mencionar que el modelo GluN2B_model_int, corresponde al dominio carboxi-terminal intracelular de la subunidad GluN2B y que para este tipo de dominios debido al alto grado de interacciones con otras proteínas en la densidad postsináptica hace que no tenga una topología estructural definida, si no que presente un alto grado de desorden intrínseco ^[39]. Asi que no se espera encontrar un homólogo estructural de alta similitud, sin embargo I-TASSER presenta un modelo que lo tomamos como modelo de referencia para el docking.
Era de esperar que los homólogos estructurales o estructuras de referencia (templates) que usó I-TASSER para generar los modelos fueran proteínas de familias cercanas, así el homólogo utilizado para los modelos GluN2B_model_all y GluN2B_model_ext es el receptor ionotrópico de glutamato AMPA con código PDB 3KG2 con una resolución de 3.60 Å ^[8], y que ha sido de hecho la estructura que se ha tomado como base para elucidar algunas de las funciones de este tipo de receptores de glutamato. Para el modelo SRC el homólogo estructural fue la estructura reportada para Homo sapiens con código PDB 2H8H con una resolución de 2.20 Å ^[40].
Adicional a los resultados de calidad de los modelos obtenidos mediante I-TASSER, se realizó la evaluación de las correspondencias estructurales a nivel de estructura secundaria usando los diagramas de Ramachandran, teniendo en cuenta que un modelo de muy buena calidad estereoquímica debe tener un 90% de residuos en las regiones más favorecidas estructuralmente (Hélices α dextrógiras y levógiras y hojas plegadas β ^[41], zonas rojas en los diagramas de Ramachandran utilizados en este trabajo).
Para el modelo que incluyó toda la secuencia de la subunidad GluN2B, el análisis arrojó que un 71.6% de los residuos se ubican en las regiones más favorecidas, indicando que no es un modelo de buena calidad, sin embargo, se debe recordar que en este modelo está presente el dominio carboxilo terminal intracelular (CTD) y que no se conoce alguna estructura de referencia para esta zona que permita generar un modelo con mejores resultados. En relación a las demás regiones de este mismo modelo se puede ver que el resultado obtenido tiene la topología estructural que se ha descrito para los receptores ionotrópicos de glutamato ^[4], que incluye los dominios amino terminal (ATD), de unión a ligando (LBD) y el dominio transmembranal (TMD). Los dominios ATD y LBD presentan la configuración que se asemeja a una concha formada principalmente por hélices α y permite la unión de moduladores y agonistas.
Al generar el modelo para la subunidad GluN2B descartando el dominio CTD (GluN2B_model_ext, Fig. 2), los resultados obtenidos muestran que hay un 86.7% de residuos ubicados en las regiones más favorecidas, haciendo de éste un modelo de mejor calidad. Igualmente presenta las mismas características topológicas descritas anteriormente para el modelo GluN2B_model_all. Y por supuesto para el modelo que contiene solo el dominio CTD de la subunidad GluN2B (GluN2B_model_int, Fig. 3) presenta alto grado de zonas irregulares y muy bajo contenido de hélices α y hojas β, con residuos ubicados en las regiones más favorecidas de solo el 62.2%.

Figura 2: Modelo del dominio extracelular de la subunidad GluN2B. A, Modelo tridimensional generado mediante I-TASSER para el dominio extracelular de GluN2B (GluN2B_model_ext). B, diagrama de Ramachandran. ATD (Dominio amino terminal), LBD (Dominio de unión a ligando), TMD (Dominio transmembrana). La representación (cintas) del modelo fue generado en UCSF CHIMERA.

Figura 3: Modelo del dominio intracelular de la subunidad GluN2B. A, Modelo tridimensional generado mediante I-TASSER para el dominio carboxilo intracelular de GluN2B (GluN2B_model_int). B, diagrama de Ramachandran. Se observa el alto grado de zonas irregulares. La representación (cintas) del modelo fue generado en UCSF CHIMERA.

Tomando juntos los anteriores resultados se puede decir que las estructuras predichas en este trabajo presentan topologías estructurales adecuadas para realizar las simulaciones de acoplamiento molecular "Docking". Por otro lado, para la proteína DAPK1 se seleccionó la estructura cristalográfica con código PDB 1IG1 con una resolución de 1.80 Å ^[33] para realizar los dockings.

Selección y evaluación de péptidos
La librería inicialmente obtenida (no mostrada) a partir de los péptidos mencionados en la tabla 2 fue filtrada teniendo en cuenta el parámetro GRAVY (grand average of hydropathy) el cual se calcula sumando los valores de hidrofobicidad de cada aminoácido y dividendo por la longitud de la secuencia ^[42].
Las mutaciones seleccionadas del proceso de filtrado por resultados de hidrofobicidad se presentan en la tabla 5 junto con los resultados obtenidos de la simulación de acoplamiento molecular "Docking". Los resultados de docking son principalmente expresados como la entalpía de unión, significando la cantidad de energía que el sistema consume para generar la unión, sin embargo dado que el sistema busca el favorecimiento de complejos energéticamente estables se libera energía más que consumirla, de modo que se esperan resultados de energía libre de unión negativos expresados en kcal/mol, y en el caso de Autodock Vina, estos resultados de energía de unión también corresponden a una medida indirecta de la afinidad del ligando por el receptor ^[35].

Tabla 5: Resultados de Docking de los péptidos control y péptidos mutados. En verde se indica la mutación correspondiente para cada péptido.

De los resultados de docking se seleccionaron 15 péptidos (Tabla 6) teniendo en cuenta los mejores resultados de energía libre de unión por cada interacción péptido-receptor.

Tabla 6: Resultados de los Dockings de los péptidos seleccionados. En verde aparecen las mutaciones realizadas. Se incluye los péptidos control (#1, #6 y #11) y los péptidos scramble (#5, #10 y #15). Se observa que el valor de energía libre de unión es mayor para los péptidos con las mutaciones que los péptidos control.

Interacciones de los Péptidos GluN2B con DAPK1
Para el péptido #1, KKNRNKLRRQHSY (péptido control), la energía de unión fue de -5.9 kcal/mol, la interacción entre la proteína DAPK1 y el ligando se estabiliza por la formación de 9 puentes de hidrógeno en el sitio catalítico de DAPK1, es de resaltar el puente de hidrógeno formado entre la Phe 24 de DAPK1 y la Leu 7 del péptido. Dicha Phe hace parte de los aminoácidos involucrados en la actividad de DAPK1, y como se observa en la fig. 4, el péptido estaría bloqueando el acceso al sitio catalítico y de esta forma podría impedir la actividad de DAPK1 para fosforilar la Ser 1303 de GluN2B. Los péptidos #2 (-7.6 kcal/ mol), #3 (-7.3 kcal/mol) y #4 (-7.2 kcal/mol), corresponden a las mutaciones realizadas sobre el péptido #1 (-5.9 kcal/ mol) y teniendo en cuenta los resultados de docking, estos péptidos mutados tendrían mayor interacción en el sitio catalítico de DAPK1. La mutación más favorable fue el reemplazo de la Leu 7 por Val (L7V, péptido #2) aquí la Val está formando una interacción de tipo hidrofóbico (Pi-alkyl) con la Phe 24 de DAPK1, adicionalmente el péptido #2 se estabiliza por la formación de 14 puentes de hidrógeno y otro tipo de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. La representación de superficie molecular (figura 4C) permite ver que el péptido #2 se acopla a lo largo del sitio catalítico de DAPK1 justo en la interface del ATP y la unión a GluN2B, y por tanto se predice que puede bloquear la función de esta quinasa.

Figura 4: Docking péptido #1. A y B, Docking del péptido #1 en el sitio catalítico (recuadro azul) de la estructura de DAPK1. C y D, representación de la superficie molecular del péptido (ligando) y del receptor (DAPK1) y el péptido respectivamente. E, aminoácidos de DAPK1 (representación en color azul y etiqueta negra) que están formando puentes de hidrógeno (líneas verdes) con el péptido #1 (representación en color beige y etiqueta magenta).

Interacciones de los Péptidos D2R con GluN2B
Los péptidos derivados de la interacción D2R-GluN2B, y denotados como péptidos D2R (D2Rp) tienen una longitud de 10 aminoácidos, todos son hidrófobos y presentan caracter básico. Estos péptidos son los #6, #7, #8 y #9, y cuyo blanco es la Ser 1303 ubicada en el dominio carboxilo terminal intracelular de GluN2B, residuo que resulta ser blanco de fosforilación ^[24] e interviene en la modulación de la actividad del receptor NMDA. Los resultados de docking (Tabla 6) permiten ver que la mutación que presenta mayor afinidad de unión es el reemplazo de la Ala 7 por Val (A7V, péptido #9, -7.4 kcal/mol), éste péptido se une a GluN2B principalmente por medio de 5 puentes de hidrógeno de los cuales la Thr 1 del péptido #9 está uniéndose a la Ser 1303 (Fig. 5), adicionalmente el péptido se estabiliza por un puente salino entre la Lys 2 del péptido y el residuo de Glu 1313 de GluN2B. Los gráficos de superficie molecular (fig. 5C) de los demás péptidos de este grupo muestran el acople de cada uno de ellos entorno a la Ser 1303, de forma que se puede sugerir que estos péptidos se pueden comportar como péptidos bloqueadores de proteínas con blanco Ser 1303.

Figura 5: Docking péptido #9. A y B, Docking del péptido #9 en el dominio carboxilo terminal intracelular de GluN2B (Ser 1303, recuadro azul). C y D, representación de la superficie molecular del péptido (ligando) y del receptor (GluN2B) y el péptido respectivamente. E, aminoácidos de GluN2B (representación en color azul y etiqueta negra) que están formando puentes de hidrógeno (líneas verdes) con el péptido #9 (representación en color beige y etiqueta magenta).

Interacciones de los Péptidos SRC con GluN2B
En cuanto a los péptidos derivados de la interacción SRC-GluN2B, el péptido que mejor presenta interacción en términos de la afinidad de unión es el péptido #13 (A13D, -7.2 kcal/mol), aquí la formación de 9 puentes de hidrógeno estabilizan la interacción péptido-proteína (Fig. 6), siendo el péptido que presenta mayor número de interacciones de tipo enlazante para esta clase de péptidos SRC. Por su parte la Tyr 1472 de la subunidad GluN2B, que es el blanco para este grupo de péptidos, está formando una interacción de tipo hidrofóbico (pi-alkyl) con la Pro 10 del péptido #13, permitiendo que el resto de péptido este entorno de la Tyr 1472 y como se ha descrito en apartados anteriores, se espera que estos péptidos #11, #12, #13 y #14, tengan un papel como péptidos bloqueadores.

Figura 6: Docking péptido #13. A y B, Docking del péptido #13 en el dominio carboxilo terminal intracelular de GluN2B (Tyr 1472, recuadro azul). C y D, representación de la superficie molecular del péptido (ligando) y del receptor (GluN2B) y el péptido respectivamente. E, aminoácidos de GluN2B (representación en color azul y etiqueta negra) que están formando puentes de hidrógeno (líneas verdes) con el péptido #13 (representación en color beige y etiqueta magenta).

Conclusiones

Las interacciones de GluN2B con DAPK1, SRC y D2R permitieron generar péptidos que podrían ser usados como agentes terapéuticos en procesos patológicos como la isquemia. Sin embargo, es necesario contemplar el uso de agentes que permiten la internalización de los péptidos, como por ejemplo el TAT 47-57 (Péptido Transactivador de la transcripción derivado del virus del VIH) que tiene la capacidad de permear la membrana comportándose como molécula cargo, aunque el mecanismo no está bien conocido todavía ^{[21, 43-45]}, sin afectar la interacción del péptido diseñado con su blanco.
Los péptidos diseñados muestran interacciones con su receptor específico que podrían llegar a generar una modulación del mismo en ensayos in vivo.

Agradecimientos

A Colciencias por financiar el proyecto: Diseño de péptidos basados en la interacción de GLUN2B con DAPK1, SRC, D2R y Conantokina G y evaluación in vitro de su posible efecto neuroprotector en eventos isquémicos, código 110156933188. A los Doctores Fernando Danilo González Nilo y Daniel Aguayo de la Universidad Andrés Bello (Chile) por la asesoría y colaboración en el manejo de herramientas de diseño molecular. A la Universidad Nacional de Colombia por el apoyo recibido para el desarrollo de este proyecto.

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Recibido: 08/06/2016.
Aprobado: 29/11/2016.