Modelos animales: desarrollo de la línea de ratones congénicos BALB/c.Cg-Ctsl^nkt

Fabricio Maschi¹, Miguel Ayala¹, Fernando Benavides² y Cecilia Carbone¹.

¹Cátedra de Animales de Laboratorio y Bioterio, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP Calles 60 y 118 s/n (1900) La Plata, Argentina.
²The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Science-Park Research Division, 1808 Park Road 1C, Smithville, TX 78957. USA

fmaschi@fcv.unlp.edu.ar

RESUMEN

En los últimos 40 años, el desarrollo de modelos murinos ha posibilitado realizar avances trascendentes en el estudio y terapéutica de muchas enfermedades humanas y animales. Por otro lado, el empleo de retrocruzas ha permitido crear animales congénicos, resultado de transferir una mutación a otro fondo genético (otra cepa de ratones). La mutación espontánea recesiva nackt (símbolo nkt) fue descubierta en el año 1981 y se caracteriza por ratones parcialmente inmunodeficientes (el desarrollo de los linfocitos T CD4 se encuentra alterado), que además presentan defectos en el crecimiento del pelo y prurito crónico. El gen afectado fue inicialmente localizado en el cromosoma 13 del ratón y luego identificado como un alelo nulo de la catepsina L (nomenclatura: Ctsl^nkt). El objetivo de este trabajo fue desarrollar la línea congénica BALB/c-nkt, introduciendo esta mutación en la línea consanguínea BALB/c. Se recibió un grupo de ratones BALB/c;129S2 parcialmente congénicos (N3) para la mutación nackt, y se continuó con la producción de esta cepa congénica hasta la generación N10, utilizando retrocruzas seguidas de intercruza y selección de ratones mutantes. Esta cepa congénica completa (del inglés full congenic) en fondo BALB/c (denominada BALB/c.Cg-Ctsl^nkt) incorporó una porción pequeña del cromosoma donante portando la mutación nackt. Esta cepa congénica, actualmente disponible en nuestro país, representa una importante herramienta para estudios de inmunología, como modelo animal en estudios de dermatología y un modelo knock-out espontáneo para el gen de la catepsina L.

SUMMARY

In the last 40 years, the development of murine models has made possible remarkable achievements in the study and the therapeutic of many human and animal diseases. On the other hand, the use of backcross programs has allowed the development of congenic strains of rodents, that is the introgression of a mutation onto a recipient genetic background. The spontaneous nackt mutation (nkt) is characterized by impaired CD4 T-cell development and generalized alopecia, due to abnormal epidermal differentiation and hair follicle cycling. The introgression of this locus onto BALB/c, one of the most widely used mouse inbred strains, made possible the development of a new murine model. The objective of this work was to develop a full congenic BALB/c-nkt (nomenclature: BALB/c.Cg-Ctsl^nkt) through repeated backcross-intercross rounds. The development of this congenic strain was continued until the N10 generation, where the introgressed segment of the donor chromosome carrying the mutation is supposed to be very small. This congenic strain, available in our country, represents an important tool for immunology and dermatological studies and represents a spontaneous knock-out animal model for the cathepsin L gene.

Palabras Claves: Modelos animales; Nackt; Ratón inmunodeficiente; Epidermis; Folículo piloso; Catepsina L

INTRODUCCIÓN

En los últimos 40 años, el desarrollo de modelos murinos ha posibilitado realizar avances trascendentes en el estudio y terapéutica de muchas enfermedades humanas y animales (Silver 1995; Benavides y Guénet 2003). La reciente explosión de nuevas tecnologías de manipulación genética y reproductivas ha producido una revolución en la obtención de dichos modelos murinos. Estos animales genéticamente modificados representan una gran ventaja, considerándose como una herramienta de mayor precisión que permite traspolar los resultados de los estudios sobre enfermedades tales como Alzheimer, Parkinson y esclerosis múltiple, entre otras (Bedell y col., 1997).
Desde que George Snell, en el año 1948, desarrolló sus trabajos para estudiar el complejo mayor de histocompatibilidad en ratones (H2), las metodologías reproductivas para trasladar un locus de interés a líneas de ratones establecidas han permitido desarrollar varios de estos modelos. Uno de estos métodos es la creación de una serie de líneas con variantes genéticas propias, entre las cuales se encuentran las congénicas. Estas últimas son el resultado de transferir una mutación de interés, por medio de la reproducción sexual, a otro fondo genético, normalmente a una cepa de ratón consanguínea. El desarrollo de estas líneas es esencial para estudiar tanto el efecto de las mutaciones espontáneas como el de las inducidas o de aquellas producidas por manipulación genética, ya que permite mantener la mutación en una cepa consanguínea definida aumentando la uniformidad genotípica y reduciendo la variabilidad genética, además brinda la posibilidad de identificar y analizar genes modificadores que pueden estar presentes en una cepa endocriada; y sirve como control para estudios comparativos entre animales de la misma cepa.
Cuando una mutación se manifiesta fenotípicamente, su estudio es fácilmente realizable ya que los individuos portadores de la misma se identifican rápidamente. La mutación recesiva y espontánea nackt (símbolo: nkt) es una entre miles que existen en el ratón de laboratorio. Se trata de una mutación pleiotrópica donde los individuos homocigotos (nkt/nkt) tienen afectado el crecimiento del pelo observándose parches de piel desnuda y zonas de piel áspera alrededor de los ojos y el cuello, también manifiestan un prurito crónico a lo largo de toda su vida. El desarrollo de los linfocitos T se ve también afectado, presentando una deficiencia marcada de células CD4+ 8_T en el timo y una disminución importante de células CD4+ T en los órganos linfáticos periféricos (Benavides F. et al, 1999).
La mutación nackt apareció en el bioterio de la Martin Luther Universität en Halle-Wittenberg, Alemania, en el año 1981 en un stock moderadamente endocriado derivado del ratón irradiado N 372. En 1991 se introdujo una pareja de estos ratones mutantes en el Instituto Pasteur de Francia y se cruzó con la cepa 129/Sv//Pas por unas pocas generaciones designándolos como NKT/Pas para posteriormente realizar intercruzas.
Los trabajos realizados por el laboratorio del Dr. Benavides han puesto en evidencia que la mutación nackt (nkt) involucra una deleción de 118 pares de bases en la secuencia del cDNA del gen de la catepsina L (Ctsl); por esta razón la mutación ahora se designa como Ctsl^nkt (Benavides y col., 2001). La catepsina L tiene un rol importante en la selección de los linfocitos CD4+ T en el timo, en la diferenciación de la epidermis y en los ciclos del folículo piloso, entre muchas otras funciones (Nakagawa y col., 1998; Benavides y col., 2002; Lombardi y Col., 2005).
La transferencia de este alelo mutado a una de las cepas de ratones que más se utiliza, como es BALB/c, posibilitaría la obtención de un nuevo modelo murino que posea la mayoría de las características correspondientes a su fondo genético sobre el cual se hayan evaluado los resultados de las pruebas. El objetivo de este trabajo fue desarrollar la línea congénica BALB/c-nkt, a partir de la introducción de esta mutación en la línea consanguínea BALB/c.

MATERIALES Y MÉTODOS

El bioterio del Instituto de Investigaciones Hematológicas de la Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires recibió un núcleo de ratones NKT/Pas proveniente del Instituto Pasteur de Francia con el objeto de comenzar con la producción de líneas congénicas transfiriendo la mutación nkt a las cepas BALB/c, C57BL/6 y DBA/2. Debido a una contaminación microbiológica en estos ratones, un grupo se envió al Bioterio de la FCV - UNLP para eliminar los microorganismos patógenos que los afectaban y posibilitar la continuación del trabajo.
En las instalaciones del Bioterio de la Cátedra de Animales de Laboratorio de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNLP), se programó y realizó una derivación por histerectomía de los ratones BALB/c-nkt (N3), con la finalidad de eliminar los patógenos que los afectaban y obtener ratones libres de patógenos específicos (del inglés specific pathogen free, SPF). Se utilizaron como control ratones centinelas de la cepa inmunodeficiente nude (N:NIH(S)-nu/nu), los que se pusieron en contacto con los ratones derivados sometidos a la histerectomía durante un mes. Luego se realizó un control microbiológico completo de los centinelas para confirmar su estado sanitario.
Para producir la cepa congénica BALB/c.Cg- Ctsl^nkt se usó un esquema de retrocruzas seguido de intercruzas hasta llegar a la generación N10. Se considera que este número de retrocruzas es el adecuado para que la cepa de fondo incorpore una porción pequeña del cromosoma de la cepa donante portando la mutación (Silver 1995; Benavides y Guénet 2003). Debemos aclarar que el gen mutado se encuentra comprendido en un segmento cromosómico cuyo tamaño se reduce, generación tras generación a causa de las recombinaciones cromosómicas. El porcentaje del genoma de la línea donante que aún persiste en el genoma receptor se calcula por la formula: 1/2ⁿ (donde n = número de generaciones de retrocruza). En la actualidad, existen metodologías para acelerar este proceso por medio del uso de marcadores genéticos -como los microsatélites de ADN- para seleccionar, en cada generación de retrocruza, los animales con mayor porcentaje de fondo genético de la cepa receptora (Wong y col., 2002).
En cada generación de intercruza se seleccionaron los animales mutantes (homocigotas nkt/nkt) por su fenotipo de piel, por lo que un animal homocigota para la mutación siempre se cruzó con un ejemplar puro de la línea de fondo, en este caso la BALB/c (Figura 1).

La figura 1 muestra el esquema de retrocruzas seguido de intercruza para la creación de la cepa congénica portando la mutación nackt. En cada generación, empezando por la F1, es necesario intercruzar los heterocigotos +/nkt para producir ratones nkt/nkt, los cuales son cruzados por BALB/c puros.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Luego de 10 generaciones de retrocruzas (N10) se infiere que la cepa BALB/c ha incorporado una porción pequeña del cromosoma 13 de la cepa donante (estimativamente un 0,1 % del genoma de la línea donante), portando la mutación nackt. La producción de esta cepa congénica ha llevado 5 años desde su inicio. A partir de la N10 se prosiguió manteniendo la cepa congénica BALB/c.Cg-Ctsl^nkt utilizando el manejo establecido para líneas endocriadas alcanzando la generación N10 F3 en condiciones SPF en el Bioterio de la FCV UNLP.
Se observó que los BALB/c.Cg-Ctsl^nkt tienen un desarrollo normal con pelo hasta los 12 días de edad, a partir del cual el mismo se presenta en forma de parches de aspecto rugoso y los animales comienzan a manifestar un prurito intenso. Como característica particular presentaron alopecia difusa en la región de cuello y alrededor de las orbitas (Figura 2A). Los individuos adultos mantenidos en ambientes convencionales desarrollaron ocasionalmente lesiones de piel ulcerativas asociadas con aumento del tamaño de los nódulos linfáticos del cuello e intercostales (Figura 2B). En algunos de estos ratones también se puedo observar opacidad de la córnea (datos no mostrados).

También se confirmó que los BALB/c.Cg- Ctsl^nkt de ambos sexos son fértiles cuando se los mantiene en condiciones SPF presentando parámetros bioquímicos y hematológicos normales (datos no mostrados).
Esta cepa congénica que actualmente se mantiene y está disponible en nuestro país representa no sólo una importante herramienta para estudios de inmunología sino también para utilizarse como modelo animal en estudios del desarrollo de los linfocitos T CD4, la epidermis y el ciclo del folículo piloso. Asimismo, representa un modelo knock-out espontáneo para el gen de la catepsina L (Benavides F. et al, 2001 y 2002).
En este sentido se puede considerar de gran importancia la identificación de mutaciones en colonias de ratones de experimentación y su posterior mantenimiento en fondos genéticos definidos lo cual permitiría obtener nuevos modelos murinos destinados a la investigación biomédica.

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