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Revista americana de medicina respiratoria

On-line version ISSN 1852-236X

Rev. am. med. respir. vol.14 no.2 CABA June 2014

 

PERSPECTIVAS

El rol del neumonólogo en el estudio de los marcadores moleculares en el cáncer de pulmón no pequeñas células

 

Autores: Henri Colt1, Septimiu Murgu2

1University of California Irvine - USA
2The University of Chicago, USA

Correspondencia: Henri Colt E-mail: henricolt@gmail.com 

Recibido: 27.02.2014
Aceptado: 08.04.2014

 

La mayor parte de los paciente con cáncer de pulmón son diagnosticados, estadificados o re-estadificados utilizando muestras pequeñas obtenidas a través de broncoscopía o punción aspiración. En la era actual de tratamiento personalizado del cáncer de pulmón, el tejido no se require solamente para el análisis histológico-morfológico sino también para el análisis molecular que ayuda a predecir los resultados de determinadas terapias sistémicas.
Existen variedad de maneras de procesar las muestras de pequeño volumen para el diagnóstico y la tipificación molecular, las estrategias óptimas varían de una institución a la otra, dependiendo de la infraestructura, experiencia, recursos de laboratorio y tecnología disponible. Este nuevo paradigma en el cual la tipificación molecular de rutina se ha transformado en standar de tratamiento requerirá un manejo más standartizado de la adquisición y el procesamiento de los pequeños especímenes1.

Especímenes de citología

La aspiración por aguja transbronquial (TBNA), la percutánea bajo TC o la guiada por ecografía endobronquial (EBUS) pueden proveer muestras de cantidad y calidad suficientes para el diagnóstico y el análisis molecular. Las muestras deben ser examinadas inmediatamente después de su obtención para determinar la presencia y cantidad de sangre, material granular, pequeños fragmentos de tejido, pus y material necrótico. La presencia o ausencia de estos elementos debería verificarse antes, durante y después de la preparación del extendido. En el caso de los especímenes broncoscópicos, también debería verificarse la cantidad de mucus y la presencia de fragmentos de cartílago. Estos hallazgos macroscópicos pueden ser indicadores tempranos de la potencial utilidad diagnóstica de la muestra. Por ejemplo, una muestra de citología que contiene material diagnóstico, muy frecuentemente tiene un aspecto espeso, pálido y de consistencia cremosa2, 3. Los extendidos en que los fragmentos de tejido tienen un aspecto brillante y granular, y la presencia de material granular son más evidentes en los casos en que se encuentra un carcinoma3.
Los especímenes citológicos de aspiración con aguja fina probablemente son adecuados para tipificación molecular. Por ejemplo, en un estudio de 128 especímenes citológicos enviados para diagnóstico molecular (punción -FNA- transtorácica y transbronquial en 67, FNAs extratorácica en 29, derrame pleural en 29 y lavado bronquial en 3), en 126 casos (98%) la muestra fue adecuada para análisis de EGFR/KRAS y solamente 2 casos no pudieron ser analizados debido a especímenes pobremente preservados.
Varios estudios han descripto el uso de muestras tomadas de forma rutinaria, tales como extendidos o bloques celulares, para pruebas moleculares en pacientes con cáncer de pulmón no pequeñas células (NSCLC)4-7. Algunas de las recomendaciones propuestas para maximizar el rendimiento diagnóstico para diagnóstico molecular de las muestras citológicas incluyen las siguientes:
1. Utilización de evaluación in situ (rapid on-site evaluation o ROSE). La evaluación in situ de los especímenes de citología asegura una celularidad óptima, la cual es crítica para la subtificación del NSCLC y ayuda a confirmar que hay suficiente material para tipificación molecular8. El uso de ROSE aumenta significativamente la precisión diagnóstica y la costo-efectividad de la citología torácica1, 9. Después del examen microscópico, el citopatólogo comunica los hallazgos inmediatamente y notifica al operador cuándo se ha obtenido suficiente material. Las muestras que contienen solamente mucus o predominancia de cartílago bronquial, que tienen pocos o ningún linfocito, material necrótico y poco o nada de material diagnóstico pueden ser de esta forma tempranamente identificadas como inadecuadas. En esos casos, de ser posible se deberían tomar más muestras.
2. Los extendidos se preparan utilizando métodos de tinción standard. Las preparaciones de rutina incluyen los extendidos secados al aire, teñidos con Diff-Quik (DQ); los extendidos fijados con alcohol y teñidos con hematoxilina-eosina o Papanicolaou (H & E/Pap); los extendidos Thin Prep, extendidos en monocapa celular, teñidos con Papanicolaou, preparados por transferencia de células en suspensión; y los bloques de células teñidos con H & E (pellets de células embebidos en parafina preparados usando centrifugación de fluido de CytoLyt después del agregado de HistoGel)8.
3. La subtipificación del NSCLC y el diagnóstico de otros tumores debería seguir los criterios citomorfológicos standard1, 8.Un panel típico de inmunohistoquímica (IHQ) incluye thyroid transcription factor-1 (TTF-1), p63/4A4, y citokeratinas de alto peso molecular (HMWCKs): 34bE12/CK903 yCK5/6.132
Los resultados de varios estudios clínicos muestran que los especímenes pequeños obtenidos por EBUS-TBNA y otras modalidades son suficientes para diagnóstico molecular siempre que la adquisición, manejo y procesamiento de las muestras se realice de manera adecuada12-15. Esto requiere un esfuerzo coordinado entre el equipo que obtiene la muestra y el que procesa la citopatología y la examina. Se han comunicado las siguientes recomendaciones para el manejo y procesamiento de muestras de EBUS-TBNA o TBNA convencional destinadas a análisis molecular16, 17.
1. Cada aspirado se coloca sobre una lámina de vidrio, ya sea inyectando aire desde la jeringa a través de la misma aguja o reemplazando la (jeringa) aguja con un estilete. Luego se inyecta solución salina a través de la aguja de EBUS dentro de la solución de Cytolyt para recuperar las células remanentes. De este material colocado sobre los vidrios se pueden seleccionar todas las partículas de tejido blanquecinas separándolas del mucus-sangre y preparando con ellas dos extendidos. Al resto de la muestra, se la deja en su vidrio original para que forme un coágulo. Uno de los extendidos se seca con aire para ROSE usando tinción de Diff Quick o Giemsa y el segundo se coloca en etanol al 95% para tinción con Pap, (después de chequear la calidad de la muestra microscópicamente) para aumentar el detalle de los núcleos celulares17, 18. Los extendidos preparados en fresco (levantando el cubreobjeto de los extendidos secados al aire) y los archivados son especímenes valiosos para estudios moleculares de EGFR (usando análisis por PCRf) y KRAS (por pruebas de secuenciación directa), particularmente cuando la celularidad de los bloques celulares no es suficiente (puede ser insuficiente)19. Las ventajas del uso de extendidos directos sobre los bloques celulares para el análisis molecular incluyen la posibilidad de evaluar la calidad de la muestra en el momento de la toma y simultáneamente determinar si quedará material suficiente para análisis subsiguientes al mismo tiempo que, con un menor tiempo de procesamiento, resultados más rápidos y a menor costo19.
2. El tejido obtenido (si se obtiene tejido) se coloca sobre un papel filtro para absorber el exceso de sangre17. Los datos preliminaries no indican diferencias significativas en la tasa de detección de mutaciones entre muestras obtenidas por citología o por histología15. Si se obtiene tejido, se fija con formol buffer al 10% y se hace una muestra fijada en formol y embebida en parafina (FFPE) de la que luego se obtienen cortes y se tiñen con H&E para diagnóstico histológico e IHQ17. Esta muestra también se puede usar para FISH y para extracción de DNA/RNA para determinación de mutación. Las muestras fijadas con formol son las preferidas para la histopatología y para algunos test moleculares, pero los tiempos de fijación todavía no están estandarizados. Después de que las muestras se embeben en parafina, deberían ser almacenadas como un bloque para mantener la integridad de los antígenos a ser analizados. Parte del tejido puede ser almacenado a (-80°C) usando soluciones estabilizadoras para extración de ARN17.
3. Del material en la solución de Cytolyt o del coágulo se hacen bloques celulares que también se colocan en formalina, se centrifugan en el laboratorio de patología y se envían para procesamiento histológico20.
Los preparados de bloques celulares permiten identificar la arquitectura del adenocarcinoma (por ejemplo, lepídico, papilar o micropapilar)20 lo cual es importante para una clasificación adecuada de las pequeñas biopsias21. Los bloques de células también permiten obtener múltiples extendidos en un formato concentrado para IHQ subsiguiente22 lo cual permitirá la subtificación del NSCLC, especialmente para los carcinomas pobremente diferenciados20. Los bloques celulares se usan rutinariamente para estudios adicionales, pero pueden ser insuficientes para estudio molecular. La aguja puede además ser lavada con solución salina para microbiología (si esto está indicado) o los especímenes pueden ser usados más tarde para extracción de ADN/ARN23.

Muestras de biopsia

El rendimiento de las muestras de biopsia para lesiones endobronquiales visibles es de aproximadamente 75 a 95% para el diagnóstico de malignidad. Factores que influyen en ese rendimiento diagnóstico son por ejemplo el tamaño de la pinza y el número de biopsias. Se deben obtener al menos 3 muestras de biopsia con un fórceps con al menos 2 mm de diámetro abierto para garantizar el máximo rendimiento diagnóstico y para minimizar los artefactos. Un número mayor de biopsias lleva a una mayor exactitud diagnóstica, pero también a una tasa mayor de complicaciones tales como el sangrado. En pacientes con malignidades comprobadas, entre un tercio y la mitad de los fragmentos de biopsia no contienen tumor, lo cual interfiere con el posterior análisis molecular. Los pacientes con tumores no visibles o nódulos periféricos requieren biopsias transbronquiales usando fluoroscopía, EBUS radial o navegación electromagnética (EMN). Normalmente, se toman 4 a 5 muestras de biopsia para diagnóstico y se colocan en formalina al 10%, pero se requieren más muestras si se va a realizar análisis molecular2.
Los estudios que evalúan las mutaciones generalmente prueban más de 10 mutaciones usando secuenciación o FISH24. Debido a que 95% de las mutaciones son mutuamente excluyentes24, es razonable implementar pruebas secuenciales para EGFR, KRAS y ALK, comenzando ya sea con KRAS o EGFR. El análisis de ALK se reserva habitualmente para tumores con KRAS y EGFR negativos. No son consideradas necesarias pruebas concomitantes, excepto si usar este método secuencial retrasa mucho los resultados y el inicio del tratamiento. A continuación hay algunos ejemplos de las recomendaciones publicadas para las pruebas y los algoritmos de tratamiento en pacientes con NSCLC avanzado:
1. Se realiza primero el análisis de la mutación de EGFR; si la mutación es positiva el paciente es un candidato para tratamiento con inhibidores de la tirosinkinasa(EGFR-TKI)25.
2. Si no hay respuesta al tratamiento o si la mutación EGFR fue inicialmente negativa, el tumor se evalúa para mutación EML4-ALK. Si está presente, el paciente es tratado con crizotinib26.
3. Si no hay respuesta al tratamiento o no hay evidencia de traslocación de ALK, el tumor se evalúa para ERCC1 y RRM1. Los pacientes con bajos niveles son tratados con un regimen que contenga platino con gemcitabina27. Si no hay respuesta al tratamiento, el tumor puede ser evaluado para ERCC1 y TS28. Los pacientes con bajos niveles de ERCC1 y TS pueden ser tratados con una combinación de platino y pemetrexed.
4. Para los pacientes en quienes el tratamiento falla o tienen altos niveles de ERCC1, el mejor tratamiento a ofrecer es en base a taxanos y una droga no platino28.
La preocupación acerca de los costos justifica estas recomendaciones de pruebas secuenciales29, 30-33. Esta estrategia es apoyada por los resultados del estudio en Fase II BATTLE (Biomarker-integrated Approaches of Targeted Therapy for Lung Cancer Elimination)34. Aunque todas las organizaciones nacionales e internacionales recomiendan el diagnóstico molecular del NSCLC35-37, primero debe establecerse el tipo histológico35. Por ejemplo, hasta este momento, la mutación de EGFR solo debe estudiarse en los adenocarcinomas, large-cell carcinoma y NSCLC-NOS35. Las pruebas no son recomendadas para el carcinoma escamoso ya que tiene la mutación sólo en el 3.6%35, 38. La mutación EGFR es generalmente excluyente de ALK 39 por lo cual no se recomienda el análisis de ALK en pacientes que tienen positiva la mutación EGFR.
Las mutaciones KRAS están asociadas con resistencia intrínseca a los TKI40, por lo cual el análisis de KRAS puede ser utilizado para determinar la utilidad potencial de TKIs. De acuerdo a las recomendaciones de la National Comprehensive Cancer Network 2012 y de las guidelines del College of American Pathologists/IASLC/Association for Molecular Pathology, el análisis molecular para otros marcadores que no sean EGFR o ALK todavía no está recomendado35, 38.
La evidencia sugiere que hay una heterogeneidad significativa en los mecanismos de resistencia40, los cuales pueden requerir intervenciones terapéuticas específicas. Por ejemplo, el análisis genético e histológico del NSCLC con resistencia adquirida a inhibidores de EGFR mostró que además del mecanismo ya conocido de resistencia de la amplificación delMET(5%) y la mutación EGFR secundaria T790M EGFR (49%), 30% de los tumores tienen mecanismo de resistencia a las drogas desconocidas, 5% tienen mutación PIK3CA y, sorprendentemente, 14% han convertido a carcinoma de pequeñas células (SCLC)41. Los investigadores también han observado que la resistencia genética se pierde después de que el tratamiento con TKI ha cesado. Los resultados de biopsias repetidas tienen un efecto directo sobre las decisiones de tratamiento.

Conclusión

Los marcadores moleculares son crecientemente importantes en el diagnóstico del cáncer de pulmón y en la planificación del tratamiento.
El standard de manejo está cambiando rápidamente en la medida en que los programas multidisciplinarios están integrando el análisis de los marcadores moleculares como parte de su armamentario de rutina del manejo del NSCLC. Dado que neumonólogos tienen una responsabilidad esencial en estos programas, es fundamental que estén al tanto de las estrategias de la toma de decisiones basadas en el resultado de estos análisis moleculares. De esta manera, las discusiones basadas en el completo conocimiento del mecanismo de la toma de decisiones y que realmente integren a neumonólogos, oncólogos, cirujanos, biólogos moleculares y radioterapeutas beneficiarán a los pacientes y a los futuros estudios sobre cáncer de pulmón. El análisis de las muestras pequeñas beneficia a los pacientes, lo que impide la necesidad de muestras más grandes e invasivas. Obtener y procesar las muestras de la manera adecuada mejorará la utilidad de los análisis moleculares y ayudará a todas las instituciones en distintas partes del mundo a adaptarse adecuadamente a los cambios en el estándar de cuidado de los pacientes con NSCLC.

Conflictos de interés: Los autores no presentan conflictos de intereses.

Este comentario está basado en el artículo original: Murgu S, Colt H. Role of the pulmonologist in ordering post-procedure molecular markers in non-small-cell lung cancer: implications for personalized medicine. Clin Lung Cancer 2013, 14: 609-26.

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