COMUNICACIONES LIBRES

GENÉTICA DE MICROORGANISMOS

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GM 1

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE GENES EN ECTOMICORRIZAS DE Scleroderma laeve Y Eucalyptus granáis

Betancourth BL¹, MF Pereira², MP Zubieta³, JA Teixeira³, MV Queiroz³, EF Araújo³. 1Lab. de Patologia Florestal e Genética da Interação Planta-Patógeno, Departamento de Fitopatologia, BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, MG Brasil, 2Laboratório de Associações Micorrízicas, Departamento de Microbiologia, BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil, 3Laboratório de Genética Molecular e de Mcro-organismos, Departamento de Mcrobiologia, BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil. e-mail: blanca.betancourth@ufv.br

Ectomicorrizas (ECM) son asociaciones mutualistas entre raíces de plantas y hongos del suelo. Scleroderma laeve es un hongo basidiomiceto capaz de formar ECM con Eucalyptus. Estudios sobre expresión génica son importantes para el entendimiento de mecanismos que ocurren durante la formación de ECM. El gen que codifca RAS fue descrito en diferentes trabajos siendo expresado diferencialmente en varias asociaciones ECM, de la misma forma que genes de factores de elongación de traducción, importantes en la síntesis proteica, y genes que codifcan proteínas de las subunidades de ATP sintetasa, responsables por proveer el ATP necesario para para sustentar las funciones dependientes de energía en ECM. Las proteínas monoméricas RAS son responsables por unirse al GTP y regulan vías de transducción de señales, promoviendo alteraciones adaptativas que pueden resultar en la formación de ECM. En esta investigación, secuencias parciales de los genes que codifcan ATP sintetasa (atpó), proteína RAS (ras) y el factor de elongación ef1a (efla) fueron aisladas y su expresión génica analizada antes y después del contacto físico entre S. laeve y Eucalyptus granáis, durante la formación de ECM. Las secuencias parciales de los genes atpó, ras y efla de S. laeve fueron obtenidas con 503, 368 y 879 pb, respectivamente. Los genes atpó y efla fueron expresados durante todas las etapas de la formación de las ECM. El gen ras fue expresado después de tres, 15 y 30 días, sugiriendo que las vías de transducción de señales mediada por ras pueden ser funcionales durante el estabelecimiento de la simbiosis.

 

GMI 2

VÍNICA

Jara M¹, F Salinas², G Liti², MA Ganga¹, C Martínez^1,3. ¹Laboratorio de Biotecnología y Microbiología Aplicada, Departamento de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Universidad de Santiago de Chile (USACH), ²Institute of Research on Cancer and Ageing of Nice (IRCAN), University of Nice Sophia-Antipolis, 06107 Nice, France, ³Centro de Estudios en Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CECTA), Universidad de Santiago de Chile (USACH). e-mail: claudio.martinez@usach.cl

Deducir los factores genéticos que infuyen en los patrones de variación fenotípica permite conocer las bases moleculares de la diversidad fenotípica. La principal estrategia para estudiar los rasgos cuantitativos es a través del análisis de ligamiento en el cual la identifcación de los loci de rasgos cuantitativos (QTLs) ha sido realizada analizando las variaciones fenotípicas en una etapa de un determinado proceso, dentro y entre especies. Sin embargo, las múltiples bases genéticas subyacentes solo son observables si los QTL's tienen una contribución a través de todo el proceso y una signifcancia al momento del análisis. En este trabajo, haciendo uso de un cruzamiento entre dos cepas divergentes de Saccharomyces cerevisiae, nosotros realizamos un análisis de ligamiento que pemitió correlacionar la variación fenotípica para el rasgo pérdida de CO₂ con 5 regiones cromosómicas a través del proceso de fermentación, demostrando que los QTLs muestran patrones dinámicos a través de este proceso y que supone un control genético sobre la varianza fenotípica en una manera tiempo específca. A nuestro entender es la primera descripción de QTL dinámicos.

 

GMI 3

EFECTO DE LOS GENES ARR1, RDL1 Y ATO2 EN EL CONSUMO DE NITRÓGENO DURANTE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

Muñoz V¹, D Soto¹, V García¹, MA Ganga¹, C Martínez^1,2.

¹Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Facultad Tecnológica. Universidad de Santiago de Chile (USACH), ²Centro de Estudio de Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CECTA). Universidad de Santiago de Chile (USACH).

e-mail: vagarcia1977@gmail.com

 

Saccharomyces cerevisiae es el principal responsable de la fermentación alcohólica, proceso complejo en el cual la escases de nitrógeno en el mosto es una de las principales causa de enlentecimiento y paradas de la fermentación, provocando grandes pérdidas en la industria. Nuestro laboratorio ha abordado este problema mediante la comparación de los perfles transcripcionales de dos cepas genéticamente emparentadas que diferen en la cantidad de nitrógeno consumido. Así, se identifcaron 348 genes que varían su expresión entre estas cepas. Para determinar el efecto de algunos de estos genes se evaluó la sobreexpresión de los genes ARR1 y RDL1 que codifcan para un factor transcripcional y una proteína de función desconocida en la cepa vínica EC1118. Los resultados indican que la sobreexpresión de ARR1 aumenta el consumo de amonio al fnal de la fermentación (94.5 ± 6.4 mgN/L) y que la sobreexpresión de RDL1 disminuye el consumo de este compuesto (30.2 ± 1.0 mgN/L) respecto a la cepa control (64.7 ± 8.5 mgN/L). Por otro lado, el gen AT02 se analizó mediante mutantes nulas. Los resultados indican un aumento en el consumo de aminoácidos al fnal de la fermentación en la cepa AC19DAT02 (105,66 ±3,1 mgN/L) respecto a la cepa silvestre (89,27 ± 1,29 mgN/L). Similares resultados se obtuvieron en la cepa EC111ÜDAT02 (118,1 ± 7,95 mgN/L) respecto a la cepa EC1118 (96,8 ± 3,96 mgN/L)sugiriendo que estos genes tienen una relación con el metabolismo del nitrógeno.

GMI 4

USO DE a- E P-ESTERASES COMO MARCADOR NA INTERACÁO ENDÓFITO- PLANTA EM CANA-DE-ACUCAR (Saccharum SPP.)

Bevilaqua MRR¹²⁴, AC Lerne¹³-⁴, SA Rhoden¹³⁴, CA Mangolin¹²⁴, JA Pamphile¹³⁴, MFPS Machado¹². 'Universidade Estadual de Maringá - Departamento de Biotecnología, Genética e Biologia Celular, ²Laboratório de Cultura de Tecido e Eletroforese de Vegetáis, 'Laboratório de Biotecnología Microbiana , ⁴Programa de Pós-Graduacao em Biologia Comparada. e-mail: maycon.bevilaqua@gmail.com

No presente estudo as isozimas α- e β-esterases foram usadas como marcadores moleculares para identifcar algum processo genético molecular envolvido na relacáo endófto-planta em cana-de-açúcar. As α- e β-esterases também foram utilizadas para caracterizar genéticamente estes endóftos. Para a avaliacáo das esterases foi utilizada eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Foram isolados 37 fungos endofíticos de cana-de-acucar cultivadas no campo, e estes foram analisados para ao padráo de α- e β-esterases. Nos isolados foram identifcadas 32 α- e β-esterases, o que permitiu separá-los em cinco grupos. Os mesmos grupos também foram formados usando as características morfológicas dos endofíticos. A mesma metodología foi utilizada para avaliar as α- e (3-esterases da variedade IACSP 95-1218 cultivada "in vitro" sem a presença de endofíticos. Para as plantas estéréis desta variedade, oito esterases foram evidenciadas. Quando essa variedade foi inoculada com 4 dos 37 endofíticos isolados, observou-se a inducáo da expressáo da EST-10, esta esterase não foi observada nos enfofíticos estudados. Outra característica induzida pelos endofíticos foi o aumento na intesidade das demais esterases. Nossos resultados mostraram que as α- e β-esterasessáo enzimas que estáo relacionadas com processos de interacáo endófto-planta em cana-de-acucar, onde a EST-10 pode ser usada como marcador molecular da interacáo entre os isolados 31, 33, 34 e 35 e plantas da variedade IACSP

 

GMI 5

THE EFFECT OF 3,5-DINITROSALICYLIC ACID ON GENOMIC DNA FROM Saccharomyces cerevisiae

CD Santos Júnior, DP Luiz, AM Bonetti, TA de Campos. Genetics and Biochemistry Institute, Federal University of Uberlandia, Uberlándia/MG, Brazil. e-mail: prudenis@yahoo.com.br

DNA contamination is a huge barrier in molecular applications, where exogenous DNA may interfere in results. In this way, this study purposes a method that permits the removal of DNA from samples using DNS (3,5 dinitrosalicylic acid). This compound reacts with reducing sugar, turning the aldehyde group into a carboxyl group and becoming itself to 3-amino,5-nitrosalicylic acid. This mechanism could alter the primary structure of DNA at nucleoside level. This research was carried out using genomic DNA extracted from Saccharomyces cerevisiae (DNAy) through freezing and thaw protocol. The reaction was: DNAy 19.4 pmol; Britton-Robinson Buffer 20 μM (pH 8.0); DNS 4.4 nM; NaKC₄H₄0₆ 62.5 nM; NaOH 24 nM, nanopure water to 50 μL. The reactions was submitted for 5 min to one of this treatments: 25°C, 60°C, 70°C, 80°C and 90°C, the negative control without DNS was submitted to all temperatures. The product was analyzed at Nanodrop ND-1000 at UV-Vis mode and loaded in agarose gel 0.8% at 100V for 40 min. The DNA degradation level was higher at more elévate temperatures, with a positive correlation (R² 0.8653). Fragments of 2kbp and another of 100-300bp were produced in the reaction, showed by electrophoresis. The DNS demonstrated to be an effcient method to cleave or remove the high mass DNA from a reaction, other studies are needed to investigate the effect of the reaction subproducts to PCR and another molecular biology applications, if not signifcant to them it could be used to generate DNA libraries of low length. Financial Support: CNPq, CAPES, FAPEMIG, UFU.

 

GMI 6

OXIDATIVE DNA DAMAGE AND BASE EXCISION REPAIR (BER) IN Trypanosoma cruzi

Cabrera G, S Sepúlveda, I Ponce, L Valenzuela, S Ramirez, P Bahamondes, S Sierra, U Kemmerling, N Galanti. Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina. Universidad de Chile, Santiago, Chile. e-mail: ngalanti@med.uchile.cl

T.cruzi resists the oxidative damage to its DNA exerted by ROS/RNS generated in vectors and mammals. We propose that parasite DNA is repaired via the BER pathway. DNA damage and repair were detected by different techniques. AP-endonucleases were identifed with specifc antibodies in the parasite and their activity was assayed in cell extracts incubated with a double stranded oligonucleotide containing a single AP-site. DNA repair by oligonucleotide gap flling and ligation was also detected. Parasite viability was determined by the MTT assay. We show that: 1) T. cruzi DNA is damaged when exposed to H₂O₂ and NOO^-; 2) This damage is partially repaired by the parasite; 3) AP-endonucleases and their activity were detected in the parasite; 4) Methoxyamine (Mx), a BER DNA repair inhibitor, decreases T. cruzi AP-endonuclease activity and, when exposed to ROS/RNS, increases DNA fragmentation while diminishes parasite viability; 5) Inhibition of T. cruzi AP endonucleases and decrease in cell viability by Mx is indicative of a conservative mechanism of DNA BER repair in T. cruzi. It is proposed that inhibition of DNA repair represents a possible target for the control of T. cruzi infection. Supported by FONDECYT-Chile1090124 (to NG), 1120230 (to UK) and CONICYT PIA-Act 112

 

GMI 7

APURINIC/APIRIMIDYNIC ENDONUCLEASES INVOLVED IN T . cruzi DNA REPAIR AND INFECTION PERSISTENCE

Sepúlveda S, L Valenzuela, I Ponce, S Ramirez, P Bahamondes, S Sierra, U Kemmerling, N Galanti, G Cabrera. Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile. e-mail: gcabrera@med.uchile.cl

T. cruzi is the etiological agent of Chagas' disease. To establish a chronic infection T. cruzi must resist the oxidative damage to its DNA exerted by ROS/ RNS generated by its host. We propose that the DNA repair BER pathway is activated when T. cruzi is exposed to ROS/RNS, allowing its survival. Two T. cruzi DNA repair apurinic/apyrimidinic endonucleases (TcAP1, TcAP2) were identifed in the parasite genome. Modeling of deduced amino acid sequences present structural characteristics similar than the corresponding mammalian enzymes. Antibodies against TcAP1 or TcAP2 recognized these enzymes in the parasite but their expression did not change when treated with ROS/RNS. TcAP1 and TcAP2 were cloned in a parasite expression vector. Transfected TcAP1-GFP and TcAP2-GFP parasites show that the DNA repair enzymes are in the nucleus only. Interestingly, overexpression of TcAP1 or TcAP2 moderately increases survival of parasites when submitted to oxidative stress. These results suggest that the BER pathway and particularly TcAP1 and TcAP2 play an important role in T. cruzioxidative DNA damage resistance leading to parasite persistence in its hosts. FONDECYT-Chile 11100053 (to GC), 1120230 (to UK) and CONICYT PIA-Act 112

 

GMI 8

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE ESPECIES DE Phytophthora EN CULTIVOS HORTÍCOLAS DEL NE DE LA PROVINCIA

DE BUENOS AIRES

Borassi C², MJ Iribarren¹, AM Ferri^2,3, E Guillin³, BA Gonzalez¹, M Stecow⁴. ¹Depto. Tecnología, Univ. Nac. de Luján, ²Depto. Básicas, Univ. Nac. de Luján, ³Instituto de Genética "Ewald A. Favret" CICVyA, INTA, Castelar, ⁴Instituto de Botánica Spegazzini. Fac. Cs. Naturales.

e-mail: aferri@nia.inta.gov.ar

Phytophthora es uno de los principales géneros de patógenos de plantas con gran incidencia económica en los cultivosde Solanáceas y Cucurbitáceas delcinturón hortícola periurbano de Buenos Aires-La Plata. Para estudiar la biología básica de las enfermedades causadas por Phytophthora es necesario identifcar las distintas especies. El empleo de técnicas moleculares en conjunto con los métodos clásicos ha mejorado la capacidad para determinarlas. El análisis de las secuencias de las regiones ITS I y II del ADNr permite diferenciar las distintas especies dentro de Phytophthora, dado que la tasa de acumulación de mutaciones en estas regiones se aproxima a la tasa de especiación. Se identifcaron morfológicamente casi 100 aislamientos provenientes de los partidos de Luján, Gral. Rodríguez y Exaltación de La Cruz. Los productos de PCR de alguno de ellos, con los primers ITS4 e ITS5 fueron purifcados y secuenciados. Las secuencias resultantes fueron alineadas con Clustal W; las reconstrucciones flogenéticas se realizaron con Network 4.6.1.0. La topología obtenida resultó congruente con las secuencias de ejemplares tipo obtenidas de BLAST. En todos los casos el análisis molecular coincidió con la descripción morfológica y la literatura, validando el método. Las especies presentes en la muestra fueron: P. capsici, P. nicotianae y P. dreschleri.

 

GMI 9

ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL COMPLEJO NITROGENASA EN Pseudomonas S P .

Setten L, G Soto, P Lisi, M Mozzicafreddo, M Cuccioloni, M Angeletti, N Ayub. Instituto de Genética Ewald A. Favret (CICVyA-INTA), De los reseros S/N, Castelar C.C. 25 (1712), Buenos Aires, Argentina. e-mail: losetten@yahoo.com

Anteriormente, en el estudio de las especies del género Pseudomona se consideraba la incapacidad de fjar nitrógeno como una característica de importante valor taxonómico. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que algunas cepas del género Pseudomona sensu stricto tienen la capacidad de hacerlo, tales como P. stutzeri A1501 y Azotobacter vinelandii AvOP. En ambas especies, los genes nif, responsables de la síntesis del complejo nitrogenasa; fueron encontrados en islas genómicas sugiriendo que estos genes fueron adquiridos por transferencia horizontal. La organización de los genes nif en P. stutzeri A1501 muestra un alto grado de similitud con la de A. vinelandii AvOP. Por lo tanto, a partir de esta evidencia, basándose en la secuencia de aminoácidos del complejo nitrogenasa de P. stutzeri, utilizando el servidor Swiss-Model homology modelling se realizó la predicción de la estructura tridimensional de las cadenas A y B del complejo de esta cepa. La homología del modelo de la estructura tridimensional del complejo nitrogenasa de P. stutzeri, basado en la estructura X-ray publicada de A. vinelandii, confrma que el sitio catalítico de las nitrogenasas son extremadamente conservados.

 

GMI 10

ESTIMACIÓN PRELIMINAR DE PARÁMETROS GENETICOS PARA RASGOS DE INTERÉS ENOLÓGICO EN LEVADURAS VÍNICAS

Araneda C¹, V García², O Aguilera², C Martínez^2,3. ¹Departamento de Producción Animal, Universidad de Chile, ²Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Universidad de Santiago de Chile, ³Centro de Estudios en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Universidad de Santiago de Chile. e-mail: craraned@uchile.cl

El mejoramiento y la obtención de nuevas variedades de levaduras comerciales para la fermentación de mosto se han desarrollado principalmente utilizando herramientas biotecnológicas como la transgénica. S. ceverisiae es un microorganismo que puede reproducirse en forma sexual, en el que, es posible utilizar los métodos de mejoramiento genético aplicados a animales de granja. En este trabajo se construyó una población de 51 familias de S. ceverisiae a partir de cepas colectadas en ocho orígenes geográfcos distintos para asegurar una amplia variabilidad. Estas cepas parentales se usaron en un cruzamiento jerárquico, cruzando un parental "macho" con dos "hembras". Se aplicó un modelo mixto para estimar heredabilidad y correlaciones genéticas para ocho rasgos enológicos (Pérdida de CO2, YAN, producción de ácido acético, glicerol y etanol, uso de glucosa y fructosa, y rendimiento), con el fn de evaluar la factibilidad de implementar un programa de mejoramiento genético. En las estimaciones se usó un algoritmo DFREML. Las heredabilidades obtenidas fuctuaron entre 0,71 ± 0,12 para rendimiento y 1.00 ± 0,11 para YAN y producción de etanol. Las correlaciones genéticas estuvieron en los niveles esperados de acuerdo a la fsiología de la fermentación de S. ceverisiae. La alta variabilidad genética aditiva detectada para los rasgos estudiados puede ser explicada por que las levaduras parentales nunca habían sido seleccionadas para estos rasgos, y permiten inferir amplias respuestas a la selección, compatibles con el desarrollo de un programa de mejora genética. Fondecyt 1100509

 

GMI 11

ANALISE IN SILICO DA OCORRÊNCIA DE MICROSSATÉLITES NO GENOMA DA BACTÉRIA Burkholderia cepacia

Barbosa LV. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Maranhão.

e-mail: leticia.vieirab@hotmail.com

O gênero Burkholderia várias espécies e desde o início dos anos 1980 tem sido relatado com números crescentes de infecções em vários países. O complexo Burkholderia cepacia pode causar infecções graves, com cerca de 20% dos pacientes sucumbindo à síndrome de B. cepacia. A obtenção de marcadores moleculares da classe dos microssatélites (SSRs), usando a bioinformática, é fundamental em várias análises moleculares de bactérias pois gera dados com perfs específcos para cada espécie. Este estudo objetivou verifcar a ocorrência de microssatélites no DNA de B. cepacia a partir de ESTs passíveis de serem utilizados como marcadores moleculares através de buscas em bancos de dados. As seqüências de ESTs foram obtidas pelo website do NCBI, depositadas em arquivos FASTA e analisadas utilizando o software SSRLocator. As confgurações para os arranjos dos microssatélites a serem localizados, compreenderam arranjos formados entre dois e dez pares de bases com repetições mínimas de 1x12, 2x6, 3x4, 5x3 e 6x2. Apenas sequencias não-redundantes foram analisadas. Os melhores SSR passíveis de serem usados como marcadores moleculares são os hexâmeros presentes nas sequências 02, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 15, 16, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 31. Este trabalho ratifca a importância do conhecimento da ocorrência SSR nos genomas não apenas para um entendimento de sua distribuição, mas, para direcionar o desenvolvimento de marcadores SSR específcos para uso em análises genéticas. Espera-se com a continuação do estudo, verifcar a ocorrência de EST-SSR em outras bactérias do mesmo gênero.

 

GM112

FUNGOS ASSOCIADOS A OPERÁRÍAS DE Atta laevigata (FORMICIDAE, ATTINI)

Mantovani ID¹, A Rodrigues², TB Oliveira², M Ferro¹, M Bacci¹. 'Laboratório de Evolucao Molecular - Centro de Estados de Insetos Sociais/UNESP - Rio Claro/SP, ²Departamento de Bioquímica e Microbiologia/UNESP - Rio Claro/SP. e-mail: jdmantovani@hotmail.com

As formigas cortadeiras mantém associacóes com diversos simbiontes microbianos. O presente trabalho avaliou a diversidade de fungos encontrados na formiga Atta laevigata. O DNA genómico de operárías provenientes de Rio Claro - SP e Bauru - SP foi extraído para amplifcacáo da regiáo do espaçador interno transcrito de fungos utilizando os primers ITS1-F e ITS-4 gerando-se bibliotecas ITS para cada local de coleta. As sequéncias foram filtradas no pipeline E-Gene e checadas quanto à presença de quimeras. As sequéncias de alta qualidade foram agrupadas em unidades operacionais taxonómicas (UTOs) utilizando a plataforma MOTHUR e tiveram sua similaridade determinada a partir do NCBI. No total foram obtidas 33 e 21 UTOs de fungos em operárías de Rio Claro e Bauru, respectivamente. A fliacáo taxonómica das UTOs prevalentes foi: Cladosporium cladosporioides (55%) e Toxicocladosporim protearum (14,6%), na biblioteca de Rio Claro e Coriolopsis rígida (54,8%) e Trichosporon chiarellii (28,6%), na biblioteca de Bauru. Devido ao caráter ubíquo de C. cladosporioides e T. protearum, era esperada a ocorréncia desses fungos ñas operárías. Resultado interessante foi a presença de T. chiarelli . Tal levedura foi isolada somente de jardins de fungos de formigas Attini. C. rígida apresenta ampia capacidade de degradacáo da lignina, polímero também presente nos jardins de fungos de A. laevigata. O presente estudo constitui-se no primeiro passo para elucidar o papel dos fungos encontrados ñas operárías desse inseto. Apoio: Fapesp

 

GM113

EXPRESSÃO DA PROTEÍNA E2 DO VÍRUS DA HEPATITE C EM SISTEMAS HETERÓLOGOS

Urbaczek AC¹, WC Generoso², TF Isabel¹, TA Néo¹, CT Nogueira¹, JC Silva¹, F Kenfe¹, LM Fonseca¹, F Henrique-Silva², PI Costa¹. ¹Universidade Estadual Paulista-UNESP-Araraquara-P/BRAZIL, ²Universidade Federal de São Carlos - São Carlos - SP/BRAZIl. e-mail: anaurba@yahoo.com.br

Introdução: A Hepatite C apresenta prevalência mundial de 3% e é um importante problema de saúde pública. O HCV pertence à família Flaviviridae, é envelopado e possui RNA de fta simples positiva. O genoma codifca uma única poliproteína que é clivada em 10 proteínas, dentre elas a glicoproteína de envelope 2 (E2) que apresenta funções em diferentes estágios do ciclo de replicação. Objetivo: Expressar nos sistemas heterólogos, E. coli e P. pastoris, uma proteína similar à glicoproteína E2 do HCV, sem o domínio TM, e fusionada à GST e à Histidina. Testar a sua reatividade com um pool de soros humanos HCV(+).Metodologia: O gene codifcador da proteína E2-like foi clonado no vetor pET-42a, transformado em E. coli linhagem Rosetta e induzido à expressão, com IPTG (200mM), à 37ºC/ 300rpm/ 3h. O gene também foi clonado no vetor pPICZaA, transformado em P. pastoris KM71H e induzido à expressão com metanol (0,75%) à 30ºC/ 250rpm/ 48h. As proteínas foram purifcadas por coluna de níquel e transferidas para uma membrana de PVDF. A reatividade protéica foi testada pela adição de um pool de soros HCV(+) e revelada com IgG anti-humana biotinilada, avidina-peroxidase e substrato TMB/H₂O₂. Resultados e Conclusões: A proteína E2-like foi expressa nos dois sistemas e mostrou reatividade específca com o pool de soros HCV(+). Demonstrando que independentemente da glicosilação, expressam epítopos que foram antigenicamente reconhecidos pelos anticorpos do soro de pacientes portadores do HCV. Suporte Financeiro: FAPESP (2008/58957-0), FUNDECIF e PROEX/CAPES.

 

GMI 14

ROL DEL SISTEMA BAESR DE Salmonella typhimurium EN LA RESPUESTA AL ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR CIPROFLOXACINO

Guerrero P, R Alvarez, B Collao, EH Morales, F Ipinza, IL Calderón, CP Saavedra, F Gil. Laboratorio de Microbiología Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Andrés Bello, Chile. e-mail: fernandogil@unab.cl

Los antibióticos bactericidas producen un aumento en las especies reactivas de oxígeno (ROS) producto de una hiperactivación de la cadena transportadora de electrones. El aumento en los ROS produce daño a las macromoléculas. Estudios en E. coli demostraron que en presencia de un compuesto que daña el DNA (metilmetanosulfonato) existía un aumento en la expresión de baeR, que codifca para el regulador del sistema BaeSR. Esta evidencia sugiere una posible participación de este sistema en la regulación de la expresión génica frente a condiciones de estrés oxidativo, probablemente activando miembros del regulon SoxRS y OxyR. En este trabajo se analizó mediante actividad b-galactosidasa y qRT-PCR la expresión de genes de respuesta a ROS comparando la cepa silvestre y mutante tratadas con ciprofoxacino. En la cepa silvestre se observó una sobreexpresión de los genes sodA y katE, lo cual no se observó en la cepa mutante. Además se midió actividad superóxido dismutasa, catalasa y ROS totales para ambas cepas tratadas con el antibiótico. En este sentido, se observó un aumento en la actividad superóxido dismutasa solo en la cepa silvestre, a diferencia de la mutante en baeSR donde se observó solo un aumento en la actividad catalasa. En ambas cepas se observó un aumento en los ROS totales. Nuestros resultados sugieren que el sistema de dos componentes BaeSR participa en la respuesta defensiva de S. typhimurium expuesta a antibióticos generadores de ROS, aumentando la actividad superóxido dismutasa por la activación el gen sodA. Financiamiento: FONDECYT Nº11100142, DI-UNAB 15-12/R.

 

GMI 15

COMPARACIÓN DE DOS AISLAMIENTOS, "SUAVE" Y "SEVERO", DEL Onion yellow dwarf virus (OYDV) EN CEBOLLA

Celli MG¹, AK Torrico², M Kiehr³, VC Conci⁴. ¹Becario Postdoctoral de CONICET, ²Becario Doctoral de CONICET, ³Dto. Agronomía UNSur, ⁴Investigadora del Instituto de Patología Vegetal (IPAVE) del INTA y de CONICET. Cno 60 cuadras Km 5,5 (5119) Córdoba, Argentina. e-mail: vconci@correo.inta.gov.ar

El virus del enanismo amarillo (Onion yellow dwarf virus; OYDV) es de distribución mundial; en Argentina fue detectado en 1974. El objetivo de este trabajo fue comparar los genomas de dos aislamientos de OYDV de cebolla, el primero, proveniente de Alemania, que produce un mosaico "suave" casi imperceptible, y el segundo de Bahía Blanca, que ocasiona enanismo, plantas retorcidas, estriado amarillo y ampollas que denominamos "severo". Mediante transmisión mecánica se confrmó que esas diferencias de síntomas se mantenían en los nueve cultivares de cebolla probados. Ambos aislamientos fueron DAS-ELISA positivos para OYDV-antisuero y la secuencia que codifca la CP presentó 87,5-87,9% y 89,1-89,5% de identidad de amino ácidos (aa) con las secuencias de OYDV depositadas en GenBank. Mediante pirosecuenciación se obtuvieron las secuencias completas de ambos aislamientos siendo de 10459 y 10461 nucleótidos (nt) para el suave y severo, respectivamente, con 92,2% de identidad entre ellos. Ambas cepas mostraron que codifcan una poliproteína de 3381 aa con 94,5% de identidad. La región que codifca la CP presentó el mayor porcentaje de identidad de nt, 95,8%, y la región NIa-Pro el mayor porcentaje de identidad de aa, 98,8%. La región P1 fue la más variable con 86,2% y 80,8% de identidad en nt y aa, respectivamente. Otros autores atribuyen este tipo de diferencias a deleciones y/o diferencias en la HC-Pro y en la P1. En el presente estudio se detectaron más diferencias en la P1 sugiriendo que esta podría ser la región del genoma responsable de las diferencias de síntomas observados.

 

GMI 16

ESTUDIO IN VIVO DE LA MOVILIDAD DE CASSETTES DE RELEVANCIA CLÍNICA ENCONTRADOS EN INTEGRONES

Quiroga MP, MA Preisegger, D Centrón. IMPaM, UBA-CONICET, Facultad de Medicina, piso 12, C.A.B.A., Argentina. e-mail: paulaquiro@yahoo.com.ar

Los integrones son elementos genéticos que contienen los componentes de un sistema de recombinación sitio específco. Están compuestos por un gen Inti que codifca una integrasa IntI, un sitio de recombinaciónaff/ y un promotor Pc que permite la expresión de los cassettes. Los cassettes consisten en un marco de lectura abierto y un sitio de recombinación attC variable en secuencia y longitud, que es reconocido por la integrasa para escindir del integrón al cassette e insertarlo en un attl o en otro attC. Hasta el momento se han descripto más de 130 cassettes de resistencia a antibióticos. El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de la integrasa de tipo 1 (IntI1) para escindir e insertar en un sitio attll a diferentes cassettes de resistencia antibiótica de relevancia en la clínica y altamente diseminados en los aislamientos clínicos multidroga resistentes. Realizamos ensayos de recombinación in vivo de los cassettes bla_VIM2, aac(6')-IId, dfrAl y aadB en la cepa E. coli TOP10, los cuales presentan a su vez diferencias estructurales en sus sitiosa#C. Mientras que las frecuencias de escisión fueron disímiles entre sí (3-80%), las de inserción fueron homogéneas (3-7%). Estos resultados nos muestran que existen frecuencias de recombinación particulares para cada cassette y que los patrones moleculares que favorecen la escisión e inserción de cassettes diferen entre sí.

 

GMI 17

ANÁLISE DA DIVERSIDADE BACTERIANA EM ALGUMAS ESPÉCIES DE FORMIGAS ATTINI

Marchiori AC, M Ferro, M Bacci . Laboratório de Evolução Molecular, Centro de Estudos de Insetos Sociais, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP). e-mail: marchioricarol@yahoo.com.br

As formigas Attini cultivam fungos basidiomicetos, com os quais vivem em mutualismo obrigatório, e apresentam outras associações simbióticas com diferentes micro-organismos. Com base em alguns tipos de fungos associados a estas formigas, cinco sistemas agrícolas foram defnidos. A fm de identifcar a diversidade de bactérias associadas a três desses sistemas, nós analisamos operárias de três espécies de Attini: Atta laevigata(agricultura das cortadeiras), Trachymyrmex urichi (agricultura derivada) e Mycocepurus goeldi (agricultura basal). Para tanto, bibliotecas de 16S rRNA foram construídas e sequenciadas e as sequências geradas foram qualifcadas com o sistema de geração de pipelines EGene, alinhadas com ferramenta do RDP Pyrosequencing Pipeline e atribuídas a unidades taxonômicas operacionais (OTU) com o programa MOTHUR. A classifcação das OTUs representativas foi realizada empregando o programa BLAST. Foram defnidas 99 OTUs, que indicam a predominância de proteobactérias em todos os sistemas agrícolas. Em A. laevigata e T.urichi, que são derivadas, 96 e 38% das sequências de proteobactérias foram classifcadas como Rhizobiales, enquanto que em M. goeldi, que ocupa uma posição flogenética basal, nenhuma sequência foi classifcada nesta ordem. Estas bactérias podem ser mutualistas envolvidos com a fxação de nitrogênio para a nutrição das formigas. Burkholderiales, Rhodospirillales e Actinomycetales também estão entre prováveis simbiontes e foram selecionados para maior investigação. Apoio fnanceiro: FAPESP e CNPq

 

GMI 18

IMPLANTAÇÃO DO FISH EM AMBIENTES AQUÁTICOS SUBTROPICAIS OLIGOTRÓFICOS E ACIDIFICADOS

Ronqui, LB, PJ Borba Junior, H de Azevedo, H. Comissão Nacional de Energia Nuclear-Laboratório de Poços de Caldas (CNEN-LAPOC).

e-mail: jouber_borba@hotmail.com

Para a implantação do FISH foram utilizadas sondas dos grandes Domínios Bactéria e Archaea em dois corpos de água localizados na Bacia Hidrográfca do Ribeirão das Antas e em um corpo de água localizado nas dependências das Industrias Nucleares do Brasil - Unidade de Tratamento de Minérios. Foram realizados testes devido às características físicas e químicas dos três corpos d`água. Foi necessário sonicar as amostras das represas e a realizar a pré-limpeza em fltro de 20 μm contribuíram para a melhor visualização das células bacterianas. Para a CM foi necessário a fxação da amostra com formaldeído, fltragem de um maior volume de amostra de água com pré-tratamento utilizando etanol; melhor permeabilização das células. Para todos os pontos amostrais, o uso de lisozima mostrou-se efciente, propiciando a melhor permeabilização das sondas, bem como para o lise das cápsulas das células bacterianas da CM. Após tais ajustes, obtivemos resultados preliminares satisfatórios ao longo dos últimos meses. Concluiu-se de acordo com os resultados, que os três corpos de água ora estudados possuem diferentes características físicas e químicas e de concentração de material orgânico e nutrientes. Tais fatores provavelmente atuam sobre a ocorrência, abundância e distribuição das células bacterianas ao longo dos corpos de água. Outro ponto importante; os reservatórios das Antas e Bortolan recebem os efuentes radioativos tratados provenientes da mina de urânio Osamu Utsumi. Foram detectados que os reservatórios possuem problemas semelhantes para a implantação do FISH quando comparados a CM.

 

GMI 19

ESTRUCTURA GENÉTICA DE Phythophthora capsici EN EL NE DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

Iribarren MJ¹, C Borassi², E Guillín³, A Ferri^2,3, B González¹, M Steciow. ¹Deto. Tecnología, Univ. Nac. de Luján, ²Depto. Básicas, Univ. Nac. de Luján, ³Inst. de genética "Ewald A. Favret" CICVyA, INTA, Castelar, ⁴Inst. de Botánica Spegazzini. Fac. Cs. Naturales. e-mail: joseiribarren3@hotmail.com

Phytophthora capsici en un patógeno de gran importancia para los cultivos hortícolas por su rango de hospedantes, la magnitud de las pérdidas que ocasiona, su distribución mundial y las difcultades para su control. Al ser P. capsici una especie heterotálica requiere de dos grupos de apareamiento para reproducirse en forma sexual. La proporción de grupos presente en cada zona es variable. Esta afecta la diversidad genética del microorganismo y por lo tanto la efcacia de las estrategias de control de la enfermedad. En un total de 37 aislamientos de P. capsici obtenidos de zapallito de tronco, pimiento y berenjena en el NE de Bs. As se determinó la proporción de grupos de apareamiento y se analizó la estructura genética, de acuerdo con la secuencia de la región ITS I y II del ADNr. Se efectuó el alineamiento, el análisis de distancias y de estructura (en función del hospedante). Se evaluó la presencia de recombinación. La reconstrucción de redes flogenéticas se realizó con Network 4.6.1.0. Todos los aislamientos pertenecieron al grupo de apareamiento A1. No se observaron diferencias entre los aislamientos provenientes de distintos hospedantes, pero hubo evidencia de recombinación. Estos resultados no coinciden con el análisis morfológico donde se observó un solo tipo de apareamiento. Pero podrían ser explicados por la presencia minoritaria del otro tipo de apareamiento aún no determinado, y/ó por la entrada del patógeno a través de semillas infectadas de otras zonas geográfcas.

 

GMI 20

ABUNDANCIA Y DIVERSIDAD DE COMUNIDADES MICROBIANAS DE SUELOS BAJO DIFERENTES ROTACIONES

Barrera VA¹, R Rojo¹, G Ghiessa¹, N Lopez¹, P Baffoni², R Agamennoni², M.C Martinez¹. ¹Instituto de Microbiología y Zoología Agropecuaria e Instituto de Biotecnología. Dr. N. Repetto y De Los Reseros S/N Bs.As. Argenina, ²EEA Hilario Ascasubi. Ruta Nac. N° 3, km 794, Ascasubi (8142), Bs. As., Argentina.

e-mail: mcmartinez@cnia.inta.gov.ar

Los microorganismos del suelo tienen un importante rol por sus funciones ecológicas como así también por las propiedades ftopatogénicas de algunas especies. El objetivo de este trabajo es aplicar y desarrollar metodologías apropiadas que permitan determinar el efecto de diferentes esquemas de rotaciones en suelos cultivados con cebolla sobre la diversidad de las comunidades microbianas presentes para, en el mediano plazo, establecer esquemas que permitan reducir la incidencia de enfermedades fúngicas de suelo y favorecer la sustentabilidad del mismo desde el punto de vista microbiológico. Para ello se emplearon métodos clásicos de aislamiento y caracterización de hongos ftopatógenos y biocontroladores (del género Trichoderma) y estudios de perfles fsiológicos (CLPP) y moleculares (ARISA) sobre muestras de suelos (correspondientes a tres muestreos: 2009, 2010 y 2011) provenientes de un ensayo de rotaciones (INTA, H. Ascasubi, Bs.As.) consistente en monocultivo de cebolla o en rotaciones con otros cultivos (alfalfa, agropiro, ryegrass, vicia+avena, girasol, trigo y zapallo). Los resultados obtenidos para los aspectos estudiados indicarían que los tratamientos con rotaciones presentan una tendencia favorable en cuanto a la mayor presencia de BCAs, menor cantidad de ftopatógenos y mayor diversidad microbiológica frente al monocultivo de cebolla.