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Revista de Ciencia y Tecnología

On-line version ISSN 1851-7587

Rev. cienc. tecnol.  no.30 Posadas Dec. 2018

 

Ingeniería, Tecnología e Informática

Actividad Antibacteriana in vitro de extractos Hidroalcohólicos secos de Yerba Mate elaborada procedente de Paraguay

In vitro Antibacterial activity of dry hydroalcoholic extracts of elaborated Yerba Mate produced in Paraguay

 

Johana C. González Coria1*, Marta A. Horianski2

1- Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad Nacional de Itapúa,Abog. Lorenzo Zacarías López 255 y Ruta 1, Encarnación, Paraguay. 2- Laboratorio de Microbiología, Módulo de Bioquímica y Farmacia, Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones,Av Mariano Moreno Nº 1375, Posadas, Misiones, Argentina.

* E-mail: joha160990@gmail.com


Resumen

Yerba mate (llex paraguariensis St. Hil.) es una especie vegetal con propiedades nutricionales y medicinales, de cuyas hojas secas trituradas se preparan infusiones. Se evaluó la actividad antibacteriana de extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada, sobre bacterias de importancia en alimentos (Escheríchia coli, Salmonella Enteritidis, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus), por métodos de difusión en agar. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM). Se realizó un análisis fitoquímico preliminar y se cuantificó el contenido de polifenoles totales. Staphylococcus aureus y Salmonella Enteritidis fueron inhibidas por los extractos. El extracto hidroetanólico (60:40) mostró mayor capacidad inhibitoria. Staphylococcus aureus presentó mayor tamaño de halo de inhibición con CIM/CBM de 0,78/0,78 mg/mL. Se halló la presencia de taninos, flavonoides, saponinas y un contenido de polifenoles totales de 24,47 g EAG/100 g de muestra seca. Los extractos obtenidos podrían utilizarse como potenciales conservantes naturales en alimentos.

Palabras clave: Yerba mate; Actividad antibacteriana; Extractos hidroalcohólicos; Fitoquímicos; Polifenoles totales.

Abstract

Yerba mate (llex paraguariensis) is a plant species with diverse nutritional and medicinal properties, whose crushed dried leaves are made into infusions. The antibacterial activity of dried hydroalcoholic extracts of yerba mate elaborated on bacteria of importance in food has been evaluated (Escheríchia coli, Salmonella Enteritidis, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus) by agar diffusion methods. The minimum inhibitory concentration and the minimum bactericidal concentration have been determined. Preliminary phytochemical analysis has been made and total polyphenols have been quantified. Staphylococcus aureus and Salmonella Enteritidis were inhibited by the extracts. The hydroethanolic extract (60:40) has shown greater inhibitory capacity. Staphylococcus aureus presented a greater inhibition halo size with MIC/MBC of 0.78/0.78 mg/mL. The presence of tannins, flavonoids, saponins and a total polyphenol content of 24.47 g EAG/100 g dry sample have been found. The extracts obtained could be used as potential natural preservatives in foods.

Keywords: Yerba mate; Antibacterial activity; Hydroalcoholic extracts; Phytochemicals; Total polyphenols.


 

Introducción

La industria alimentaria busca obtener alimentos con buena calidad, que conserven todas sus características nutricionales y organolépticas además de ser inocuos. Los alimentos al ser expuestos a diversos agentes pueden perder su inocuidad. Los agentes pueden ser físicos, químicos o biológicos (1). La ingestión de alimentos y/o agua que contienen agentes etiológicos, en cantidades tales, que

afectan la salud del consumidor pueden producir enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Para prevenir las ETA, es necesaria la adición de conservantes a los alimentos (2).

En los últimos años ha aumentado mundialmente la demanda de conservantes naturales en las industrias alimentarias para reemplazar los conservantes sintéticos (3). Los compuestos vegetales bioactivos son una fuente potencial de nuevas formulaciones antimicrobianas debido a los compuestos fitoquímicos que éstos presentan (4). Según Burris et al., 2011(3), la yerba mate podría ser utilizada como un potencial agente antimicrobiano en alimentos y bebidas.

La yerba mate, denominada científicamente como Ilex paraguariensis A. Saint Hilaire, es una especie vegetal procedente de Brasil, Argentina y Paraguay. La norma paraguaya NP 3500193 del Instituto Nacional de Tecnología, Normalización y Metrología (INTN) define a la yerba mate elaborada como el producto formado por las hojas desecadas y ligeramente tostadas, desmenuzadas de Ilex paraguariensis A. St Hil (Aquifoliaceae), que pueden estar mezcladas o no con fragmentos de ramas jóvenes, pecíolos, pedúnculos forales y semillas de la misma (5). La yerba mate elaborada se utiliza para preparar infusiones conocidas regionalmente como mate y tereré, que se realizan con agua caliente y fría, respectivamente, además de mate cocido e infusión de té (6). El empleo de yerba mate como ingrediente en alimentos y en suplementos dietéticos; y como bebida energizante natural ha aumentado en gran medida en Estados Unidos, Europa y Oriente Medio (7). La yerba mate resulta de gran interés por su alto contenido de fitoquímicos tales como metilxantinas, saponinas y en particular los polifenoles, éstos últimos muy conocidos por sus actividades biológicas (8).

Para la extracción y la purificación de los compuestos beneficiosos presentes en la yerba mate se han empleado varios métodos que pueden ser utilizados en la industria (9). La sonicación facilita la extracción de los compuestos bioactivos del material vegetal debido al uso de ondas de una frecuencia determinada (10), mientras que, la mace-ración es un método fisicoquímico que permite extraer principalmente compuestos polifenólicos (11).

Se han realizado investigaciones relativamente limitadas del empleo de extractos de hojas de yerba mate como potencial agente antimicrobiano en productos alimenticios. Pese a que se conocen muchos de los compuestos bioactivos presentes en extractos de yerba mate, no se han establecido por completo los compuestos que contribuyen a la actividad antimicrobiana y sus posibles efectos combinados, antagónicos o sinérgicos. Las investigaciones se limitan aún más en la yerba mate elaborada (12).

Investigaciones científicas realizadas por Girolometto et al., 2009 (13), Prado Martín et al., 2013 (14) y Rempe et al., 2015 (4) han demostrado actividad antimicrobiana de extractos etanólicos, metanólicos y acuosos de yerba mate sobre patógenos alimentarios.

Se han empleado extractos de plantas como conservantes naturales de alimentos, sin embargo, estos presentan un efecto sensorial negativo debido a que aportan sabores y olores indeseables a los alimentos. La yerba mate característicamente presenta sabor amargo, ácido, astringente con notas a heno, hierba verde y húmeda. Si bien, estos términos le confieren características negativas a lo que se está buscando, en un estudio realizado por Racanicci et al., 2009(15), en albóndigas de pollo precocidas, en las que incorporó yerba mate como antioxidante, no se observó efecto negativo en el sabor ni en el olor del producto alimenticio. En otro estudio realizado por Beal et al., 2011(16), donde se emplearon extractos de hojas de yerba mate como antioxidante natural en salchichas de tipo italiano, las características sensoriales de sabor y de textura no fueron afectadas. Estos estudios indican su posible aceptación sensorial cuando es empleada como un aditivo en los alimentos.

El objetivo principal del trabajo fue evaluar la actividad antibacteriana in vitro de extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada procedente de Paraguay sobre bacterias de importancia en alimentos, con el propósito de evaluar su posible utilidad como bioconservante de alimentos y de bebidas, debido a la creciente necesidad de la industria alimentaria de satisfacer la demanda por alimentos saludables y libres de aditivos sintéticos. El uso de la misma presentaría claras ventajas desde el punto de vista nutritivo y toxicológico. Paraguay no cuenta con estudios realizados sobre la actividad antimicrobiana de la yerba mate elaborada producida a nivel nacional.

Materiales y Métodos

Las muestras de yerba mate elaborada fueron obtenidas de locales comerciales de la ciudad de Encarnación, Paraguay. Se utilizaron 5 marcas comerciales de yerba mate elaborada envasadas en sus paquetes tradicionales de 1 Kg (Yerba mate Colon®, Cooperativa Colonias Unidas; Yerba mate Pajarito®, Lauro Raatz S.A.; Yerba mate Campesino®, Yerbatera campesino, Grupo A. J. Vierci; Yerba mate Indega®, Indega S.A. y Yerba mate Selecta®, Grupo Selecta), procedentes de establecimientos yerbateros ubicados en el departamento de Itapúa, Paraguay. Estas fueron mezcladas y homogeneizadas, con el fin de disminuir el margen de variación que se podría producir en la composición química de la muestra, debido a posibles diferencias en el procesamiento.

Obtención de los extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada

Para la preparación de los extractos, se trabajó con una alícuota de 2.500 g de yerba mate molida y tamizada (molino, modelo FW 100, Chincan®, China, tamiz de malla Nº 40 con apertura de 420 µ, tamizador Zonytest®, Argentina), procedente de la mezcla de las 5 marcas de yerba mate elaborada. Como solvente de extracción se emplearon mezclas hidroalcohólicas de metanol: agua y etanol: agua en proporciones 70:30 y 60:40 (Biopack®, Argentina). La relación sólido (yerba mate): solvente de extracción fue de 1:5 (p/v). Se prepararon 4 extractos, de acuerdo a un diseño experimental completo 22, con el objeto de evaluar el efecto del tipo de solvente y proporción hidroalcohólica en las determinaciones realizadas. Los extractos preparados fueron: extracto 1 (metanol: agua; 60:40), extracto 2 (etanol: agua; 60:40), extracto 3 (meta-nol: agua; 70:30) y extracto 4 (etanol: agua; 70:30). Para la extracción se empleó una combinación de los métodos de maceración y de sonicación. La maceración se realizó durante 24 h a 40º C en estufa de aire a convección natural (Dalvo Instrumentos®, modelo MCZ-2, Argentina). La-sonicaciónse llevó a cabo a 25° C utilizando un sonicador (Baño de ultrasonido modelo UC-150, Stoord®, Argentina) con una frecuencia de 50 Hz, una potencia ultrasónica de 150 W y una frecuencia de trabajo de 40 KHz, con el fin de favorecer la extracción; los extractos fueron sometidos a las ondas de ultrasonido en 3 ciclos de media hora con intervalos de 10 minutos. Luego, se fltraron por el método de fltración al vacío utilizando embudo de büchner y papel de fltro Whatman cualitativo Nº 3. El rendimiento de los extractos se determinó luego del fltrado, para ello, 10 mL de los extractos fuidos obtenidos se colocaron en pesafltros y se llevaron a estufa de aire a convección natural a una temperatura de 50 ± 2º C (Dalvo Instrumentos®, modelo MCZ-2, Argentina), hasta pesada constante. Se calculó el rendimiento porcentual (% R) de cada extracto utilizando la siguiente ecuaciónempleada por Carrillo et al., 2011 (17).

Peso extracto seco

% Rx 100

Peso muestra seca

Para concentrar los extractos y disminuir el tiempo de secado, se procedió a evaporar los solventes utilizando un rotavapor (modelo R 206B, Senco®, China) a 50º C, convelocidad de rotación de 90 rpm y presión negativa de acuerdo a la Farmacopea Argentina (2013) (18). Los extractos concentrados se secaron en estufa de aire a convección natural a 50 ± 2º C (Dalvo Instrumentos®, modelo MCZ-2, Argentina) hasta obtención de un extracto seco. Luego, se molieron y almacenaron en heladera (Consul®, Brasil) a 4º C en frascos color caramelo previamente esterilizados.

Ensayos de la actividad antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos secos por métodos de difusión en agar

Con los 4 extractos secos obtenidos se realizaron soluciones de trabajo (ST). Estas se prepararon disolviendo el extracto seco en 9 mL de agua destilada estéril y 1 mL del solvente de extracción utilizado en la preparación de cada extracto. Se trabajaron con cuatro concentraciones diferentes de ST para cada extracto: 250 mg/mL, 200 mg/ mL, 100 mg/mL y 50 mg/mL.

Para el estudio de la actividad antimicrobiana de los extractos, se empleó el método de difusión en agar con discos estandarizado recomendado por el Clinical La-borator y StandardsInstitute (CLSI)(19) y el método de difusión en agar por pocillos descripto por Prado Martin et al., 2013 (14) con modificaciones. Para ambos métodos, se empleó el medio de cultivo agar Müeller Hinton (MH) (Laboratorios Britania®, Argentina). Las cepas estudiadas fueron: Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella Enteritidiscepa salvaje, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Staphylococcus aureus cepa salvaje y (ATCC 25923). Estas fueron cedidas gentilmente por el cepario de la cátedra de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Ciencias Exactas Química y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones.

La preparación del inóculo se realizó a partir de un cultivo de las bacterias en estudio, de 18 – 24 h de incubación a 35 ± 2º C (San Jor®, modelo SL60C, Argentina), en agar nutritivo (Laboratorios Britania®, Argentina). Se preparó una suspensión de colonias aisladas en 5 mL de solución fsiológica estéril hasta obtener una turbidez equivalente a 0,5 de la escala de McFarland (1-2 x 108 Ufic/mL). Se efectuó la siembra en la superficie del agar MH con hisopo estéril.

Para el método de difusión con discos, se prepararon discos de papel de filtro Whatman Nº 3, de 6 mm de diámetro. Estos se esterilizaron en autoclave (tipo Cham-berlandmodelo VZ 100, carga superior, alimentación a gas, Argentina). Los discos fueron cargados con 40 µL de las diferentes concentraciones de ST de los extractoshidroal-cohólicos secos de yerba mate elaborada (Tabla 1) y luego fueron secados en estufa a 35 ± 2º C (San Jor®, modelo SL60C, Argentina).

Tabla 1: Cantidades de los extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada en los discos de papel de fltro.

Concentracion del

extracto en la solución

de trabajo (mg/mL)

Volumen cargado en el disco (µL)

Cantidad de

extracto en el

disco (mg)

50

40

2

100

40

4

200

40

8

250

40

10

Como control negativo se emplearon discos cargados con 40 µL del solvente utilizado para la preparación de la ST.

Para el método de difusión por pocillos, se realizaron pocillos en el agar con un sacabocados de 6 mm de diámetro y se agregaron en cada pocillo 40 µL de las ST de los extractos secos de yerba mate. Como control negativo se empleó 40 µL del solvente utilizado para la preparación de la ST. Como control positivo,para ambos métodos, se emplearon discos de ampicilina (10 µg, Bio-Rad®, Estados Unidos) y cefitazidima (30 µg, Bio-Rad®, Estados Unidos) para E. coli, S. aureus y S. Enteritidis y discos deimipenem (10 µg, Laboratorios Britania®, Argentina) para P. aeru-ginosa.Todas las placas se incubaron en estufa a 35 ± 2º C durante 18-24 h. Los ensayos se realizaron por duplicado.

Para la interpretación de los resultados se tuvo en cuenta la formación o la ausencia de halo de inhibición de crecimiento. La lectura se realizó midiendo el diámetro del halo de inhibición de crecimiento en milímetros. La ausencia de halo de inhibición de crecimiento se registró igual a 6 mm, que corresponde al tamaño del disco o pocillo. Se calculó el porcentaje del efecto de inhibición de crecimiento (% EI) respecto al control positivo, utilizando la siguiente fórmula empleada por Martínez et al., 1997 (20):

X diámetro halo inhibición del extracto

% EI x 100

X diámetro halo inhibición control positivo

Donde: = Promedio de dos lecturas Para realizar los cálculos, se utilizó el menor valor del halo de inhibición de crecimiento del control positivo.

Concentración inhibitoria mínima y concentración bactericida mínima

El método empleado para la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) fue el de microdilución en caldo siguiendo las indicaciones de la metodología descrita en el documento M07-A9 del manual del CLSI (21).

Para la realización de la CIM se seleccionaron los extractos que evidenciaron mayor actividad inhibitoria en los métodos de difusión en agar. Se realizaron diluciones seriadas en caldo MH de concentración al doble de la final deseada, en tubos de ensayo, de los extractos secos 1,metanol:agua (60:40) y 2, etanol:agua (60:40) para la obtención de diluciones finales de 50 mg/mL hasta 0,049 mg/mL. Posteriormente, se tomaron 50 µL de las diluciones de los extractos y se colocaron en los pocillos de las microplacas estériles de 96 pocillos. Luego, se agregaron 50 µL del inóculo bacteriano de 1x106 Ufic/mL para lograr un inóculo final de 5x105 Ufic/mL. Los ensayos fueron realizados por triplicado. Para control de crecimiento se utilizó caldo MH más el microorganismo en estudio. Como control negativo se utilizó caldo MH y como control positivo se empleó cefotaxima (2 µg/mL, Laboratorios Lasca®, Paraguay). Para el control de extracto se utilizó la dilución del extracto de 50 mg/mL. Posteriormente, se incubaron durante 24 h a una temperatura de 35 ± 2º C (San Jor®, modelo SL60C, Argentina).

Para la lectura de los resultados fue utilizado el parámetro de cambio de color obtenida por un test colorimétrico utilizando el colorante resazurina siguiendo la metodología descrita por Da Costa Borges, 2016 (22). Posteriormente a la incubación fueron adicionados 15 µL de resazurina (Sigma Aldrich®, Estados Unidos) al 0,01% (p/v) en cada pocillo y se dejaron reposar durante 3 h a una temperatura de 35 ± 2º C para la reacción del colorante. El valor de la CIM fue establecido como la menor concentración que impidió el cambio de color total o parcial en los pocillos de la microplaca. La permanencia del color azul indicóausencia de crecimiento, mientras que el cambio de color a rosa indicó crecimiento bacteriano.

Para la determinación de la CBM se tomaron 10 µL de cada pocillo de las microplacas en los que no se evidenció cambio de color luego del agregado de resazurina y se sembraron en superficie en placas de Petri conteniendo agar MH. Se incubaron durante 24 h a 35 ± 2º C. Posteriormente, se observó si hubo crecimiento bacteriano. La CBM fue determinada como la menor concentración que visualmente no presentó desarrollo bacteriano. Estos ensayos se realizaron por triplicado.

Análisis fitoquímico preliminar

El análisis fitoquímico preliminar se realizó a los extractos 1 y 2, debido a que fueron los que presentaron mayor poder inhibitorio. Para ello se evaluó la presencia de los principales grupos de metabolitos secundarios, mediante pruebas en tubos utilizando la metodología descrita por Matos, 1988 (23).

Para determinar la presencia de taninos, se empleó el ensayo con cloruro férrico. Se utilizaron 2 mg de los extractos disueltos en 10 mL de agua destilada, posteriormente, se agregaron 3 gotas de cloruro férrico al 1% (Cicarelli®, Argentina). Un cambio en la coloración o la formación de precipitado indicó reacción positiva.

Para la determinación de flavonoides se empleó la reacción de cianidina o Shinoda. Se disolvió 2 mg del extracto en 3 mL de metanol (Biopack®, Argentina). Posteriormente, se adicionaron 5 gotas de ácido clorhídrico (Anedra®, Argentina) y 0,5 g de polvo de magnesio (Cicarelli®, Argentina). Para su interpretación se tuvo en cuenta la aparición de coloración rojiza, violeta o naranja, como una reacción positiva.

Para determinar la presencia de saponinas, se empleó el ensayo de generación de espuma. En un tubo de ensayo se disolvieron 2 mg de los extractos secos en 1 mL de etanol al 80% (Biopack®, Argentina). La disolución se diluyó 1:15 en agua destilada y se agitó vigorosamente durante 5-10 min. La formación de espuma con permanencia de 15-30 min indicó reacción positiva.

Para el análisis de alcaloides, se pesaron 2 mg de los extractos y se disolvieron en 4 mL de ácido clorhídrico al 5% (Anedra®, Argentina). Cada disolución se fraccionó a razón de 1 mL, en dos tubos de ensayos y se adicionaron gotas del reactivo de Bouchardato de Mayer a cada tubo. Con el primero, la formación de precipitado naranja indica una reacción positiva, y con el segundo la formación de precipitado blanco.

Determinación del contenido de polifenoles totales

Para la determinación del contenido de polifenoles totales de los extractos obtenidos y de yerba mate elaborada, se utilizó el método de Folin-Ciocalteu estandarizado por la International Standard ISO/FDIS 14502-1, 2004(24). La concentración de polifenoles totales fue medida por espectrofotometría (Espectrofotómetro Spectrum SP 2100, China) a una longitud de onda de 765 nm, método basado en una reacción colorimétrica de óxido-reducción. El agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin-Ciocalteu (Anedra®, Argentina). Para lo cual primeramente fue necesario realizar una curva de calibración con ácido gálicomono hidratado (MP Biomedicals, Estados Unidos) a concentraciones en el rango de 10-50 µg/mL. La ecuación de la recta fue y = 0,0101x + 0,0082con R2 = 0,9951, en la que y = absorbancia y x = concentración.

Análisis estadístico

Los resultados de la investigación fueron tratados estadísticamente mediante el programa Statgraphics Centurion XV. Se realizaron análisis de diseño factorial 22 y análisis de varianza simple (ANOVA). Los factores estudiados en el análisis de diseño factorial fueron tipo de solvente yproporción hidroalcohólica. En el ANOVA, se analizaron los porcentajes del efecto inhibitorio producido, se determinó el valor-p, se realizaron pruebas de múltiples rangos y test de mínima diferencia significativa de Fisher.

Resultados y Discusión

Obtención de los extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada

Se obtuvieron dos extractos hidroetanólicos y dos extractos hidrometanólicos a partir de yerba mate elaborada paraguaya. Los extractos fuidos obtenidos presentaron ciertas características organolépticas peculiares de yerba mate, como su aroma particular a mate cocido, de color ámbar oscuro y una consistencia espesa, con presencia de sedimentos. El secado de los extractos hidroalcohólicos permitió la obtención de extractos de consistencia de polvo seco. En la tabla 2 se muestra el porcentaje del rendimiento para cada extracto preparado.

Tabla 2: Rendimiento de los extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada

Muestra

Rendimiento (%)

Extracto 1

16,41 ± 0,10a

Extracto 2

22,69 ± 0,15b

Extracto 3

21,36 ± 0,04c

Extracto 4

20,98 ± 0,19 d

Referencias: Los valores del rendimiento corresponden al promedio de tres determinaciones ± desvío estándar.Diferentes supraíndices indican diferencias significativas (valor-p≤0,05).

Aunque el análisis factorial mostró que ninguno de los factores estudiados tipo de solvente y proporción hi-droalcohólica, ni su interacción resultan estadísticamente significativos en % R de los extractos para un nivel de confanza del 95%, se observó,en las condiciones ensayadas, mediante un ANOVA simple, diferencias significativas entre el % R de cada extracto (valor-p≤ 0,05). El extracto 2 presentó un mayor % R (22,69%), seguido del extracto 3 (21,36%).García et al., 2016 (25) observaron que el tipo de solvente infuye en el rendimiento de los extractos de Ri-cinus communis L.; los que fueron preparados empleando solventes de diferentes polaridades. Sin embargo, en este trabajo el análisis factorial no evidenció dicho efecto probablemente a que se utilizaron dos tipos de alcoholes, los cuales diferen escasamente en su polaridad. Otros factores que pueden infuir en el rendimiento de los extractos son el tiempo de maceración, fundamentalmente si se realizan por largos periodos de tiempo; el método de extracción y grado de molienda de la muestra (26). En este trabajo no se evaluaron estos factores mencionados.

Actividad antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos secos

Las cantidades de los extractos secos de yerba mate elaborada, en las condiciones ensayadas, presentaron actividad antibacteriana contra las cepas de S. aureus (salvaje), S. aureus (ATCC 25923) y S. Enteritidis (salvaje). E. coli (ATCC 25922) y P. aeruginosa (ATCC 27853) no presentaron halos de inhibición de crecimiento. Las cepas de S. aureus presentaron halos de inhibición de crecimiento frente a todos los extractos ensayados, mientras que S. Enteritidis no presentó halo de inhibición de crecimiento frente al extracto 4 (etanol: agua; 70:30), tanto por el método de difusión con discos como por el método de difusión por pocillos.

De todas las cantidades ensayadas, la cantidad de 10 mg del extracto seco fue la que produjo halos de inhibición de crecimiento de mayor tamaño. S. aureus (ATCC 25923) presentó halos de hasta 30,5 mm, mientras que, S. Enteri-tidis hasta 13 mm, indistintamente al método empleado.

Los porcentajes del efecto de inhibición de crecimiento, para la cantidad de 10 mg, determinadospara los métodos de difusión con discos y de difusión por pocillos se obser-vanen la Tabla 3.

Tabla 3: Porcentaje del efecto de inhibición de crecimiento de los extractos secos de yerba mate para la cantidad de 10 mg frente a Salmonella Enteritidis (salvaje), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Staphylococcus aureus(salvaje), por los métodos de difusión con discos y de difusión por pocillos.

Cepas

Salmonella Enteritidis (salvaje)

Staphylococcus aureus (ATCC 25923)

Staphylococcus aureus (salvaje)

Métodode difusión

Disco

Pocillo

Disco

Pocillo

Disco

Pocillo

Extracto 1 (% EI)

35,00a

44,07 a

131,11 ab

136,36 a

121,05 ab

136,11 a

Extracto 2 (% EI)

40,00 b

43,10 a

133,33 a

139,53 a

131,58 a

132,43 a

Extracto 3 (% EI)

30,51 c

46,55 a

131,82 ab

135,56 a

118,42b

128,95 a

Extracto 4 (% EI)

20,00 d

20,69b

123,91 b

139,53 a

110,53 b

121,62 b

Referencias: Extracto 1 = metanol:agua(60:40); extracto 2 = etanol:agua (60:40); extracto 3 = metanol:agua (70:30); extracto 4 = etanol:agua (70:30); % EI = porcentaje del efecto de inhibición de creci-miento.Los valores en una misma columna con diferentes supraíndice-sindican diferencias significativas (valor-p≤0,05).

Ambas cepas de S. aureus presentaron un mayor % IE (110,53 – 139,53%) en comparación con S. Enteritidiscepa salvaje (20,00 – 46,55%). El análisis factorial para ambos métodos de difusión indicó que ninguno de los factores estudiados, tipo de solvente y proporción hidroalcohólica, ni su interacción tienen infuencia estadísticamente signi-ficativa en el % EI, para un nivel de confanza del 95%.

Estos hallazgos coinciden con el estudio realizado por Sari et al., 2007(27) N, N-dimethyl formamide (DMF en extractos de I. paraguariensis, preparados con soluciones acuosas al 50% de metanol, etanol, N-metilformamida(DMF) y acetona. Todos los extractos presentaron actividad frente a S.aureus y otras bacterias como Listeria monocytogenes, Hafiniaalvei, Yersiniaentero-colíticay Bacilluscereus, pero no frente a E. coli O157:H7.

La ausencia de halo de inhibición de crecimiento de E. coli frente a extractos hidroalcohólicos de hojas y de tallos de I. paraguariensis fue reportada por De Biasi et al.,2009 (28). Además de hallar sensibilidad de S. aureus, de S. epidermidis y de Proteusmirabilis, también informaron sensibilidad de P. aeruginosa, a diferencia de los resultados hallados en este estudio. Asimismo, Rodríguez Vaquero et al., 2010(29), Burris et al., 2011 (3) y Rempe et al.,2015(4) reportaron actividad antimicrobiana de extractos acuosos de yerba mate frente a S. aureus.

Girolometto et al.,2009 (13) ensayaron la actividad bactericida de extractos alcohólicos, hidroalcohólicos y acuosos de I. paraguariensis frente a S. aureus, Entero-coccusfaecalis, S. Enteritidis y E. coli. Si bien, todas las formas de extracción mostraron capacidad para inhibir o inactivar selectivamente a los microorganismos ensayados, los extractos alcohólicos fueron los más efectivos, sugiriendo que los compuestos responsables de la actividad antimicrobiana serían volátiles y se perderían en el proceso de decocción.

Prado Martin et al, 2013 (14) obtuvieron extractos secos utilizando yerba mate elaborada de origen brasileño mediante el método de percolación, utilizando disoluciones hidroetanólicas e hidrometanólicas. Las cepas en estudio fueron S. aureus, L. monocytogenes, S. Enteritidis y E. coli. Los resultados mostraron que todos los extractos inhibieron el crecimiento de todos los microorganismos en estudio, a excepción de E. coli. Oliveira et al, 2016 (30)también obtuvieron extractos a partir de yerba mate brasileña elaborada por medio de baño ultrasónico. Los extractos hexánicos, metanólicos y acuosos de /. paraguariensis se ensayaron frente a cepas de S. aureus, Klebsiellapneumo-niae, Acinetobacterbaumannii y P. aeruginosa. Todos los extractos inhibieron el crecimiento de las cepas estudiadas. Siendo el extracto acuoso el que presentó mayor poder inhibitorio frente a las cepas estudiadas. Por otro lado, la cepa que mejor inhibió el extracto acuoso fue S. aureus comparada con las otras especies.

Para entender la acción antibacteriana de /. paraguariensis contra bacterias Gram positivas, se ha tenido en cuenta la pared celular menos compleja que estas presentan, con menor contenido lipídico y ausencia de membrana externa comparando con las Gram negativas. Los terpenos (carotenoides y saponinas) presentes en la yerba mate pueden aumentar la permeabilidad de la membrana plasmática como resultado de una alteración de la membrana lipídica del microorganismo, la cual podría ser la razón por la que presentan esta propiedad antibacteriana (30 y 31).

Por otra parte, con respecto a los métodos empleados para determinar la actividad antimicrobiana, Rojas et al,2005(32) evaluaron los métodos de difusión por pocillos y el método de Kirby Bauer para determinar la actividad antimicrobiana de extractos acetónico, acuoso y etanólico de Spilantes americana contra S. aureus, P aeruginosa, E. coli, Streptococcus P-hemolítico y Saccha-romycescerevisiae. Los resultados mostraron que el método por pocillos es más sensible que el método de Kirby Bauer para determinar actividad antimicrobiana. En este trabajo, bajo las condiciones estudiadas, de acuerdo a la prueba de comparación de medias no se observaron diferencias significativas entre los métodos de difusión ensayados. Ambos métodos resultarían adecuados para la detección de actividad antimicrobiana in vitro de los extractos hi-droalcohólicos secos de yerba mate.

Concentración inhibitoria mínima y concentración bactericida mínima

Los resultados obtenidos de la CIM y CBM de los extractos hidroalcohólicos secos 1 y 2 se observan en la Tabla 4.

Tabla 4: Concentración inhibitoria mínima y concentración bactericida mínima de los extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada.

S. aureus (ATCC 25923)

S. aureus (salvaje)

S. Enteritidis (salvaje)

E1

E2

E1

E2

E1

E2

CIM

0,78

0,78

1,56

0,78

6,25

6,25

CBM

0,78

0,78

1,56

1,56

6,25

6,25

Referencias: CIM= concentración inhibitoria mínima (mg/mL); CBM= concentración bactericida mínima (mg/mL); E1= extracto 1 (metanol 60:40); E2= extracto 2 (etanol 60:40).

Las cepas de S. aureus presentaron valores de CIM y CBM más bajos que la cepa de S. Enteritidis. Los valores de CIM/CBM hallados para S. aureus (ATCC 25923) con el extracto hidroetanólico (0,78/0,78 mg/mL) y para S. En-teritidis con el extracto hidrometanólico (6,25/6,25 mg/mL) coinciden con los resultados obtenidos por Prado Martin et al., 2013 (14). Estos evaluaron extractos hidroalcohólicos de yerba mate elaborada brasileña obtenidos por el método de percolación. Además, las CBM del extracto metanólico para las cepas de S. aureus en este trabajo (0,78 y 1,56 mg/ mL) fueron menores a la hallada por los investigadores antes mencionados (3,13 mg/mL). Por otra parte, Burris et al., 2011(3), obtuvieron CIM y CBM menores que los hallados en la presente investigación para S. aureus (0,025-0,05 mg/ mL) con extractos acuosos de yerba mate elaborada de origen argentino. También en estudios realizados por Oliveira et al., 2016 (30) utilizando extractos acuosos y hexánicos de yerba mate elaborada de origen brasileño se obtuvieron resultados similares a los de Burris et al., 2011 (3), siendo el extracto acuoso el que presentó mejor actividad antibacteriana contra S. aureus, con una CIM de 0,025 mg/mL.

Análisis fitoquímico preliminar de los extractos de yerba mate elaborada

El análisis fitoquímico preliminar posibilita la orientación de investigaciones posteriores para determinar la actividad biológica de las especies en estudio y los principios activos involucrados, puesto que cada uno de ellos se encuentra relacionado con actividades biológicas específicas (33). Como puede observarse en la Tabla 5, en el extracto 1 se detectó, en las condiciones estudiadas, mayor concentración de taninos y saponinas, mientras que en el extracto 2, se detectó mayor cantidad de favonoides. Por otra parte, en ninguno de ellos se pudo corroborar la presencia de alcaloides.

Tabla 5: Análisis fitoquímico preliminar de extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada.

Metabolitos secundarios

Extracto 1

Extracto 2

Taninos

++

+

Flavonoides

+

++

Saponinas

++

+

Alcaloides

Referencias: + presencia escasa; ++ presencia relativamente abundante; +++ presencia abundante; no detectado; extracto 1 = metanol 60:40; extracto 2 = etanol 60:40.

La composición química de la yerba mate puede variar tanto cualitativa como cuantitativamente, en función del tipo de material que se analice, tal como la hoja fresca o la yerba mate elaborada, contenga o no palos y del proceso de elaboración al cual es expuesta, debido a que, en ciertas ocasiones, el procesamiento puede alterar a través de reacciones de oxidación o reducción la composición de las moléculas activas. Otros factores que infuyen en la composición química son los factores agronómicos y climáticos y las prácticas culturales (34).

Por tanto, durante el procesamiento industrial se pueden modificar tanto la composición química como el sabor del producto final. Las etapas de tostado, secado y trituración son las que más afectan (35).

En la investigación realizada por De Biasi et al., 2009 (28) estudiaron extractos acuosos preparados a partir de las hojas y ramas de I. paraguariensis con y sin exposición al sol. Los extractos de las ramas sin exposición al sol produjeron mayores halos de inhibición de crecimiento de los diferentes microorganismos ensayados (Candidaalbi-cans, E. coli, Proteusmirabilis, P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis). S. aureus fue el microorganismo más sensible a los extractos con exposición al sol, mientras que, P . mirabilis fue el más sensible a los extractos sin exposición al sol. Según el análisis comparativo realizado por Darota et al., 2011(36), las hojas cultivadas al sol presentan mayor contenido de derivados de cafeoilo, cafeína, teobromina y rutina, en comparación con los cultivados a la sombra. Además, observaron que las hojas procesadas de chimarrão sufren una disminución en la concentración de xantinas, mientras que las oxidadas tienen una menor concentración de fenólicos, en comparación con las hojas verdes. Sin embargo, las hojas sometidas a escaldado y secado (tipo chimarrão), presentan más compuestos fenólicos.

Contenido de polifenoles totales en los extractos hidroalcohólicos secos de yerba mate elaborada

El contenido de polifenoles totales de los extractos secos preparados presentó un rango de 24,27 24,50 g equivalentes a ácido gálico/100 g de extracto seco, mientras que, el contenido en la yerba mate elaborada fue de 11,16 g EAG/100 g muestra seca. De acuerdo con el análisis de varianza, no existen diferencias estadísticamente significativas del contenido de polifenoles totales entre los diferentes extractos, siendo estos significativamente mayores al de la yerba mate elaborada. El contenido de polifenoles en los extractos hidroalcohólicos secos duplica al valor hallado en la yerba mate elaborada.

Los valores de polifenoles totales, en este estudio (24,27 24,5 g EAG/100 g de extracto seco), superan a los obtenidos por Prado Martin et al., 2013 (14)(17,30 – 19,39 g EAG/100 g), por lo que, se podría inferir que la combinación de los métodos de maceración y sonicación favorecerían la extracción de los compuestos fenólicos cuando se realizan extracciones hidroalcohólicas. Por otro lado, Sari et al., 2007 (27), obtuvieron a partir de la yerba mate extractos acuosos al 50% de N-metilformamida, etanol, metanol y acetona, en los que el contenido de poli-fenoles varió entre 11,93 97,01 g EAG/100 g, dependiendo del solvente y del tiempo de extracción. Aún no se han verificado completamente los compuestos responsables de la actividad antimicrobiana que presenta la yerba mate, ni los efectos sinérgicos que puedan tener. Los posibles compuestos que pueden contribuir a la actividad antimicrobiana son los ácidos cafeico y clorogénico, que actúan sobre bacterias Gram negativas; y el kaempferol y la quercetina que son favonoles capaces de inhibir el crecimiento de S. aureus (12). Si bien Prado Martin et al., 2013 (14) hallaron una relación directa entre el contenido de polifenoles totales y la actividad inhibitoria de los extractos de yerba mate, los resultados de este trabajo podrían sugerir que, la presencia de otros componentes en los extractos junto a los polifeno-les totales contribuirían al efecto antimicrobiano.

Conclusión

Los resultadosde este estudio sugieren que los extractos hidroalcohólicossecosde yerba mate elaborada paraguaya poseen compuestos con propiedades antibacterianas capaces de inhibir el crecimiento de S.aureus y S. Enteritidis cuando se utilizansoluciones hidroalcohólicas de etanol o metanol en una proporción 60:40.

Si bien, las investigaciones son limitadas en cuanto a la eficacia de la yerba mate elaborada como antimicrobiano y su capacidad para conservar alimentos y bebidas, los hallazgos de esta investigación podrían contribuir a su potencial uso como conservante natural en la industria alimenticia, situándola como una alternativa prometedora capaz de complementar o de reemplazar a productos químicos sintéticos para la preservación microbiológica de alimentos.

Actualmente, no se han reportado estudios de actividad antibacteriana in vitro realizados a la yerba mate elaborada paraguaya, convirtiéndose este en el primer reporte de actividad antibacteriana para este producto.

Bibliografía

1.    De la Fuente Salcido, N.M.; Barboza Corona, J.E. Inocuidad y bioconservación de alimentos. Acta Universitaria; vol. 20(1): p. 43-52, 2010.         [ Links ]

2.   Soto, Z.; Pérez, L.; Estrada, D. Bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos: Una mirada en Colombia. Salud Uninorte; vol. 32(1): p. 105-122, 2016.

3.    Burris, K.P.; Davidson, P.M.; Stewart, C.N.; Harte, F.M. Antimicrobial activity of yerba mate (Ilex paraguariensis) aqueous extracts against Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus. Journal of Food Science; vol. 76(6): p. 456-463, 2011.

4.    Rempe, C.S.; Burris, K.P.; Woo, H.L.; Goodrich, B.; Gosnell, D.K.,

Tschaplinski, T.J., Stewart, C.N. Computational ranking of yerba mate small molecules based on their predicted contribution to antibacterial activity against methici-llin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One; vol. 10(5):p. 1-18, 2015.

5.    Instituto Nacional de Tecnología, Normalización y Metrología (INTN). Norma Paraguaya NP 35 001 93, Yerba Mate; Segunda Edición; Asunción, Paraguay, 1995.

6.    Fernandes, E.S.; De Oliveira Machado M.; Becker, A.M.; De Andrade, F. , Maraschin, M.; Da Silva, E.L. Yerba mate (Ilexparagua-riensis) enhancesthe gene modulation and activity of paraoxonase-2: In vitro and in vivo studies. Nutrition; vol. 28 (11-12): p. 1157-1164, 2012.

7.    Bergottini, V.M.; Hervé, V.; Sosa, D.A.; Otegui, M.B.; Zapata, P.D.; Junier, P. Exploring the diversity of the root-associated microbiome of Ilex paraguariensis St. Hil. (Yerba Mate). Applied Soil Ecology; vol. 109: p. 23-31, 2017.

8.    Cardozo Junior, E.L.; Morand, C. Interest of mate (Ilex paraguariensis A. St. -Hil.) as a new natural functional food to preserve human cardiovascular health – A re-view. Science Direct; vol. 21: p. 440-454, 2015.

9.    Heck, C. I.; De Mejia, E.G. Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): A comprehensive review on chemistry, health im-plications, and technological considerations. Journal of Food Science; vol. 72(9): p. 138-151, 2007.

10.    Rodríguez Riera, Z.; Robaina Mesa, M.; Jáuregui Haza, U.; Blanco González, A.; Rodríguez Chanfrau, J.E. Empleo de la radiación ultrasónica para la extracción de compuestos bioactivos provenientes de fuentes naturales. Estado actual y perspectivas. Revista CENIC Ciencias Químicas; vol. 45: p. 139-147, 2014.

11.    Carrión Jara, A.V.; García Gómez, C.R. Preparación de extractos vegetales: determinación de eficiencia de metódica. Tesis de Grado. Universidad de Cuenca, 2010. Disponible en: http://dspace.ucuenca.edu.ec/ bitstream/123456789/2483/1/tq1005.pdf (consultado17 Nov. 2017).

12.    Burris, K.P.; Harte, F.M.; Davidson, P. M.; Neal Stewart, C.; Zi-vanovic, S. Composition and bioactivep properties of yerba mate (llexparaguariensis A. St.-Hil.): A Review. Chilean Journal of Agricultural Research; vol. 72(2): p. 268-275, 2012.

13.   Girolometto, G.; Avancini, C.A.M.; Carvalho, H.H.C.; Wiest, J.M. Actividade antibacteriana de extratos de erva mate (Ilexparaguariensis A.St.-Hil.).Revista Brasileira de Plantas Medicinais; vol. 11(1): p. 49-55, 2009.

14.    Prado Martin, J.G.; Porto, E.; De Alencar, S.M.; Da Glória, E.M., Corrêa, C.B.; Ribeiro Cabral, I.S. Antimicrobial activity of yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) against food pathogens. Revista Argentina de Microbiología; vol. 45(2): p. 93-98, 2013.

15.    Racanicci, A.M.C.;Allesen-Holm, B.H.;Skibsted, L.H. Sensory evaluation of precooked chicken meat with mate (Ilexparaguariensis) added as antioxidant. European Food Research and Technology; vol. 229(2): p. 277-280, 2009.

16.    Beal, P. ; Faion, A.M.; Cichoski, A.J.; Cansian, R.L.; Valduga, A.T.; De Oliveira, D.; Valduga, E. Oxidative stability of fermented Italian-type sausages using mate leaves (Ilex paragua-riensis St. Hil) extract as natural antioxidant. Inter-national Journal of Food Sciences and Nutrition; vol. 62(7): p. 703-710, 2011.

17.    Carrillo, M.L.; Castillo, L. N.; Mauricio, R. Evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos de propóleos de la Huasteca Potosina (México). Información Tecnológica; vol. 22(5): p. 21-28, 2011.

18.   Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT). Farmacopea Argentina; Séptima Edición, 2013.

19.    Clinical and Laboratory Standards Institute. Peformance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility; Ap-proved Standard. CLSI document M02-A12; Duodé-cimaEdición; vol. 35(1), 2015.

20.    Martínez, M.J.; Molina, N.;Boucourt, E. Evaluación de la actividad antimicrobiana de Psidiumguajava L. (Guayaba). Revista Cubana de Plantas Medicinales; vol. 2(1): p. 12-14, 1997.

21.    Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard; Novena Edición; vol. 32, 2012.

22.    Da Costa Borges, J. Atividade antimicrobiana de extrato de Brosimumgaudichaudii Trécul. contra bactérias iso-ladas de lesões de pés diabéticos. Tesis de Maestría. Universidade Federal do Tocantins, 2016. Disponible en: http://repositorio.ufit.edu.br (consultado 18 Dic. 2017).

23.    Matos F.J.A. Capítulo 2: Roteiro sequencial de prospe-cção de constituintes químicos de extratos de plantas; Introdução à Fitoquímica Experimental. Fortaleza, Brasil; Editorial Ufic; p. 35-57, 1988.

24.    International Standard ISO 14502-1. Determination of subs-tances characteristic of green and black tea: Content of total polyphenols in tea, colorimetric method using Folin- Ciocalteu reagent. Primeraedición; Switzerland, 2005.

25.   García, T.E.; Uribe García, A.; Díaz Ramos, S.G.; García López, P.M. Evaluación del rendimiento de extractos en hojas de Ricinuscommunis L.Conciencia Tecnológica; (52): p. 12-18, 2016.

26.    Castaño Castrillón, J.J.; Quintero, G.P.; Vargas, R.L. Caracterización del rendimiento de extracción y del contenido de sólidos solubles de la bebida de café. Cenicafé; vol. 51 (3): p. 185-195, 2000.

27.    Sari, F. ; Turkmen, N.; Polat, G.; Velioglu, Y.S. Total polyphenol, antioxidant and antibacterial activities of black mate tea. FoodScience and Technology Research.; vol. 13 (3): p. 265-269, 2007.

28.    De Biasi, B.; Grazziotin, N.A.;Hofmann, A.E. Atividade antimicrobiana dos extratos de folhas e ramos da Ilex para-guariensis A. St.-Hil.,Aquifoliaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia; vol.19(2 B): p. 582-585, 2009.

29.    Rodríguez Vaquero, M.J.; TomassiniSerravalle, L.R.; Manca de Nadra, M.C.; Strasser de Saad, A.M. Antioxidant capacity and antibacterial activity of phenolic compounds from Argentinean herbs infusions. Food Control; vol. 21(5): p.779-785, 2010.

30.    Oliveira Penteado, J.; Martins Volcão, L.; Ferandes Ramos, D.; Da Silva-Júnior, F.M.; Muccillo-Baisch, A.L. Actividade antimicrobiana de extractos de Ilexparaguariensis. Revista de Epidemiologia e Controle de Infecção; vol. 1 (1): p. 136-146, 2016.

31.    Carelli, G.; Macedo, S.M.D.; Valduga, A.L.; Corazza, M.L.; Oli-veira, J.V.; Franceschi, E. Vidal, R.; Jaskulski, M.R. Avaliação preliminar da atividade antimicrobiana do extrato de erva-mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) obtido por extração com CO2 supercrítico. Revista Brasileira de Plantas Medicinales; vol. 13(1): p. 110-115, 2011.

32.    Rojas, J.J.; García, A.; López, A. Evaluación de dos metodologías para determinar la actividad antimicrobiana de plantas medicinales; Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas; vol. 4(2): p. 28-32, 2005.

33.    Carvajal Rojas, L.C.; Hata Uribe, Y.H.; Sierra Martínez, N.S.; Rueda Niño, D. Análisis fitoquímico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupatá (StrychnosschultesianaKrukof). Revista Colombia Forestal; vol. 12: p. 161-170, 2009.

34.    Del Valle Argüello B.; Scipioni, G.P. Capítulo 9: Composición química I: polifenoles y metilxantinas” en Schmalko, M., Prat, S. y Kanzi, R. La yerba mate: tecnología de la producción y propiedades. Posadas, Misiones: Editorial Universitaria, p. 205-220, 2015.

35.    Zaions, I.; Picolo, A.P.; Gonçalves, I.L.; Borges, A.C.; Valduga, A.T. Physico-chemical characterization of Ilex para-guariensis St. Hil. during the maturation. Brazilian Archives of Biology and Technology; vol. 57(5): p. 663-667, 2014.

36.    Dartora, N.; De Souza, L.M.; Santana-Filho, A. P.; Iacomini, M.; Valduga, A.T.; Gorin, P.A. J.; Sassaki, G.L. UPLC-PDA-MS evaluation of bioactive compounds from leaves of Ilex paraguariensis with diferent growth conditions, treatments and ageing. Food Chemistry; vol. 129(4): p. 1453-1461, 2011.

Recibido: 29/01/2018. Aprobado: 05/07/2018.

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