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BAG. Journal of basic and applied genetics

versión On-line ISSN 1852-6233

BAG, J. basic appl. genet. v.20 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./jun. 2009

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Rol de la calpastatina en la variabilidad de la terneza de la carne bovina

Role of calpastatin in the variability of beef tenderness

Motter, MM1, Corva, P2; Krause, M, Perez Cenci M y L. Soria.1

1Área Genética, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
2Departamento de Producción Animal. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina

Correspondencia a: Mariana M. Motter, Área Genética Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Chorroarín 280 (1427) Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina, Tel/Fax: 54 (11) 4524-8474

E-mail: marianamotter@hotmail.com

Calpastatina y terneza de la carne bovina

Calpastatin and beef tenderness

RESUMEN

La calpastatina es una enzima inhibidora de las calpaínas, principales enzimas proteolíticas del músculo esquelético. Está codificada por el gen CAST, a partir del cual se pueden expresar cuatro isoformas proteicas diferentes debido a la existencia de cuatro promotores distintos. Este gen ha sido estudiado como candidato para explicar diferencias de origen genético en la terneza de la carne. En bovinos se han descripto varios polimorfismos del tipo SNP en distintas regiones del gen. Algunos de ellos han sido incluidos en test comerciales por su asociación significativa con la variabilidad en terneza. Recientemente, la investigación se ha focalizado en establecer qué promotores están activos en músculo esquelético y si los mismos presentan polimorfismos funcionales que se asocien con la variabilidad en terneza.

PALABRAS CLAVE: Calpastatina; Gen CAST; Bovinos; Terneza; SNP.

SUMMARY

Calpastatin is a specific inhibitor of calpains, the main proteolytic enzymes of muscle. Calpastatin is encoded by the CAST gene, from which four different protein isoforms can be expressed due to the existence of four different promoters. This gene has been studied as a candidate to explain genetic differences in meat tenderness. In beef cattle, several single nucleotide polymorphisms (SNP) have been identified in different regions of the CAST gene. Some of them have been included in commercial tests because of their association with the variability in beef tenderness. Recently, research has focused on the regulation of different promoters in skeletal muscle and whether they have functional polymorphisms that are associated with the variability in tenderness.

KEYWORDS: Calpastatin; CAST gene; Cattle; Beef tenderness; SNP.

INTRODUCCIÓN

Ya hace varios años se ha propuesto que la información disponible a nivel genómico va a modificar drásticamente la forma en la que se seleccionan los animales domésticos. Actualmente la selección se realiza mediante una combinación de apreciación visual de los reproductores, registros productivos y la estimación de mérito genético a través de metodologías de genética cuantitativa. Ahora, la identificación de los genes que influyen sobre las características de importancia económica, la construcción de mapas genéticos y el conocimiento de la secuencia completa del genoma bovino, permitirán identificar las variantes o polimorfismos a nivel del ADN (genotipo) que se asocien con diferencias de expresión de una característica productiva.
La información molecular permitirá realizar la selección genotípica prescindiendo de información fenotípica del animal evaluado y esto es particularmente importante para características que se expresan en un solo sexo, lo hacen tardíamente o son difíciles y costosas de medir.
En producción de bovinos, la terneza de la carne es un atributo muy importante porque es muy valorado por los consumidores. Hasta ahora, la terneza no puede cuantificarse antes de la faena del animal debido a que requiere técnicas destructivas para hacerlo. Además de los múltiples factores ambientales que la afectan (sexo, edad, alimentación y manejo, entre otros), también depende de la magnitud de la proteólisis de las proteínas miofibrilares, proceso que se produce durante los primeros 3 ó 4 días postmortem.
El objetivo de este trabajo es hacer una revisión sobre el estado del conocimiento acerca de la calpastatina. Dicha enzima forma parte del sistema de proteínas activadas por Ca2+ responsable de la tiernización postmortem de la carne. Es inhibidora de la calpaínas, enzimas responsables de la proteólisis postmortem de las proteínas del músculo. Por ello se ha considerado al gen que la codifica (gen CAST) un candidato para terneza, identificándose en él diferentes polimorfismos, para alguno de los cuales incluso están disponibles pruebas comerciales.

ESTRUCTURA DE LA CALPASTATINA

La calpastatina aislada de músculo esquelético de bovino tiene 706 aminoácidos (Killefer et al., 1994) y está organizada en cuatro dominios (I a IV) formados por secuencias repetidas de 140 aminoácidos, entre los cuales existe una homología del 23 al 36%. Cada dominio contiene tres subdominios (A, B y C), a través de los cuales se une a las calpaínas. El subdominio B posee alta homología entre especies y es esencial para la actividad inhibitoria (Goll et al.,2003). Se ha demostrado que el tetrapétido Glu10, Leu11, Gly12, Lys13 del subdominio IB de calpastatina forma un loop que es esencial para la unión a la μ-calpaína (Pfizer et al., 2008).
Además de los cuatro dominios con acción directa sobre las calpaínas, la calpastatina presenta un dominio en el extremo NH2 denominado L, el que no tiene acción directa sobre las calpaínas, pero determina la localización de la enzima en la célula (De Tullio et al., 2009) Según estudios realizados en músculo cardiaco de cerdo, dicho domino actúa reprimiendo parcialmente la entrada de Ca2+ a la célula (Minobe et al., 2006).
La enzima aislada de hígado y corazón bovino tiene un dominio más, denominado región XL, el cual está formado por 68 aminoácidos. Dicho dominio contiene tres sitios potenciales de fosforilación por kinasas (Cong et al., 1998).
Existen distintas isoformas de esta enzima, las cuales se denominan tipo I, II, III y IV (Figura 1). Las tres primeras han sido aisladas en músculo esquelético, músculo cardíaco e hígado. La tipo IV sólo se expresa en testículo (Goll et al., 2003).


Figura 1. Los cuatro tipos de calpastatina aislada de diferentes tejidos bovinos.
XL, L y I a IV corresponden a cada dominio. A, B y C son los tres subdominios. Con números se indican aminoácidos. (* * *) Sitios fosforilados por proteinkinasas (Adaptada de Raynaud et al., 2005b).

SISTEMA CALPAÍNA-CALPASTATINA

Diversos estudios cinéticos han demostrado que la calpastatina es un inhibidor competitivo de dos proteasas dependientes de Ca2+, la μ-calpaína y la m-calpaina (Eimori et al., 1988). Las calpaínas, principales enzimas proteolíticas del músculo (Killefer et al., 1994), son heterodímeros compuestos por la misma subunidad pequeña (28 kDa) y diferente subunidad grande. La subunidad pequeña (con función regulatoria) contiene dos dominios denominados: DV y DVI y la subunidad grande (con función catalítica) comprende cuatro dominios: DI, D II, D III y DIV. La subunidad grande posee una homología del 55-65% entre ambas calpaínas (μ-calpaína y m-calpaína) (Sorimachi y Suzuki 2001).
En presencia de Ca2+ una molécula de calpastatina puede inhibir hasta cuatro moléculas de calpaína (Cong et al., 1998). Este ión es esencial para que esta interacción se produzca, ya que en presencia del mismo se forman α-hélices en los subdominios A y C de la calpastatina (Yang et al., 1994) y se evidencian estructuras abiertas en la superficie de los dominios IV y VI de las calpaínas, promoviendo la interacción entre ambas proteínas (Todd et al., 2003) los subdominios A (Ser15 a Gly29) y C (Ile90 a Thr109) de la calpastatina se asocian a los dominios IV y VI de las calpaínas respectivamente, quedando el subdominio B próximo al sitio activo de las calpaínas (IIa y/o IIb) bloqueando el acceso de los sustratos al mismo (Figura 2). (Pfizer et al., 2008, Kiss et al., 2008).


Figura 2. Interacción entre calpastatina y μ-calpaína.
IV y VI: dominios de la μ-calpaina en contacto con los subdominios A y C respectivamente de la calpastatina. El subdominio B de la calpastatina interactúa con los dominios I y II de la μ-calpaína (adaptada de Kiss et al., 2008)

ACTIVIDAD DE LA CALPASTATINA EN EL MÚSCULO ESQUELÉTICO

En el animal vivo, el sistema calpaina/calpastatinadel músculo estriado participa en el crecimiento, fusión y diferenciación de los mioblastos (Goll et al.,1992). Después de la muerte este sistema es el principal responsable de la tiernización de la carne (Koohmaraie, 1994). Esta última función es la que ha concitado la atención desde el punto de vista de la calidad de la carne vacuna.
Las calpaínas producen la desorganización de la estructura del tejido muscular por proteólisis, fundamentalmente de las costámeras y filamentos intermedios de desmina después de la muerte y la calpastatina interfiere con este proceso por ser el inhibidor de las enzimas proteolíticas que lo producen (Koohmaraie, 1994, Taylor et al., 1995).
Estudios realizados en células humanas indican que la calpastatina y las calpaínas están localizadas en distintos compartimentos intracelulares. La calpastatina se acumula cerca del núcleo en estructuras granulares sin membranas. En cambio, las calpaínas se localizan en forma difusa en el citosol. La entrada de Ca2+ a la célula modifica la localización intracelular de ambas enzimas. El Ca2+ se une a las calpaínas, provocando que éstas se asocien a la cara interna de la membrana plasmática para captar más Ca2+. En cambio, la calpastatina difunde al citosol contrarrestando el efecto proteolítico de las calpaínas (De Tullio et al., 1999).
Durante varias décadas la industria de la carne, en busca de aumentar la eficiencia productiva, ha utilizado aditivos dietarios que aumenten la ganancia de masa muscular, un ejemplo de estos son los β-agonistas (Ricks et al., 1984). Sin embargo se ha demostrado que influyen negativamente en la terneza de la carne, debido a que provocan reducción de la actividad de la μ-calpaina (Gessink et al., 1993) y el incremento de actividad de la calpastatina (Wheeler and Koohmaraie, 1992). Los β-agonistas se unen a receptores β-adrenergicos de las membranas celulares activando las proteinkinasas dependientes de AMPc. Las proteinkinasas aumentan el nivel de expresión del gen de la calpastatina por incremento de la trascripción del mismo. Por otro lado fosforilan el dominio XL (Cong et al., 1998) y/o el domino L de la proteína, cuando el domino L está fosforilado la enzima se acumula como agregados enzimáticos inactivos (De Tullio et al., 2009), el aumento de Ca2+ intracelular induce la liberación de calpastatina de estos agregados a través de la acción de fosfatasas, permitiendo que la misma ejerza su actividad inhibitoria sobre las calpaínas (Averna et al., 2001).
Después de la muerte, el músculo deja de recibir oxígeno. En estas condiciones las reacciones metabólicas se modifican, produciéndose ácido láctico a partir de glucógeno. La acumulación de ácido láctico hace descender el pH de 7 hasta 5,4 ó 5,8 en un tiempo que va desde las 15 a las 36 hs postmortem. Este descenso del pH junto con la baja temperatura (4 a 5°C) a la cual se almacena la carne, favorece la acción de las calpaínas (Koohmaraie, 1992, Rhee et al., 2006).
Durante las primeras 72 hs de almacenamiento de la carne se produce hasta el 80% de la tiernización máxima posible por efecto de la proteólisis postmortem del músculo y este efecto está relacionado con alta actividad de la μ-calpaína y baja actividad de la calpastatina (Koohmaraie, 1996, Kent et al., 2004, Geesink et al., 2006).
La calpastatina se degrada casi completamente durante los primeros 7 días postmortem, y la actividad de dicha enzima desciende al 20-30% de su nivel original durante este período (Boehm et al., 1998, Rhee et al., 2006).
Muchos trabajos coinciden en que la concentración de calpastatina al momento de la muerte del animal es uno de los factores que afecta la calidad de la carne. Si al momento del sacrificio los niveles de calpastatina son altos, la carne será menos tierna (Sensky et al., 2001).
La magnitud de la proteólisis postmortem determina la terneza de la carne(Geesink et al., 1999) y este proceso también está asociado a la raza del animal. La carne de animales Bos indicus generalmente posee menor terneza que la obtenida de animales de razas Bos taurus (Whipple et al., 1990; Shackelford et al., 1995; Wulf et al., 1996). Consistentemente en animales cruza a medida que aumenta la proporción de genética de origen índico en un animal disminuye la terneza de la carne, lo que se relaciona con mayor actividad de calpastatina y menor actividad de μ-calpaína (Pringle et al., 1997). Esta evidencia de efectos genéticos entre razas se aplica también a la variación intrarracial y puede ser justificado por diferencias a nivel molecular (en el ADN).

ESTRUCTURA DEL GEN DE LA CALPASTATINA

El gen que codifica a la calpastatina (gen CAST) se localiza en el cromosoma 7 del bovino (Bishop et al., 1994) y está organizado en 35 exones y sus respectivos intrones, abarcando aproximadamente 130 kb. Esta estructura es similar en cerdo, ratón y humano (Raynaudet al., 2005b).
Las diferentes isoformas de calpastatina se originan por la existencia de cuatro promotores, los cuales se localizan en el extremo 5` de los exones 1xa, 1xb, 1u y 14t de dicho gen, a partir de los cuales se sintetizan las isoformas I, II, II y IV de la enzima, respectivamente (Figura 3). Los ARN mensajeros sintetizados a partir de los promotores 1xa y 1xb son los de mayor longitud en el extremo 5’ y presentan la secuencia que codifica al dominio XL. Los tres promotores activos en músculo esquelético (I, II y III) han sido secuenciados (Nº de acceso al GenBank: AY834765 y AY834768), se localizan en los exones 1xa, 1xb, 1u y miden 729, 937 y 1072 pb respectivamente (Raynaudet al., 2005a). Se han identificado diferentes sitios potenciales de unión a factores de transcripción (TFBS, del inglés Transcription Factor Binding Site) en los promotores del gen CAST bovino, principalmente sitios GATA-1, SRY, SP1 AP-1 y NFkB (Raynaud et al., 2005a). Cong (1998) describe sitios CRE en CAST que se localizan en el promotor II reportado por Raynaud et al., (2005 a).


Figura 3. Estructura del gen de la calpastatina bovina y de los diferentes tipos de ARNm aislados. Las flechas indican la posición de cada uno de los cuatro promotores. ATG y TAA corresponden a las secuencias para codones de inicio y stop respectivamente (Adaptada de Raynaud et al.,2005 a y b)

Se han identificado diferentes sitios potenciales de unión a factores de transcripción (TFBS, del inglés Transcription Factor Binding Site) en los promotores del gen CAST bovino, principalmente sitios GATA-1, SRY, SP1 AP-1 y NFkB (Raynaud et al., 2005a). Cong (1998) describe sitios CRE en CAST que se localizan en el promotor II reportado por Raynaud et al., (2005 a).

POLIMORFISMOS IDENTIFICADOS EN EL GEN DE LA CALPASTATINA

Hasta el momento se han identificado varios polimorfismos del tipo SNP (del inglés Single Nucleotide Polymorphism) en el gen CAST, algunos de los cuales han sido asociados significativamente con variabilidad en la terneza de la carne bovina.
La identificación de polimorfismos en nucleótidos simples (SNP) permite que los genetistas puedan estudiar la posible asociación de los mismos con caracteres de importancia económica. Esta información molecular permitiría realizar selección directamente por el genotipo (SAM, Selección Asistida por Marcadores), lo que es muy valioso en rasgos cuantitativos de difícil medición como es el caso de la terneza.
Lonergan et al (1999) y Chung et al (1999) realizaron los primeros estudios de asociación entre polimorfismos del gen CAST y la variabilidad en terneza, sin resultados favorables. En el primer trabajo se analizó la asociación de polimorfismos anónimos en el largo de los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés Restriction Fragment Lenght Polymorfism) con la actividad de dicha enzima. En cambio, Chung et al (1999), analizaron la asociación entre los polimorfismos en la conformación de la cadena simple de ADN (SSC, del inglés Single Strand Conformation) con la resistencia al corte (RC, medida objetiva de la terneza determinada por la cizalla de Warner Bratzler), el índice de fragmentación de miofibrillas y la actividad de la enzima.
Más tarde, Barendse (2002) identificó una sustitución de Guanina por Adenina (G/A) en el extremo 3’ no traducido del ARN mensajero de CAST (posición 2959 de la secuencia AF159246 del GenBank), estableciendo que el alelo A se asociaba a carne más tierna. Este resultado fue posteriormente confirmado por Casas et al (2006) utilizando diferentes razas puras Bos taurus y Bos indicus y sus cruzas, todas pertenecientes al Proyecto de Evaluación de Germoplasma del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) en Clay Center, Nebraska. En este trabajo los animales homocigotas para el alelo favorable presentaron valores de RC menores, dependiendo la magnitud del efecto de la raza o cruza (-0,31 a -0,47 kg), que los que tenían el genotipo más desfavorable. Morris et al (2006) analizó este mismo polimorfismo en novillos de distintas razas Bos taurus; hallando una diferencia entre los valores de RC del genotipo favorable (AA) y el heterocigota, de 0,21 a 0,50 kg dependiendo de la raza y el tiempo de maduración de la carne. Recientemente se ha evaluado el efecto de este SNP en la raza Nelore y en cruzas índicas. En este trabajo el genotipo AA presentó una RC menor que el heterocigota, hallándose una diferencias de 0,42 kg entre ambos genotipos (Curi et al., 2009).
Otro polimorfismo asociado con terneza, corresponde a una sustitución G/C en el intrón 5 (nucleótido 282 de la secuencia AY008267 del GenBank). Schenkel et al (2006) al analizar animales de diferentes razas Bos taurus (Angus, Limousin, Charolais, y Simmental) hallaron que animales con genotipo CC producen carne más tierna (-0.32 kg ± 0,13) que los animales con genotipo GG, en tanto que los heterocigotas presentaron un fenotipo intermedio.
Se han desarrollado pruebas comerciales para determinar genotipos de los SNP asociados con variabilidad en terneza en los genes del sistema calpastatina/μ-calpaína (CAST y CAPN1 respectivamente). La prueba GeneStar Tenderness (Bovigen LLC Harahan, LA) incluye al SNP del CAST descripto por Barendse (2002), mientras que el test Igenity Tender-GENE (Merial Limited, Duluth, GA) incluye al SNP identificado por Schenkel et al (2006). Estos tests incluyen al menos, dos SNP del gen CAPN1 (CAPN1 316 y CAPN1 4751). Los mismos fueron validados en un estudio utilizando diferentes razas y cruzas bovinas en EEUU, confirmándose los resultados previos. En dicho trabajo se encontró a ambos SNP de CAST con un efecto de similar magnitud sobre la RC (Van Eenennaam et al., 2007). Esto sugiere que ambos SNP estarían en desequilibrio de ligamiento con una misma región del genoma que controla la terneza de la carne vacuna. Es importante aclarar que la conformación de paneles comerciales para el análisis genómico está en permanente evolución, en la medida que son descubiertos nuevos marcadores significativos. La Tabla I resume los resultados de los trabajos de investigación mencionados anteriormente.

Tabla I. Resumen de los resultados del análisis de dos SNP identificados en el gen CAST

Se han reportando otros polimorfismos en diferentes regiones del gen CAST, pero por diversas razones no se verificó un efecto significativo sobre la terneza de la carne. (Corva et al., 2007, Zhou y Hickflord, 2007, Juszczuk et al., 2008). Esto no es sorprendente, porque los SNP son polimorfismos muy abundantes en el genoma, y de todos los identificados proporcionalmente sólo unos pocos tienen implicancias funcionales.
Nuestro grupo de investigación identificó ocho SNP mediante la comparación de secuencias de ADN y ARN mensajero disponibles en el GenBank (Figura 4 y Tabla II), cinco de ellos se localizan en regiones codificantes del gen, pero por su naturaleza no tendrían efecto sobre la función de la proteína, mientras que los tres restantes se localizan en el extremo 3´ no traducido. El SNP 2870 es una sustitución A/G (nucleótido 2870 de la secuencia AF159246 del GenBank) y fue analizado en un grupo de 313 novillos de razas Angus, Hereford y sus cruzas, no hallándose diferencias significativas en terneza entre los diferentes genotipos (Corva et al., 2007).


Figura 4. SNP identificados en el gen CAST mediante análisis de secuencias publicadas en el GenBank. XL, L y los números romanos de I a IV corresponden a cada dominio. A, B y C son los tres subdominios. (* * *) Corresponde a los sitios de fosforilación por proteinkinasas. El número de cada SNP corresponde a la posición del nucleótido en la secuencia AF159246.

Tabla II. SNP identificados por métodos bioinformáticos en el gen CAST
Se indica la posición de los mismos con referencia a la secuencia AF159246, los alelos para cada uno de ellos y a qué dominio proteico corresponden.

Los polimorfismos en las regiones no codificantes del gen podrían tener un efecto en los niveles de expresión del mismo, si se localizan en el promotor y otras regiones reguladoras. Estos polimorfismos con efecto sobre la expresión podrían justificar las diferencias en actividad de calpastatina entre Bos indicus y Bos taurus (Pringle et al., 1997)
Krause et al (2008) iniciaron la caracterización de los promotores I y III en razas índicas mediante la comparación de secuencias obtenidas de toros de razas Angus, Brangus y Brahman (Nº de acceso al GenBank: EU292733, EU292734, EU292735, EU817120, EU817121, EU817122 y EU817123). Hasta el momento, en el promotor I se identificaron siete polimorfismos, de los cuales tres fueron hallados exclusivamente en toros de raza Brahman. Los mismos están localizados en las posiciones –71, +50 y +99/100, tratándose de sustituciones C/G, C/T y CA/GG respectivamente. Sin embargo, el análisis de las secuencias obtenidas mediante el programa TFSEARCH (www.cbrc.jp/research/TFSEARCH.html) permitió determinar que dichos SNP no alteran sitios TFBS en el promotor I. En el promotor III se identificaron cuatro SNP, ubicados en las posiciones -581, -142, -9 y +150. El SNP -142 (T/C) se localiza en un potencial sitio CdxA. El alelo C de dicho SNP eliminaría el sitio de unión. En cambio, el alelo T del SNP -9 crearía un sitio de unión al factor de transcripción GATA-2. Según estos resultados, los SNP identificados en el promotor I no serían responsables de diferencias raciales en la expresión de calpastatina ya que no modifican TFBS, en tanto que los hallados en las posiciones -142 y -9 de las secuencias obtenidas del promotor III, podrían potencialmente afectar la regulación de la expresión de calpastatina porque eliminarían y crearían TFBS respectivamente. Los polimorfismos identificados en ambos promotores analizados de CAST (I y III) en la raza Brahman, podrían indicar la existencia de variabilidad entre razas.
Recientemente se han reportado SNP en el promotor III en bovinos de diferentes razas Bos taurus. Los mismos están localizados en las posiciones -890, -750, -580,-557,-556, -357 y -353, algunos de los cuales alteran TFBS (Juszczuk et al., 2009).
En el futuro se deberían realizar estudios para comprobar si dichos SNP, especialmente los del promotor III, existen en frecuencias tales que justifiquen su evaluación en estudios de asociación con la terneza de la carne.
De acuerdo a los conocimientos actuales se puede confirmar que existen genotipos de CAST que están relacionados con carne más tierna. Sin embargo, debido a la ubicación de los polimorfismos hallados asociados con variabilidad en terneza (intrón 5 o extremo 3´no traducido) no se conoce si los mismos son funcionales o están en desequilibrio de ligamiento con polimorfismos funcionales aún desconocidos. Para poder conocer con profundidad las razones por las cuales existen diferencias en la magnitud del proceso de proteólisis postmortem entre razas, y conociendo que el gen CAST tiene un rol fundamental en dicho proceso, deberían realizarse estudios más completos en los cuales no sólo se establezca el genotipo para dichos SNP, sino también realizar estudios de expresión génica y de actividad enzimatica.

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Aceptado: Setiembre - 2009.

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