ARTÍCULO ORIGINAL

Citoquinas inflamatorias del lavado broncoalveolar en pacientes con enfermedades pulmonares intersticiales difusas: Utilidad en estudios de investigación

 

Autores: Glenda Ernst, Fabián Caro, Fernando Galíndez, Juan José Rodríguez Moncalvo y Pedro Grynblat

Hospital de Rehabilitación Respiratoria María Ferrer

Correspondencia: Dra. Glenda Ernst E-mail: glenda.uba@gmail.com Hospital de Rehabilitación Respiratoria María Ferrer, Finochietto 849, 1° Piso-Endoscopia. Buenos Aires, Argentina; (C1121ABG). TE: +5411-43077474 (176)

Recibido: 04.03.2014
Aceptado: 05.06.2014

---

Resumen

Las Enfermedades Pulmonares Intersticiales Difusas (EPID) se caracterizan por inflamación y fibrosis. El rol del lavado broncoalveolar (LBA) en el diagnóstico delas EPID, ha sido recientemente revalorizado. El objetivo de este trabajo fue evaluar los niveles de citoquinas inflamatorias del LBA asociado a las EPID.
Recolectamos LBA de 28 pacientes con EPID y 15 sujetos con pulmones sanos. Realizamos el recuento total de células del LBA y determinamos los niveles de citoquinas por ELISA.
Encontramos un incremento significativo en el número total de células y en los niveles de IL-6 en el LBA de los pacientes con Neumonía Intersticial no Específica (NINE), Neumonitis por Hipersensibilidad (NH) y Sarcoidosis en comparación con el grupo control. También, observamos un significativo incremento de IL-8 en el LBA de los pacientes con Fibrosis Pulmonar Idiopática /Neumonía Intersticial Usual (FPI/NIU) comparados con el grupo control. No encontramos relación entre los niveles de citoquinas y los parámetros de función pulmonar.
El LBA podría jugar un importante rol para entender los procesos inflamatorios asociados a las EPID. Cuando el LBA es utilizado en conjunto con la información clínica completa, el recuento diferencial y el patrón inflamatorio; este podría contribuir con la evaluación diagnóstica. Sin embargo, el procesamiento del LBA y el análisis de este fluido son críticos para poder aprovechar dicha información. En este estudio, evaluamos la utilización del LBA como una herramienta para comprender los patrones inflamatorios asociados con las EPID.

Palabras claves: Enfermedades pulmonares intersticiales difusas; Lavado broncoalveolar; Inflamación pulmonar.

Abstract

Inflammatory Cytokines in the Bronchoalveolar Lavage from Patients withDiffuse Interstitial Lung Diseases: Useful Research Studies

Interstitial Lung Diseases (ILD) are characterized by inflammation and fibrosis. The role of bronchoalveolar lavage (BAL) in the diagnosis of ILD, has been recently revalued. The aim of this work was to evaluate BAL´s inflammatory cytokines associated with ILD.
We collected BAL from 28 patients with ILD and15 control subjects with healthy lungs. We counted the whole BAL cell number and determined cytokines levels by ELISA.
We found a significant increase in the whole BAL cell count and IL-6 levels in patients with fibrotic non-specific interstitial pneumonia (NSPI), hypersensitivity pneumonitis (HP) and sarcoidosis in comparison with the control group. We also observed a significant increase of IL-8 in BAL from usual interstitial pneumonia/idiopathic pulmonary fibrosis (UIP/IPF) in comparison with the control group. We didn´t find relationship between cytokines levels and lung function parameters.
BAL could play an important role to understand the inflammatory process associated with ILD. When BAL is used together with complete clinical information, BAL cell differential count and inflammatory patterns could contribute to the diagnostic evaluation. BAL processing and analysis of this fluid are critically important for providing useful information. In this study we evaluated the use of BAL as a research tool to understand inflammatory patterns associated with ILD.

Key words: Interstitial Lung Diseases; Bronchoalveolar Lavage; Lung Inflammation.

---

 

Introducción

Las Enfermedades Pulmonares Intersticiales Difusas (EPID) incluyen un heterogéneo grupo de desórdenes pulmonares asociados con una progresiva pérdida de función pulmonar¹. Las EPID se caracterizan por un grado variable de inflamación y fibrosis con sobreproducción y acumulación de componentes de la matriz extracelular (CME), distorsión de la arquitectura pulmonar e inflamación intra-alveolar^2-6.
La Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI) es la EPID con peor pronóstico. La sobrevida media de los pacientes posterior al diagnóstico es de 2 a 5 años⁷. La necesidad incrementada de identificar terapias clínicas efectivas para la FPI, finalmente ha conducido al desarrollo de diferentes ensayos clínicos en los cuales se ha evaluado la respuesta de drogas anti-inflamatorioso anti-fibróticos. Sin embargo, basados en la evidencia de los datos publicados, estos tratamientos no han demostrado mejorar la función pulmonar ni la sobrevida de los pacientes FPI^{8, 9}.
El diagnóstico de FPI requiere un patrón histopatológico y/o radiológico para definir si se trata de una de Neumonía Intersticial Usual (NIU). No hay disponible un marcador biológico disponible hasta ahora para este propósito.
Du Bois y sus colaboradores han estudiado en forma comparativa el recuento celular diferencial en el Lavado Broncoalveolar (LBA)de pacientes con FPI/NIU y Neumonía Intersticial no Usual (NINE)¹⁰. Ellos concluyeron que los hallazgos del LBA no poseen valor pronóstico y no permiten discriminar entre FPI/NIU y NINE. Por otra parte, Collard y sus colegas han descripto un aumento en los niveles de pepsina en el LBA de pacientes con FPI durante las exacerbaciones respecto de los pacientes estables. Sin embargo, los niveles de pepsina no poseen valor como predictores de tiempo de sobrevida¹¹. A pesar de estos hallazgos, la Sociedad Americana de Tórax ha publicado una nueva Guía revalorizando nuevamente el rol del LBA en el diagnóstico de las EPID¹².
El objetivo de este trabajo fue analizar el patrón inflamatorio del LBA en pacientes con EPID y comparar los resultados con un grupo control. Para esto se determinaron los niveles de citoquinas tales como IL-1ß, TNF-a, IL-6, IFN-? y IL-8. También se realizaron los recuentos de células totales en los LBA tanto de los pacientes como de los sujetos control. Hipotetizamos que el análisis de los niveles de citoquinas en el LBA podría contribuir a comprender el mecanismo inflamatorio que participa en el desarrollo de las EPID.

Materiales y métodos

Diseño del Estudio
Este estudio ha sido prospectivo y de corte transversal. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Rehabilitación Respiratoria María Ferrer, de acuerdo a los criterios éticos de la Declaración de k Helsinsi(1975) y sus correspondientes actualizaciones. Todos los pacientes y sujetos control firmaron voluntariamente el consentimiento informado.

Pacientes y controles
Pacientes con EPID: Se incluyeron, en este estudio, veintiocho adultos con EPID diagnosticados de acuerdo a los criterios establecidos por la Sociedad Americana de Tórax (American Thoracic Society: ATS) y por la Sociedad Europea Respiratoria Americana( European Respiratory Society:ERS)¹³. En todos los pacientes se confirmó el diagnóstico por el análisis histopatológico de las biopsias pulmonares. En todos los pacientes el LBA fue realizado en el lóbulo tomográficamente más afectado.
Grupo Control: El grupo control incluyó 15 adultos sin evidencia clínica de EPID, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma o infecciones activas. Las broncoscopias fueron realizadas como seguimiento de cirugías reparativas por estenosis traqueal post-intubaciones. Las muestras de LBA fueron colectadas del lóbulo medio.
Las características de los pacientes con EPID y de los sujetos control se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Características de los sujetos control y de los pacientes con EPID. Se analizaron 6 pacientes con FPI/NIU: Fibrosis Pulmonar Idiopática con patrón de Neumonía Intersticial Usual; 4 pacientes con NINE con patrónfibrótico en todos los casos: Neumonía Intersticial no Específica; 12 pacientes con NH: neumonitis por hipersensibilidad y finalmente 6 pacientes con Sarcoidosis. FVC: Capacidad vital forzada. TLC: Capacidad pulmonar total. DLCO: Capacidad de difusión pulmonar de monóxido de carbono. VA: Volumen alveolar y ND: valor no determinado. Los datos son presentados como la media y los cuartilos (25% and 75%).

Lavado Broncoalveolar(LBA)
El lavado broncoalveolar fue realizado como se ha descripto previamente¹⁴. Se instilaron, a través del broncoscopio, alícuotas de 20 ml de solución fisiológica a temperatura ambiente, alcanzando un volumen total de140 ml. Las mismas fueron recuperadas por succión manual suave utilizando jeringas estériles. Todas las alícuotas del LBA fueron juntadas en tubos y centrifugados a 400 g durante 10 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes acelulares se conservaron a -70 °C hasta su uso. El pellet celular fue lavado y la cantidad total de células del LBA fueron contadas utilizando una cámara de Neubauer.
Por otra parte, se conservaron muestras de suero luego de la realización de los análisis de rutina previos a la fibrobroncoscopía.

Test de Función Pulmonar
Los test de función pulmonar (TFP) incluyeron espirometrías y medición de volúmenes pulmonares por pletismografía. Los volúmenes pulmonares y la capacidad de difusión de monóxido de carbono (DLCO), fueron realizados de acuerdo a las recomendaciones de laATS/ERS. Para las mediciones de TFP se utilizó un pletismógrafo de volumen constante (Platinum Elite DL, Medical Graphics Corporation). Los valores normales predichos fueron referidos a los de Crapo^{15, 16}.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
Los niveles de las citoquinas (IL-1ß, IL-6, IL-8, IFN-gand TNF-a) fueron determinadas en muestras de LBA y sueropor ELISA (se utilizaron kit comerciales BD OptEIATM) y se siguieron las recomendaciones del fabricante. Los límites de detección son 0.8 pg/ml para IL-8 y IL1-ß; 2 pg/ ml para IL-6 y TNF- a y finalmente 1pg/ml para IFN-g.

Análisis estadístico
Las diferencias entre los grupos fueron evaluadas utilizando Test no paramétricos de Kruskall-Wallis y Test de comparaciones múltiples de Dunn. Los análisis y gráficos fueron realizados utilizando el software Graph-Pad Prism 4 (GraphPad, La Jolla, CA). Se consideró estadísticamente significativa una p<0.05.

Resultados

Recuento total celular en el LBA
Encontramos un incremento significativo en el número total de células en el LBA de los pacientes con EPID respecto de los sujetos control: Como mostramos en la Figura 1, el LBA de los pacientes con NINE, Sarcoidosis y NH contienen mayor número de células comparadas con los controles (0.93 ± 0.32 x 106 células/ml; 0.73 ± 0.13 x 106células/ml y 0.82 ± 0.28 x 106 células/ ml, respectivamente vs 0.19 ± 0.03 x 106 células/ ml; p < 0.05) pero no el LBA de los pacientes con FPI/NIU (0.31 ± 0.04 × 106 células/ml). No observamos diferencias estadísticamente significativas respecto del recuento celular total en el LBA cuando discriminamos los pacientes con EPID en relación al tabaquismo.

Figura 1. Aumento en el recuento total de células en el LBA de los pacientes con EPID comparados con los sujetos control. Observamos un significativo incremento en recuento celular total en los pacientes con NINE (n = 4), NH (n = 12) y Sarcoidosis (n = 6) respecto de los sujetos control (n = 15), *p<0.05. Sin embargo los pacientes con FPI/NIU (n = 6) no mostraron diferencias comparados con los controles.

Concentraciones de citoquinasde pacientes con EPID
Además analizamos los niveles de las citoquinas inflamatorias IL-1ß, IL-6, IL-8, IFN-? and TNF-a en muestras de LBA. No hubo diferencias entre las concentraciones de IFN-g, TNF-a o IL-1ß en el LBA de los pacientes con EPID comparados con los sujetos control (Figuras 2 A, B y C). Encontramos un significativo aumento en los niveles de IL-8, sólo en el LBA de los pacientes con FPI/ NIU comparado con los sujetos control (224.0 ± 56.3 pg/ml vs 75.8 ± 12.5 pg/ml; p < 0.05, Figura 2D). Los pacientes con NINE, NH y Sarcoidosis mostraron mayores de IL-6 en el LBA comparados con los controles (366.0 ± 80.2 pg/ml; p < 0.001; 163.4 ± 36.7 pg/ml; p < 0.05 y 233.9 ± 74.9 pg/ ml; p < 0.01 respectivamente vs15.86 ± 4.6 pg/ml (Figura 2E).

Figura 2. Concentraciones de citoquinas en muestras de LBA de pacientes con EPID. Los niveles de IFN-g(A), TNF-a (B), IL1-ß (C), IL-8 (D), y IL-6 (E) fueron analizadas por ELISA. *: p<0.05 y **: p<0.01.225

Cuando se realizó el análisis de los niveles de cada citoquina, discriminando por su estado fumador, no encontramos diferencias estadísticamente significativas.
En las muestras de suero no observamos diferencias significativas. Es más, los valores de TNF- a y de IL-1 ß estuvieron debajo del límite de detección del kit (datos no mostrados).

Relación entre los niveles de citoquinas en el LBA y los test de función pulmonar
Para determinar la relación entre los niveles de citoquinas y los parámetros de función pulmonar realizamos análisis de regresión lineal; sin embargo, no encontramos ninguna correlación entre los mismos.

Discusión
Las Enfermedades Pulmonares Intersticiales Difusas representan un heterogéneo grupo de enfermedades de baja incidencia caracterizadas por inflamación y fibrosis del parénquima pulmonar^{1, 5}. El LBA ha sido ampliamente utilizado para obtener información diagnóstica de estas enfermedades^{17, 18}. Sin embargo, esta información podría no ser específica. Por esta razón, no se han utilizado datos del LBA en ensayos clínicos controlados. Los hallazgos del LBA requieren ser analizados junto con una completa información clínica y tomografías computadas de tórax con alta resolución¹². Sólo en algunas EPID específicas, el reconocimiento de un patrón de células inflamatorias en el LBA (linfocítico, eosinofílico o neutrofílico) podrían contribuir con el diagnóstico diferencial de algunas enfermedades, pero estos patrones no son específicos¹⁹. A pesar de esto, nosotros hipotetizamos que el análisis de las citoquinas pro-inflamatorias en el LBA podría contribuir a comprender mejor los procesos inflamatorios asociados con los mecanismos patogénicos que contribuyen con el desarrollo de estas enfermedades. Estas citoquinas se sintetizan como resultado de la activación de diferentes tipo celulares, principalmente macrófagos y linfocitos, cuya plasticidad permiten la activación de distintos perfiles20. Los macrófagos alveolares, dada su localización privilegiada y el amplio conjunto de receptores que posee son capaces de censar las señales que los rodean; esto les permite la activación de una robusta respuesta inmune frente a la presencia de un microorganismo pero también la activación de una respuesta inflamatoria frente a señales de daño tisular21. Se ha descripto recientemente que algunas microinjurias que actúan sobre el epitelio pulmonar podrían producir señales de daño que favorezcan la activación de diferentes perfiles de activación del sistema inmune, contribuyendo a exacerbar la respuesta inflamatorio o la fibrosis asociada a las EPID²².
De acuerdo con nuestros resultados, ha sido previamente descripto un aumento significativo en los niveles de IL-8 en muestras de LBA de pacientes con FPI^{23, 24}. Más aún, Carré y sus colaboradores, mostraron que los macrófagos alveolares aislados a partir de LBA de pacientes con FPI, producen mayores niveles de IL-8 que los macrófagos alveolares de sujetos sanos²⁵. Esta citoquina ha sido reportada como una de las moléculas relevantes en los procesos fibróticos por su rol como quimioatracción de neutrófilos y el potencial daño tisular generado por este tipo celular²⁶.
También, encontramos un aumento significativo en los niveles de IL-6 y en el número total de células en el LBA de los pacientes con NINE, NH y sarcoidosis pero no en los pacientes con FPI/ NIU; sin embargo, sería necesario incrementar el número de pacientes para confirmar estos hallazgos. IL-6 es una citoquina pro-inflamatoria con un amplio rango de funciones biológicas tales como la inducción de una respuesta de fase aguda²⁷. No obstante, sólo se ha reportado un incremento de IL-6 en LBA de pacientes con neumoconiosis²⁸. Nosotros encontramos un incremento significativo en IL-6 en las muestras de LBA de todas las EPID, pero no en el LBA de pacientes con FPI/ NIU. Estos hallazgos podrían estar asociados con diferentes mecanismos patológicos involucrados en el desarrollo de las mismas.
En el pasado, el análisis de los hallazgos en la celularidad del LBA era incluida dentro de los criterios menores y mayores clínicos de diagnóstico de FPI cuando no se realizaba biopsia pulmonar²⁹. Sin embargo, desde que poseen valor predictivo los hallazgos de la tomografía computada de tórax con alta resolución para la FPI con patrón de NIU, el diagnóstico de FPI/NIU ha sido confiado a los expertos radiólogos y los procedimientos invasivos, incluyendo broncoscopias, BAL y biopsias pulmonares han dejado de ser requeridos para el diagnóstico de la FPI^{30, 31}.
Diferentes factores ambientales u ocupacionales, drogas, radiaciones o infecciones y enfermedades del colágeno podrían estar asociados con las EPID. Empero, muchas de ellas, son idiopáticas4. Los mecanismos subyacentes de la patogénesis de ciertas EPID son poco comprendidos. En este estudio analizamos si las citoquinas inflamatorias podrían estar involucradas. Las diferencias observadas en este trabajo, podrían sugerir que los mecanismos inflamatorios que contribuyen al desarrollo de la FPI/NIU podrían resultar diferentes al resto de las EPID.

Conclusiones

Las EPID constituyen un conjunto de enfermedades agrupadas como tales por compartir características clínicas y radiológicas; sin embargo, los mecanismos fisiopatológicos que participan en sus orígenes son diferentes. Esta heterogeneidad va de la mano con las diferentes necesidades terapéuticas. Comprender mejor los mediadores biológicos que participan en cada una podría contribuir a futuro, a generar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas.

Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses existentes en el desarrollo de este trabajo.

Bibliografía

1. King TE Jr. Clinical advances in the diagnosis and therapy of the interstitial lung diseases.Am J Respir Crit Care Med 2005; 172: 268-279.         [ Links ]

2. Kim R, Meyer KC.Therapies for interstitial lung disease: past, present and future. Ther Adv Respir Dis 2008; 2: 319-338.         [ Links ]

3. Nathan SD, Shlobin OA, Weir N, et al. Long-term course and prognosis of idiopathic pulmonary fibrosis in the new millennium. Chest 2011; 40: 221-229.         [ Links ]

4. Selman M, King TE, Pardo A; American Thoracic Society, European Respiratory Society and American College of Chest Physicians. Idiopathic pulmonary fibrosis: prevailing and evolving hypotheses about its pathogenesis and implications for therapy. Ann Intern Med 2001; 134: 136-151.         [ Links ]

5. Strieter RM. Pathogenesis and natural history of usual interstitial pneumonia: the whole story or the last chapter of a long novel. Chest 2005; 128 (Suppl 1): 526S-532S.         [ Links ]

6. Vasakova M, Sterclova M, Kolesar L, et al. Bronchoalveolar Lavage Fluid Cellular Characteristics, Functional Parameters and Cytokine and Chemokine Levels in Interstitial Lung Diseases. Scand J Immunol 2009; 69: 268-274.         [ Links ]

7. Raghu G, Collard HR, Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/ JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management. Am J Respir Crit Care Med 2011; 183: 788-724.         [ Links ]

8. McGrath EE, Millar AB.Hot off the breath: triple therapy for idiopathic pulmonary fibrosis-hear the PANTHER roar. Thorax 2012; 67: 97-98.         [ Links ]

9. Raghu G, Anstrom KJ, King TE Jr, et al. Prednisone, azathioprine, and N-acetylcysteine for pulmonary fibrosis. Idiopathic Pulmonary Fibrosis Clinical Research Network. N Engl J Med 2012; 366: 1968-1977.         [ Links ]

10. Veeraraghavan S, Latsi PI, Wells AU, et al. BAL findings in idiopathic nonspecific interstitial pneumonia and usual interstitial pneumonia. Eur Respir J 2003; 22: 239-244.         [ Links ]

11. Lee JS, Song JW, Wolters PJ, Elicker BM, King TE Jr, Kim DS, Collard HR. Bronchoalveolar lavage pepsin in acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis. Eur Respir J 2012; 39: 352-358.         [ Links ]

12. Meyer KC, Raghu G, Baughman RP, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med 2012; 185: 1004-1014.         [ Links ]

13. American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias. This joint statement of the American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS) was adopted by the ATS board of directors, June 2001 and by the ERS Executive Committee. Am J Respir Crit Care Med 2002; 165: 277-304.         [ Links ]

14. Consenso de la Asociación Argentina de Broncoesofagología para la realización de Fibrobroncoscopia. Med Resp 2009; 9: 196-209.         [ Links ]

15. Miller MR, Hankinson J, Brusasco V et al. Standardisation of spirometry. Eur Respir J 2005; 26: 319-338.         [ Links ]

16. Macintyre N, Crapo RO, Viegi G et al. Standardisation of the single-breath determination of carbon monoxide uptake in the lung. Eur Respir J 2005; 26: 720-735.         [ Links ]

17. Wells AU. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in diffuse parenchymal lung disease. Eur Respir Rev. 2010; 19(117): 237-241.         [ Links ]

18. Domagala-Kulawik J, Skirecki T, Maskey-Warzechowska M, et al. Bronchoalveolar lavage total cell count in interstitial lung diseases-does it matter? Inflammation. 2012; 35 (3): 803-809.         [ Links ]

19. Meyer KC, Raghu G. Bronchoalveolar lavage for the evalua-tion of interstitial lung disease: is it clinically useful?. Eur Respir J 2011; 38: 761-769.         [ Links ]

20. Wynn AT. 2004. Fibrotic disease and the Th1/Th2 paradigm. Nat Rev Immunol 2004; 4: 583-594.         [ Links ]

21. WickG, Backovic A, Rabensteiner E, et al. The immunology offibrosis: innate and adaptive responses. Trends Immunol 2010; 31: 110-119.         [ Links ]

22. Ellson CD, Dunmore R, Hogaboam CM, et al. DAMPs and Danger Signals in IPF. Am J RespirCell Mol Biol. 2014 [En proceso de publicación].         [ Links ]

23. Meloni F, Caporali R, Marone Bianco A, et al. BAL cytokine profile in different interstitial lung diseases: a focus on systemic sclerosis. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis 2004; 21: 111-118.         [ Links ]

24. Carré PC, Mortenson RL, King TE Jr, et al. Increased expression of the interleukin-8 gene by alveolar macrophages in idiopathic pulmonary fibrosis. A potential mechanism for the recruitment and activation of neutrophils in lung fibrosis. J Clin Invest 1991; 88: 1802-1810.         [ Links ]

25. Gadek, JE, Kelman JA, Fells G, et al. Collagenase in the lowerrespiratory tract of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. N Eng J Med 1979; 301: 737-742.         [ Links ]

26. Hunninghake GW, GadekJ, and Lawley T. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. J Clin Invest 1982; 68: 259-269.         [ Links ]

27. Naka T, Nishimoto N, and Kishimoto T. The paradigm of IL-6: from basic science to medicine. Arthritis Res 2006; 4 (Suppl 3): S233 and S242.         [ Links ]

28. Ulker O, Yucesoy B, Demir O, et al. Serum and BAL cytokine and antioxidant enzyme levels at different stages of pneumoconiosis in coal workers. Hum ExpToxicol 2008; 27(12): 871-877.         [ Links ]

29. International consensus statement. American Thoracic Society (ATS) and the European Respiratory Society (ERS). American Thoracic Society. Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and treatment. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 646-664.         [ Links ]

30. Travis WD, Costabel U, Hansell DM, et al. An official American Thoracic Society/European Respiratory Society statement: Update of the international multidisciplinary classification of the idiopathic interstitial pneumonias. Am J Respir Crit Care Med 2013; 188: 733-748.         [ Links ]

31. Raghu G. Idiopathic pulmonary fibrosis: guidelines for diagnosis and clinical management have advanced from consensus-based in 2000 to evidence-based in 2011. Eur Respir J 2011; 37: 743-746.         [ Links ]227