INGENIERÍA, TECNOLOGÍA E INFORMÁTICA

Conservacion in vitro de te a corto/mediano plazo en Argentina

 

Sandra P. Molina^1,*, Luis A. Mroginski², Hebe Y. Rey²

¹ Equipo de Yerba Mate y Te, EEA Cerro Azul (CR Misiones) – INTA. Ruta Nacional 14, km 1085. Cerro Azul, Misiones;
² Facultad de Ciencias Agrarias – IBONE (UNNE-CONICET). Sargento Cabral 2131. Corrientes.
* E-mail: molina.sandra@inta.gob.ar

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Resumen

El presente trabajo se realizo con el objetivo de evaluar metodologias para la conservacion in vitro a corto plazo de germoplasma de te. Se utilizo el clon CH 14 INTA perteneciente al programa de mejoramiento de la EEA Cerro Azul – INTA. Se evaluaron dos metodos de conservacion a corto/mediano plazo (bajas temperaturas y medios minimos). Las bajas temperaturas permitieron la conservacion de segmentos nodales y yemas axilares hasta un periodo de 5 meses, con 73% y 67% de supervivencia, respectivamente. El uso de medios minimos tuvo como resultado una respuesta similar, en terminos de supervivencia, con valores de entre 60 y 90%, hasta los 120 dias. Los resultados de este trabajo permiten concluir que es posible la conservacion de germoplasma de te, a corto/mediano plazo.

Palabras clave: Germoplasma; Camellia sinensis; Bajas temperaturas; Medios minimos; Explantes.

Abstract

This work was done to evaluate methodologies for germplasm in vitro preservation of tea. A Clone CH 14 INTA of breeding program of the EEA Cerro Azul – INTA was used. Two methods of short/medium term storage (low temperatures and suboptimal media) were evaluated. Low temperatures allowed the conservation of nodal segments and axillary buds -up to 5 months, with 73% and 67% survival, respectively. The use of suboptimal media had a similar response, with survival between 60 and 90% up to 120 days. In summary, it is possible to use short/ medium term conservation with germplasm tea.

Keywords: Germplasm; Camellia sinensis; Low temperature; Slow growth media; Explants.

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Introduccion

La seguridad de las colecciones requiere su conservación por varias técnicas. Un gran número de especies producen semillas ortodoxas, las que pueden ser almacenadas en forma deshidratada en bancos de semillas a bajas temperaturas. Pero hay muchas especies que producen semillas recalcitrantes o intermedias las cuales son incapaces de sobrevivir a la deshidratación y son sensibles a las bajas temperaturas ⁽¹⁾. El método tradicional para la conservación de especies con semillas recalcitrantes y propagadas vegetativamente es a campo ^{(2, 3, 4 y 5)}. Esto presenta varios problemas incluyendo la exposición a pérdida de material por factores bióticos (plagas, enfermedades) y abióticos (inclemencias climáticas), sumado a elevados costos de mantenimiento ^{(6, 1, 7 y 3)}.
El cultivo in vitro resulta en una alternativa viable para la conservación genética de especies para las cuales el banco de semillas no es posible ^{(8 y 7)}. El cultivo in vitro no sólo provee un método para la propagación clonal y el intercambio seguro de material vegetal sino que también es usado para la conservación de germoplasma a mediano plazo ^{(9, 10 y 11)}. Sin embargo, el mantenimiento de grandes colecciones en sistemas de cultivo in vitro convencional requiere de subcultivos sucesivos a intervalos de tiempo regulares, exponiendo al material a riesgos de contaminación y variación somaclonal ⁽¹²⁾. Una manera de disminuir estos problemas es a través de la conservación a corto o mediano plazo, que logra espaciar los tiempos de los subcultivos. El almacenamiento a baja temperatura de germoplasma producido in vitro es una alternativa para la preservación de una variedad de especies vegetales ^{(13, 14, 15, 7 y 5)}.
En la mayoría de los casos, la baja temperatura en combinación con baja intensidad de luz o completa oscuridad, es usada para limitar el crecimiento ^{(16, 17, 18 y 5)}. Las mayores ventajas de esta técnica son los requerimientos reducidos en labor y espacio, la eliminación de problemas relacionados a patógenos y la reducción de la erosión genética si las condiciones de almacenamiento son logradas ⁽¹²⁾. También es posible limitar el crecimiento por alteración del medio de cultivo, principalmente por reducción del contenido de azúcar o concentración de los elementos minerales, aplicación de ácido absícico y reducción del nivel de oxígeno ^{(12, 9, 10, 19, 2 y 7)}. La técnica de conservación bajo condiciones de crecimiento mínimo ha sido desarrollada para varias especies: Manihot esculenta Cratz ⁽²⁰⁾, Castanea sativa x C. chestnut y Quercus spp. ⁽²¹⁾, Dioscorea spp. ⁽¹⁹⁾, Asparagus officinalis ⁽¹⁵⁾ y Fragaria vesca L. ⁽¹⁸⁾. Hasta el momento, no existen antecedentes de conservación in vitro a corto/mediano plazo en té (Camellia sinensis). En el presente trabajo, las dos metodologías analizadas tienen como objetivo evaluar la aptitud del té para esta alternativa de conservación.

Material y Metodos

Se utilizaron como explantes segmentos nodales (con una longitud entre 0,5 y 1,0 cm), yemas axilares y meristemas caulinares (0,5 mm de longitud). Ellos fueron obtenidos de plantas madre del clon CH 14 INTA (Programa de Mejoramiento – EEA Cerro Azul – INTA) mantenidas en invernáculo, bajo un estricto control sanitario y nutricional. La desinfección de los brotes se realizó por inmersión en etanol 70% durante 1 min seguida de una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) 1,5% durante 20 minutos y 3 enjuagues sucesivos con abundante agua destilada estéril. Los explantes desinfectados fueron cultivados en tubos de vidrio (25 mm x 120 mm; 40 ml de capacidad) conteniendo 10 ml de medio de cultivo solidificado con 0,7% de agar Sigma (A-1296). Para la conservación a baja temperatura, el medio consistió en las sales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962) ⁽²²⁾, reducido a la mitad (½ MS) con 3% de sacarosa y 0,7% de agar Sigma (A-1296).
La suplementación se realizó con 1,0 mgL-1 de 6-bencilaminopurina (BAP). Para la conservación en medios mínimos, los segmentos nodales fueron cultivados en 4 medios de cultivo consistentes de ½ MS o ¼ MS, con 3% de sacarosa y 0,7% de agar Sigma (A-1296). Estos medios estuvieron desprovistos de reguladores de crecimiento o fueron suplementados con 0,01 mgL-1 de BAP. En todos los casos, el pH del medio fue ajustado a 5.8 con hidróxido de potasio (KOH) o ácido clorhídrico (HCl), antes del agregado del agar y luego esterilizado en autoclave a 121º C por 15 minutos.
El cultivo a baja temperatura se realizó en heladera (4º C), en oscuridad, durante distintos períodos de tiempo (0, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 días). Luego de cada tratamiento, los tubos fueron transferidos a un cuarto climatizado a 25 ± 2º C bajo un fotoperíodo de 16/8 h de luz/oscuridad con una irradiación de 116 μmol.m-2.s-1 provista por lámparas fluorescentes frías. Finalmente, luego de 30 días en estas condiciones se registraron las siguientes variables: porcentaje de supervivencia, porcentaje de formación de vástagos y longitud de vástagos. El cultivo en medios mínimos fue realizado en un cuarto climatizado a 25 ± 2º C, en oscuridad durante 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 días. Al cabo de cada período se registró el porcentaje de supervivencia, porcentaje de formación de vástagos y longitud de vástagos.
Los experimentos fueron conducidos con un diseño de bloques completos al azar. Cada tratamiento fue repetido 3 veces, con 10 réplicas por repetición y 1 explante/tubo. Las figuras muestran los resultados promedios con el error estándar (± SE). Los datos se analizaron mediante el análisis de la variancia (ANOVA) y las comparaciones de las medias fueron hechas usando el test de Tukey.

Resultados y Discusión

Conservacion a baja temperatura
Existen referencias de la utilización de bajas temperaturas para la conservación in vitro en numerosas especies: Solanum spp. ⁽¹³⁾, cereza silvestre, castaño y roble ⁽²¹⁾, Asparagus officinalis ⁽¹⁵⁾, Pyrus sp. ⁽²³⁾. En el presente trabajo, con la conservación a baja temperatura (4º C) se obtuvieron los mejores resultados, en términos de sobrevivencia y formación de vástagos, cuando se utilizaron segmentos nodales y yemas axilares como explante. En cambio, con el uso de meristemas los valores de estos parámetros fueron significativamente más bajos. Los segmentos nodales de té lograron una elevada supervivencia (entre 97 y 73%) hasta los 5 meses de conservación a bajas temperaturas, momento a partir del cual disminuye drásticamente, llegando a valores aproximados al 10%. Un comportamiento similar se observó con el uso de yemas axilares como explante (Tabla 1).

Tabla 1: Supervivencia promedio (%) de segmentos nodales, meristemas y yemas axilares de te conservados a baja temperatura (4o C), durante diferentes periodos de tiempo. (Letras distintas en sentido de las columnas indican diferencias significativas para p<0,05).

Si bien no existen diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de sobrevivencia hasta los 150 días, se observa una disminución progresiva a medida que el período de almacenamiento aumenta. Resultados similares fueron encontrados por Ahmed et al. (2010) ⁽²³⁾ en la conservación de germoplasma de Pyrus. En el presente trabajo, un mayor tiempo de exposición provocó el amarronamiento y posterior muerte de los explantes. Según Janeiro et al. (1995) ⁽²¹⁾, la necrosis de los explantes es común cuando se realiza el almacenamiento a baja temperatura, pero aparentemente los explantes necróticos podrían sobrevivir un ciclo de sub-cultivo en cámara de crecimiento bajo condiciones normales, donde algunos cultivos marrones pueden proliferar, especialmente desde yemas laterales que permanecen inmersas en el agar. Janeiro et al. (1995) (21), trabajando con castaño, encontraron que el porcentaje de supervivencia disminuyó dramáticamente a 42 y 29% después de 6 y 12 meses de conservación a baja temperatura (2 ± 1º C). Respecto a la variable formación de vástagos, se observó en general el mismo comportamiento con los tres explantes utilizados. Los valores más altos correspondieron al testigo y a períodos de conservación más cortos. A medida que aumentó el tiempo de conservación a baja temperatura, disminuyó la formación de vástagos (Tabla 2). Los segmentos nodales presentaron los mayores porcentajes de formación de vástagos, seguidos por las yemas axilares, siendo los meristemas los explantes con menor capacidad de regenerar, luego de la conservación a baja temperatura.

Tabla 2: Formacion de vastagos promedio (%) de segmentos nodales, meristemas y yemas axilares de te conservados a baja temperatura (4o C), durante diferentes periodos de tiempo. (Letras distintas en sentido de las columnas indican diferencias significativas para p<0,05).

Para la variable longitud de vástagos, no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los distintos tratamientos. Sólo se observó una mayor longitud de vástagos cuando se utilizaron segmentos nodales como explante (Tabla 3). En general, los vástagos no presentaron necrosis ni amarronamiento (Fig. 1).

Tabla 3: Longitud promedio de vastagos formados a partir de segmentos nodales, meristemas y yemas axilares de te, conservados a baja temperatura (4o C), durante diferentes periodos de tiempo. (Letras distintas en sentido de las columnas indican diferencias significativas para p<0,05).

Figura 1: Vastagos formados en segmentos nodales de te, conservados a baja temperatura (4o C), durante diferentes periodos de tiempo: a) 30 dias, b) 60 dias, c) 90 dias, d) 120 dias, e) 150 dias y f) 180 dias. (Las barras verticales indican 1,0 cm).

Conservacion en medios minimos

El uso de bajas concentraciones de elementos minerales o de sacarosa en el medio de cultivo, es usado con éxito en el mantenimiento de colecciones in vitro de algunas especies, por ejemplo Dioscorea spp. ⁽¹⁹⁾ y Lilium sp. ⁽²⁴⁾. En el presente trabajo, el uso de medios mínimos para la conservación de segmentos nodales no tuvo la misma respuesta, en términos de supervivencia, que la baja temperatura. La modificación en la concentración de las sales del medio de cultivo y/o el regulador de crecimiento permitió una supervivencia relativamente alta (60-90%) hasta los 120 días. En general, hasta los 120 días no se registraron diferencias significativas entre los distintos medios de cultivo. Estas diferencias se registraron recién cuando el período de conservación se extendió a 150-180 días (Fig. 2).

Figura 2: Supervivencia promedio (%) de segmentos nodales de te, conservados en medios minimos, durante diferentes periodos de tiempo en oscuridad. (La barra vertical representa el error estandar).

La oscuridad produjo la aparición de clorosis que se hizo más evidente a medida que aumentó la duración del período de conservación. Esta sintomatología fue observada principalmente en el medio constituido por ½ MS sin BAP. Problemas de clorosis fueron también observados por Janeiro et al. (1995) ⁽²¹⁾ en la conservación de cereza silvestre a baja temperatura y por Corredoira et al. (2011) ⁽²⁵⁾ en Camellia sp. y otras especies. El mayor tiempo de exposición a la oscuridad provocó además el crecimiento de los vástagos (mayor longitud de entrenudos) generados a partir de los explantes. La mayor longitud de vástagos se registró en los medios de cultivo que carecían de BAP (Fig. 3).

Figura 3: Longitud promedio de vastagos generados a partir de segmentos nodales de te, conservados en medios minimos, durante diferentes periodos de tiempo en oscuridad. (La barra vertical representa el error estandar).

Conclusiones

Los resultados de este trabajo permiten concluir que es posible la conservación de germoplasma de té, a corto/ mediano plazo. La conservación de cultivares de té a corto plazo, mediante la reducción de temperatura, es posible hasta 150 días con porcentajes de supervivencia relativamente altos. Los segmentos nodales y yemas axilares fueron los explantes con mejores respuestas.
En el caso de la utilización de medios mínimos, se podría conservar germoplasma de té hasta 120 días, sin que la capacidad de regeneración se vea afectada.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), a través del Proyecto Específico “Manejo Integrado y Gestión Ambiental de Cultivos Industriales”, perteneciente al Programa Nacional de Cultivos Industriales.

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Recibido: 04/08/2016.
Aprobado: 10/08/2017.