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BAG. Journal of basic and applied genetics

On-line version ISSN 1852-6233

BAG, J. basic appl. genet. vol.22 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires Jan./June 2011

 

Las mutaciones de resistencia al antibiótico mecilinam y su relación con el control de la forma celular en Salmonella entérica serovar Typhimurium

 

Dora N. Antón y Cristina S. Costa

Departamento de Radiobiología, Comisión Nacional de Energía Atómica. Avda. General Paz 1499, 1650 San Martín, Argentina. denea23@gmail. com costa@cnea. gov. ar

 


RESUMEN

En Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), la forma celular está controlada por complejos mecanismos que coordinan el crecimiento y la división celular, y mantienen durante el ciclo de vida la forma bacilar regulando la síntesis y degradación de las macromoléculas que constituyen la envoltura celular. Empleando mecilinam, un antibiótico β-lactámico de la familia de las penicilinas que debe su actividad bactericida a su capacidad para interferir con los mecanismos que regulan la forma celular, se han obtenido evidencias sobre el rol esencial de los genes que controlan la forma y se ha demostrado que la letalidad de las mutaciones que los afectan es condicional y se expresa cuando el crecimiento ocurre en medio sólido pero no en medio líquido. Se demostró, también, que muchas mutaciones que conferen resistencia a mecilinam actúan como supresoras de esa letalidad. Entre los genes cuya actividad condiciona la efectividad del antibiótico se identificaron varios relacionados con sistemas globales de regulación: cysB/cysE, cya/crp, spoT, LPS, mucM. Asimismo, se demostró que existen complejas interacciones entre esos genes, que modifican la respuesta al antibiótico y alteran funciones (slt, opgGH) relacionadas con la envoltura celular.

Palabras clave: Salmonella enterica; Mecilinam; Forma celular; Genes esenciales; Sistemas globales de regulación.

ABSTRACT

Cell shape is regulated in Salmonella enterica serovar Typhimurium by complex mechanisms which coordinate growth with cell division and maintain bacillar cell shape through the whole cell cycle by controlling synthesis and degradation of cell envelope macromolecules. By using mecillinam, a β-lactam antibiotic that kills sensitive bacteria by interfering with the mechanisms regulating cell shape, it was demonstrated that genes controlling cell shape have an essential role since their inactivation was found to be lethal. Moreover, this lethality was conditional because it appeared only when growth proceeded on solid medium whereas growth in liquid medium was not affected. It was also found that many mutations which conferred resistance to mecillinam behaved as suppressors of that lethality. Among the genes concerned with mecillinam action, several related with global regulatory systems (cysB/cysE, cya/crp, spoT, LPS, mucM) were identifed. It was also demonstrated that some of those genes not only modifed the response to the antibiotic but also shown complex interactions with functions (slt, opgGH) related to the cell envelope.

Key words: Salmonella enterica; mecillinam; Cell shape; Essential genes; Global regulatory systems.


 

ESTUDIOS DE GENÉTICA MOLECULAR EN LA COMISIÓN NACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA

El grupo de Genética Molecular de la CNEA, dedicado desde hace tiempo a la investigación del control genético de la división y la forma celular en Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), se ha concentrado, en los últimos años, en el estudio del control genético de la forma bacteriana a través del empleo de mecilinam, un antibiótico de la familia de las penicilinas y cefalosporinas (β-lactamas) que justamente se caracteriza por anular la forma bacilar causando la aparición de bacterias esféricas.

La forma bacilar de S. Typhimurium

Tanto en Escherichia coli como en S. Typhimurium, la forma bacilar está determinada por una estricta armonización entre el crecimiento longitudinal de la célula, que incluye las correspondientes membranas interna y externa que la envuelven, y el complejo proceso de división celular que se desencadena cuando la bacteria, conservando siempre su forma alargada, ha duplicado su masa. La finalización de los dos procesos, crecimiento y división, resulta en la obtención de dos células bacilares similares a aquella que les dio origen. Trabajos previos de este laboratorio demostraron la existencia en S. Typhimurium de varios tipos diferentes de mutantes (rodA, pbpA, mre) que forman células esféricas en lugar de bacilos. Pudo también demostrarse que los genes que controlan la forma son esenciales dado que las mutaciones que los inactivan son letales, y que la aparente normalidad de las cepas que portan esas mutaciones se debe a la simultánea presencia en ellas de otras mutaciones que actúan como supresoras de esa letalidad (Costa y Antón, 1993). La demostración de que gran parte de esas mutaciones supresoras conferen resistencia a mecilinam, llevó a formular la hipótesis de que el efecto bactericida de mecilinam se debe a su capacidad de interferir con la actividad vital de los genes que controlan la forma celular y que el estudio de las mutaciones de resistencia al antibiótico podría proporcionar información sobre la naturaleza de la o las funciones esenciales de división celular que esas mutaciones suprimen (Costa y Antón, 1993).
Trabajando en condiciones que permiten observar la expresión de la letalidad de las mutaciones de forma, se constató que las mutaciones letales de forma celular solamente expresan esa letalidad cuando el crecimiento ocurre sobre medio sólido. En esas condiciones la célula esférica crece desmesuradamente y termina sufriendo autólisis y muerte. Sin embargo, cuando el crecimiento ocurre en las mismas condiciones pero en medio líquido, las bacterias mantienen la forma esférica causada por la mutación pero son perfectamente capaces de crecer y multiplicarse normalmente. Este resultado demostró que la forma esférica, en sí misma, no es la responsable de la letalidad y que existen otros factores cuya presencia o ausencia condiciona la expresión de la muerte (Costa y Antón, 1999). Recientes estudios realizados en EE. UU. sugieren que la letalidad condicional de las mutaciones de forma se manifesta cuando la proteína FtsZ, que es un factor esencial en la determinación del sitio donde se cumplirá la división celular, no está presente en las cantidades que requieren las células esféricas para crecer (Bendezú y de Boer, 2008). Podría entonces suponerse que el requerimiento de FtsZ en medio líquido es menor que en medio sólido y al no sobrepasar el nivel disponible en las células esféricas permitiría su crecimiento en esas condiciones en tanto que el crecimiento en medio sólido, al aumentar la exigencia de FtsZ y sobrepasar ese nivel, desencadenaría la muerte de esos mismos mutantes de forma.

Mutaciones de resistencia a mecilinam

Con el propósito de reunir información sobre los procesos regulatorios de la división y la forma celular, se encaró un estudio sistemático de las mutaciones de resistencia a mecilinam ya que se consideró que la identificación de los genes afectados y sus efectos supresores podrían aportar conocimientos sobre las funciones esenciales involucradas. En un extenso estudio de mutantes de origen independiente seleccionados por su resistencia a mecilinam se detectó, además de los tipos ya conocidos que deben su resistencia a la síntesis aumentada del regulador ppGpp (Costa y Antón, 1999), una nueva clase de mutantes no descripta hasta ese momento que presentan alteraciones en los genes cysB o cysE y debido a eso son incapaces de sintetizar el aminoácido cisteína. Estos mutantes, además de ser resistentes a mecilinam, son tolerantes a mutaciones letales de forma celular, y ambas características son debidas a las mutaciones cysB o cysE presentes en ellos (Oppezzo y Antón, 1995). Los genes cysB y cysE actúan como inductores de un conjunto de genes involucrados en la síntesis de cisteína y controlan además otras funciones no directamente relacionadas con cisteína (Kredich, 1996). Los resultados obtenidos han sido interpretados como indicadores de que existe un paso en el mecanismo de acción de mecilinam que requiere la actividad de los genes cysB y cysE, y que la resistencia resulta de la incapacidad de los mutantes defectivos cysB o cysE para cumplirlo. Ese paso estaría involucrado también en la aparición de la letalidad de las mutaciones de forma, y por ello, las mutaciones cysB y/o cysE volvería a la bacteria inmune a esa letalidad y permitiría la supervivencia de las bacterias esféricas (Oppezzo y Antón, 1995). En apoyo de esta hipótesis, se observó que el crecimiento activo de S. Typhimurium en medio de cultivo rico produce la inducción espontánea de los genes regulados por cysB/cysE, y que esta inducción no ocurre en los mutantes cysB/ cysE que, por lo tanto, deberían su resistencia a mecilinam a la falta de expresión de ese hipotético gen que posibilitaría la acción del antibiótico (Antón, 2000).
Una clase muy común de mutantes resistentes a mecilinam presenta colonias de fenotipo mucoide debido a la producción aumentada del mucopolisacárido ácido colánico. Se conocen varios tipos genéticos de mutantes con esas características, pero nuestros resultados demostraron que la clase más frecuente de mutantes mucoides resistentes a mecilinam está formada por un nuevo tipo al que se llamó mucM (Costa y Antón, 2001). El estudio de estos mutantes, nunca antes aparecidos entre mutantes mucoides seleccionados por otros procedimientos, demostró que el gen mucM corresponde al gen que en la secuencia de ADN de S. Typhimurium (Mc-Clelland et al., 2001) es denominado yrfF (Costa et al., 2003). Se demostró también que la función de mucM es esencial porque las mutaciones que anulan totalmente la función del gen son letales y si bien los mutantes mucM obtenidos por resistencia a mecilinam son abundantes, todos ellos mantienen un nivel residual de actividad que depende de la mutación que les dio origen. Se observó, asimismo, que la alteración de mucM, además de incrementar la síntesis de ácido colánico, produce un extraordinario aumento específicamente en la expresión del promotor ftsA1p, uno de los varios promotores involucrados en la síntesis de las proteínas de división celular FtsA y FtsZ, que resulta en un acortamiento celular probablemente debido al aumentado nivel de FtsZ (Costa y Antón, 2001). En base a las características de mutaciones que a su vez suprimen la producción de ácido colánico y la letalidad de las mutaciones absolutas mucM, se llegó a la conclusión de que el producto del gen mucM funciona como represor de la expresión del sistema fosforegulado rcsBDC, que controla la síntesis de ácido colánico e interviene en la regulación de múltiples funciones celulares (Costa et al., 2003). Estos resultados fueron confirmados por otros investigadores empleando mutantes mucM, a los que llamaron igaA, aislados usando nuestro procedimiento de resistencia a mecilinam (Domínguez-Bernal et al., 2004).
Nuestros estudios pusieron de manifesto, además, la complejidad del aparentemente simple fenotipo de resistencia a mecilinam pues se determinó que mutaciones en los genes cya y crp, cuya capacidad para conferir resistencia a mecilinam es bien conocida en E. coli, solamente muestran esa capacidad en S. Typhimurium cuando además están presentes mutaciones en genes que afectan la síntesis del lipopolisacárido (LPS) que forma parte de la capa externa de la envoltura celular o por ciertas mutaciones en el gen spoT. Estos resultados revelaron la existencia de un curioso caso de cooperativismo, porque si bien aisladamente ninguno de los tres tipos de mutaciones afecta la respuesta a mecilinam, la presencia simultánea de mutaciones de dos de los tipos causa la aparición de un alto nivel de resistencia que se incrementa aún más cuando mutaciones de los tres tipos están presentes (Antón, 1995). Los genes cya y crp están involucrados en la síntesis y función del AMP cíclico, que actúa como regulador en numerosos procesos que involucran carbohidratos en tanto que el gen spoT controla la degradación y parcialmente la síntesis de ppGpp, un compuesto que actúa como efector de la llamada "respuesta estricta", un importante sistema global de regulación de síntesis de macromoléculas (Cashel et al., 1996). Por lo tanto, la actividad antibiótica de mecilinam depende de reguladores que controlan dos diferentes circuitos regulatorios globales y de la cadena de reacciones que lleva a cabo la síntesis de LPS, un importante componente de la envoltura bacteriana, y esos tres factores interactúan en forma tal que únicamente cuando al menos dos de ellos no funcionan, la acción del antibiótico es anulada (Antón, 1995).

Otros mutantes

La notable complejidad de la respuesta a mecilinam, demostrada por nuestros resultados, impulsó experimentos dirigidos a buscar evidencias de interacción entre las diferentes mutaciones identificadas. Con ese objeto, se construyeron cepas portadoras de mutaciones que incrementan la resistencia a mecilinam junto con otras mutaciones que interfieren con esa resistencia y se buscaron mutaciones que alteraran las interacciones observadas. Se obtuvieron mutantes de dos tipos, uno formado por mutantes slt defectivos en la síntesis de la principal enzima autolítica soluble (transglicosilasa lítica soluble), y el otro tipo formado por mutantes opg, que son incapaces de sintetizar ciertos oligosacáridos que se hallan entre las membranas interna y externa de la bacteria y parecen estar relacionados con el equilibrio osmótico de la célula y otras funciones aún no bien definidas (Bohin, 2000).
El estudio de los mutantes slt obtenidos demostró que la enzima afectada, que interviene en el procesamiento de la capa rígida de la envoltura, cumple un importante papel en la respuesta a mecilinam que solamente se hace evidente cuando la cepa es además deficientes en la función de los genes cysB o cysE. En esas condiciones, las mutaciones slt producen un extraordinario aumento en el nivel de resistencia a mecilinam que da a las cepas portadoras la capacidad de resistir muy altas concentraciones del antibiótico. Este comportamiento, que es específico para mecilinam y no se observa con otros antibióticos de la misma o diferente familia, se da solamente con determinados genotipos pues en otras cepas y también en el tipo silvestre, las mutaciones slt no solo no alteran la respuesta a mecilinam sino que inclusive pueden aumentar la sensibilidad a la droga (Costa y Antón, 2006).
En el caso de las mutaciones opg, se determinó que aumentan considerablemente la resistencia a mecilinam de ciertas cepas que ya tienen un bajo nivel de resistencia y, como en el caso de los mutantes slt, se comprobó que esta acción solo ocurre en cepas con genotipos específicos. Sin embargo, al contrario que con las mutaciones slt, el efecto de las mutaciones opg sobre la resistencia a mecilinam se manifesta únicamente cuando las bacterias mantienen un cierto nivel del regulador ppGpp, porque cuando se elimina completamente la síntesis de este compuesto, la resistencia a mecilinam conferida por las mutaciones opg desaparece. La identificación entre los mutantes opg aislados de una fusión transcripcional en el gen opgG, permitió estudiar la infuencia de varios factores regulatorios globales sobre la expresión de dicho gen y sobre el contenido celular de su producto. Se observó que la expresión del gen y el contenido de oligosacáridos responden de manera muy diferente a los factores regulatorios probados y que la expresión del gen es fuertemente dependiente de la fase de crecimiento (Costa, Pizarro y Antón, 2009).

CONCLUSIONES

La letalidad de las mutaciones que interferen con la determinación de la forma celular puede anularse modificando las condiciones de cultivo a pesar de que la forma no se normaliza. La letalidad también puede ser suprimida por ciertas mutaciones, la mayoría de las cuales confiere resistencia a mecilinam, un antibiótico β-lactámico que específicamente inactiva los procesos normales que determinan la forma bacilar. Entre esas mutaciones que dan resistencia a mecilinam y actúan como supresoras de la letalidad se han identificado varias que afectan procesos regulatorios globales (cya/crp, spoT, LPS, mucM). Asimismo, se han identificado mutaciones (slt, opg) que inactivan la síntesis de componentes de la envoltura celular y también modifican la respuesta a mecilinam. En conclusión, las mutaciones de resistencia a mecilinam han servido para adquirir nuevos conocimientos no solo sobre el proceso de división y forma celular sino también sobre otras importantes funciones cuya relación con el control de forma sigue en estudio.

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Received: 8/07/2010
Accepted: 29/08/2011

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