OPINIÓN

Métodos estadísticos en genética básica y aplicada: por qué, cómo y cuánto

 

Babinec F.J. ¹

¹Estación Experimental Agropecuaria Anguil, INTA
Facultad de Agronomía, UNLPampa. babinec.francisco@inta.gov.ar / fbabinec@agro.unlpam.edu.ar

"Un hombre con un martillo ve al mundo como un clavo".
Mark Twain

 

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RESUMEN

Se presenta una revisión general del tratamiento estadístico de las investigaciones en genética básica y aplicada, partiendo de una breve mención a los tipos de estudios posibles y su ámbito de aplicación. Se mencionan luego algunos problemas en experimentos y estudios observacionales, tipos de variables analizadas y algunos métodos de uso común, para luego introducir el enfoque bayesiano. Se mencionan finalmente algunos de los problemas bajo estudio actualmente y algunas metodologías empleadas, para dar al final algunas recomendaciones.

Palabras clave: Diseño experimental; Análisis estadístico; Métodos bayesianos; Métodos no paramétricos; Modelos mixtos; Programas estadísticos.

ABSTRACT

This note is an overview of the statistical treatment of research in basic and applied genetics, starting with a brief mention of the types of studies used and their scope, following with some problems in experiments and observational studies, types of variables analyzed and some commonly used methods, and introducing the Bayesian approach. Finally I mention some of the problems currently under study and methodologies used, and give some recommendations at the end.

Key words: Experimental design; Statistical analysis; Bayesian methods; Non-parametrical methods; Mixed models; Statistical software.

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INTRODUCCIÓN

La Genética y la Estadística han estado estrechamente relacionadas en su desarrollo durante el siglo XX (Nelsen, T.C. 2002). Es más, hasta el advenimiento de la revolución molecular, la Genética tenía una profunda impronta probabilística (Fisher, 1918, 1930; Mather, 1938). Algunos de los mayores desarrollos de la Estadística, por otro lado, se deben a genetistas como Henderson y otros (Pianola, 2002; Littell 2011). En verdad, la Estadística ha penetrado toda la investigación en el siglo pasado y se ha convertido en el estilo de pensamiento científico dominante, para usar la terminología de Crombie (cf. Hacking, 2007). Pero ello ha implicado también un uso y abuso de las técnicas estadísticas en muchas áreas, como la agronomía (Nelson y Rawlings, 1983; Maindonald, 1984; Dyke 1997), medicina (Altman, 1982), psicología (Hager, 2000), etc. Los problemas encontrados por éstos y otros autores van de la planificación inadecuada de las experiencias a la elección de métodos de análisis inapropiados y la interpretación incorrecta de los resultados, como resume didácticamente Warren (1986). Como reacción, muchas revistas científicas, como por ejemplo el British Medical Journal, han publicado series de artículos dedicados a tratar conceptos básicos de estadística y presentar los métodos de análisis más usados en la respectiva disciplina: ejemplos (Platt, (1997, 1998 a, 1998b); recomendaciones (Altman et al., 1983; Bailar y Mosteller, 1988; Wilkinson, 1999; Gould y Steiner, 2003); revisiones (Onofri et al., 2010; van Putten et al., 2010) o puestas al día presentando nuevas metodologías (Matson et al., 1993; Garrett et al., 2004; Machado y Petrie, 2006). Dados los continuos avances en ambas disciplinas, resulta conveniente revisar las aplicaciones más comunes de la estadística a las investigaciones en genética básica y aplicada. A lo largo del tiempo han aparecido revisiones parciales sobre el tratamiento estadístico de datos genéticos (por ej. Fisher, 1952; Lin et al., 1986; Kearsey y Farquhar, 1998; Balding, 2006; Montana, 2006; Terwilliger y Göring, 2009; Balzarini et al., 2011). Esta es una presentación general del tema, para desarrollar en notas posteriores algunas metodologías desde el punto de vista de los problemas más frecuentes a investigar. Somos conscientes de que sólo es posible cubrir una fracción del tema (Potvin y Travis, 1993); la bibliografía citada es sólo una muestra y refleja el (des)conocimiento del autor sobre la materia.

MÉTODOS ESTADÍSTICOS E INVESTIGACIONES EN GENÉTICA BÁSICA Y APLICADA

El punto de partida

Muchas de las revisiones sobre empleo de la estadística en distintas disciplinas ponen énfasis en las fallas en el análisis e interpretación. Pero el primer paso donde interviene la estadística en una investigación científica debería ser en la planificación cuidadosa de la experiencia a realizar, sea la elección de los tratamientos, si fuera un ensayo, o de las poblaciones a observar, si fuera un estudio. La diferenciación entre estudios observacionales y experimentos es crucial desde el punto de vista de las inferencias que podrán extraerse finalmente de las diferentes experiencias. En los experimentos el investigador controla ciertas variables o condiciones y puede postular relaciones causa-efecto, mientras que en los estudios observacionales puede identificar factores de riesgo o condiciones predisponentes (Scheiner, 1993). En el caso de la genética, que es básicamente el estudio de la transmisión de características a través de las generaciones (Scheiner, 2010), en general mediante la crianza experimental (Bateson, 1908), la condición experimental está dada por la elección de los progenitores y la determinación del sistema de apareamiento y las progenies (generaciones) segregantes, mientras que en los estudios observacionales será la identificación de las poblaciones caso y control. La elección de los progenitores define la población de referencia, tema objeto de amplio debate (Cockerham, 1980). La relación entre el conjunto de individuos estudiados y la población hacia la cual se hará inferencia lleva a la distinción entre modelos de efectos fijos, cuando el conjunto constituye toda la población de referencia, y aleatorios, cuando son una muestra de la misma. En los modelos mixtos hay una combinación de ambos tipos de efectos (Mc Lean et al., 1991). Otros tipos de estudios son la integración de resultados publicados previamente o meta-análisis y el análisis de bases de datos.

La técnica experimental

Se trate de experimentos o estudios, hay cuestiones comunes en su planificación, como la determinación del tamaño de muestra necesario para estimar una proporción o para representar una población (Hanson, 1959) o el número de replicaciones (Geng y Hills, 1978; Gauch y Zobel, 1996). La evaluación imparcial de las progenies segregantes requiere del diseño de experimentos apropiados, que cumplan los requisitos de replicación, aleatorización y control local establecidos por Fisher (1960; ver también White, 1984; St-Pierre, 2007; Eskridge 2009). Desde el advenimiento de los ensayos en bloques se han registrado avances tanto en la generación de nuevos diseños para elevado número de tratamientos (Edmondson, 2005; Eskridge, 2009) como en la incorporación de nuevas técnicas de análisis (Lawson y Cressie, 2000; Piepho et al., 2003, 2004; Payne, 2006; Hua y Spilke, 2011). Algunos de los problemas que pueden aparecer en las estimaciones de parámetros genéticos en plantas vinculados con el diseño y la técnica experimentales han sido revisados por Moll y Robinson (1967), Dudley y Moll (1969) y Holland et al. (2003), entre otros. Un aspecto que no siempre es tenido en cuenta es la vinculación entre el sitio experimental u observacional y el universo al que se desea inferir (Templeman, 2009). Los estudios a nivel molecular plantean nuevas dificultades tanto en diseño como en análisis (Churchill, 2002; Quackenbush, 2002; Rosa et al., 2005; para citar algunos).

Variables y análisis

El objetivo de una experiencia es la recolección de datos sobre los individuos estudiados y su interpretación. Según respondan a características preexistentes u observadas durante la marcha de la experiencia o al final de la misma, hablamos de variables clasificatorias, predictivas, explicativas o independientes y/o de covariables, y de variables respuesta o dependientes, aunque esta distinción es difusa en muchas oportunidades. En ocasiones, las variables registradas son sólo una aproximación al verdadero sujeto de estudio, o una construcción mental, como el rendimiento. Las variables, sean dependientes o independientes, pueden tomar sólo dos valores (binarias) o varios (categóricas, nominales) siguiendo a veces un orden (ordinales) o pueden tomar cualquier valor en una escala numérica (continuas). Esta clasificación sigue en gran parte la terminología introducida por Stevens (1946), quien tuvo en cuenta el efecto de distintas transformaciones sobre el monto de información que contenía cada variable. Una transformación es "permisible" o "admisible" en la medida que preserva dicho monto. Posteriormente, la extensión de estos conceptos a los métodos de análisis (Stevens, 1951, citado por Velleman y Wilkinson, 1993) dio lugar a la presentación en varios textos de tablas de métodos "admisibles", que son seguidas a veces como un canon que estipula los únicos modos posibles de analizar los datos obtenidos, en función de la escala en la que están medidas las variables de interés, sin tener en cuenta el continuo desarrollo de nuevos métodos estadísticos, y la revisión de otros ya establecidos (Cohen, 2001). Un caso especial es el de los datos de supervivencia o confiabilidad (censurados a la derecha) que han dado lugar al desarrollo de métodos específicos (Cox, 1972). Un ejemplo de lo complejo que resulta discernir el tipo de variable medida está dado por la resistencia a enfermedades, que si bien se registra siguiendo escalas más o menos aceptadas, presenta en muchos casos una suerte de continuum en la magnitud de las lesiones observadas.

El análisis estadístico

El primer paso del análisis, como se enseña en los cursos de estadística aplicada, es realizar un análisis exploratorio a fin de detectar valores extraños debidos a observaciones erróneas u otros accidentes experimentales (Platt, 1998b). A las herramientas gráficas disponibles (histogramas, gráficos de caja, de tallo y hoja, de dispersión, etc.) pueden sumarse algunas técnicas analíticas como el análisis de correlación, y ciertos métodos multivariados como los análisis de componentes principales y de correspondencia, que permiten la reducción de dimensiones, algo necesario cuando hay muchas variables respuesta medidas.
El análisis estadístico puede verse como la búsqueda de un modelo, o sea, el ajuste de los datos obtenidos a alguna distribución teórica. Dicho de otro modo, se busca explicar la variabilidad presente en la variable respuesta, separándola en partes que pueden ser explicadas de otras que no pueden serlo, lo que es la base del análisis de varianza (ANOVA). La estadística aplicada se basa en la estimación de parámetros y en la prueba de hipótesis, debidas a R. Fisher y a J. Neyman y E. Pearson, respectivamente; ambos casos requieren cumplimentar algunos supuestos, en particular sobre la distribución de la parte no explicada por el modelo propuesto. Estos supuestos, que en sí son condiciones indemostrables (Mead, 1990), se refieren tanto a la independencia de las observaciones como a la distribución de los valores observados y/o de los residuales del modelo, o sea de la fracción no explicada por el mismo. Algunas técnicas, como el ANOVA, requieren una distribución normal (gaussiana) de los residuales, a diferencia de otras a las que se denomina no-paramétricas o de distribución libre. El estudio de los residuales puede llevarnos a transformar la escala de la variable respuesta, de la explicativa, o de ambas, para ajustar una distribución normal de los mismos (Fernández, 1992), o a la opción de métodos no paramétricos (Potvin y Roff, 1993) o al empleo de modelos mixtos (Paterson y Lello, 2003; Piepho, 2003; 2004) o generalizados (Paterson y Lello, 2003; Bolker et al., 2008), en lugar del tradicional ANOVA.
La Tabla 1, adaptada de Motulsky (1995) y de Tabachnick y Fiddell (2000) presenta algunos de los métodos más usados en función de los objetivos de la investigación, de la escala en la que son registradas las variables observadas y de su condición, esto es, su jerarquía dentro de las hipótesis de trabajo y de si están bajo control del investigador o no. Estos métodos se estudian en la mayor parte de los cursos de estadística aplicada en programas de grado y posgrado, pero son sólo una parte de una batería muy extensa de pruebas disponibles para tratar distintas situaciones y por ello estas tablas sólo son orientativas. El libro de Sheskin (2011) en su quinta edición, contiene más de 300 pruebas estadísticas para análisis uni y bivariados.

Tabla 1. Sinopsis de los métodos estadísticos más usados, adaptada de Motulsky (1995) y de Tabachnick y Fiddell (2000). Ver texto para definiciones y métodos alternativos.

A consecuencia de la existencia cada vez más frecuente de grandes bases de datos generadas por el instrumental de laboratorio disponible (Kahn, 2011) y el continuo desarrollo de nuevas metodologías, vemos una constante renovación de los métodos aplicados (Wang et al., 2011), algunos con nombres sugestivos como redes neuronales o árboles de decisión entre otros (Niederberger, 1996; Sanogo y Yang, 2004). Ciertos métodos basados en el uso intensivo de los datos, llamados de remuestreo (resampling, bootstrapping, jackknife) han ganado popularidad dado el avance en la capacidad de cálculo de las computadoras personales (Yu, 2003).

La mirada Bayesiana

En los últimos años el enfoque bayesiano ha ganado espacio frente al tradicional o frecuentista, sobre todo en áreas de la medicina y de la economía, pero también en ecología (Reckhow, 1990; Dennis, 1996 y trabajos allí citados) y en agronomía (Mila y Carriquiry, 2004; Edwards y Jannick, 2006; Costes et al., 2006). Para explicar la diferencia con el enfoque clásico o frecuentista seguiremos a Gajewski y Simon (2008). Los métodos bayesianos permiten combinar la información previa con los datos observados. La información previa puede obtenerse de estudios realizados previamente o de opinión experta. Partiendo del teorema de Bayes

Información total = Información histórica + Datos

que en la literatura bayesiana vemos mencionar como "distribución posterior", "verosimilitud (likelihood)" y "distribución previa (prior)", respectivamente. Vemos que el análisis (posterior) es una combinación del conocimiento del investigador sobre el fenómeno bajo estudio antes de realizar la experiencia con los que se aprende de los datos obtenidos al concretarla. En el análisis clásico

Información total = Datos

la información previa no juega ningún rol, y sólo se tienen en cuanta los datos. Conceptualmente, en ausencia de información previa, ambos modos de analizar brindan los mismos resultados. Dicho de otro modo, el enfoque bayesiano nos permite actualizar el conocimiento existente con nueva información. En teoría, es una alternativa simple a la inferencia estadística conocida a partir de la distribución posterior. Pero en la práctica, esta sólo puede obtenerse analíticamente en casos muy sencillos, y la solución sólo puede obtenerse computacionalmente usando métodos de simulación (Monte Carlo principalmente), generando muestras de la distribución posterior y estimando los parámetros de interés a partir de las mismas. Dos aspectos cruciales son la elección de la distribución previa y si se alcanza o no la convergencia; en caso de elección de una distribución previa inadecuada o de no llegar a la convergencia, las inferencias son tanto imprecisas como confusas o directamente erróneas (Christensen 2005).
Ambos enfoques, clásico o frecuentista y bayesiano, tiene sus pros y contras. Usando un punto de vista pragmático (Chatfield, 2002) la elección depende del objetivo: si se dispone de información previa que se quiere incorporar al análisis, lo indicado sería usar un método bayesiano, que tiene la ventaja de presentar resultados en términos de probabilidad más accesibles. El enfoque bayesiano permite responder cuestiones específicas mejor que un estimador puntual clásico. Pero si se está interesado en la estimación de parámetros, aún en casos complejos, no es necesario recurrir a métodos bayesianos (SAS Institute, 2008). Pero una mirada más rigurosa (Dennis, 1996) enfatiza que la adopción de uno u otro enfoque implica una distinta filosofía de la ciencia en cada caso, y la adopción o rechazo de ciertos conceptos centrales como el rol de la aleatorización, valores de p e intervalos de confianza. Una introducción interesante al uso de métodos bayesianos y su aplicación en epidemiología se encuentra en Greenland (2006; 2007); véase también el artículo de Cressie et al. (2009) y la discusión subsiguiente en la revista Ecological Applications, y la sección "Bayesian Analysis: Advantages and Disadvantages" en el manual de SAS (2008).
Programas estadísticos
La revolución estadística se ha visto complementada, posibilitada y potenciada por la disponibilidad de programas de computación que permiten aplicar a cualquier conjunto de datos los métodos reseñados. Los hay gratuitos y disponibles en la Web, para uso en bioestadística como el Epi-Info (http://wwwn.cdc.gov/epiinfo/) o el G-Stat (www.g-stat.es/), algunos específicos para métodos no paramétricos (MSTAT, http://mcardle.oncology.wisc.edu/mstat), otros concebidos para las necesidades de programas de mejoramiento genético vegetal (Crop-Stat, www.irri.org), o para investigaciones en genética como el InfoGen en su versión estudiantil (www.info-gen.com.ar, Balzarini y Di Rienzo, 2011). Otros permiten un gran número de análisis a través de comandos organizados en "scripts" y son onerosos como SAS (www.sas.com) o GenStat y AS-REML (http://www.vsni.co.uk/) o gratuitos como R (www.r-project.org/). El programa WinBUGS (http://www.mrc-bsu.cam.ac.uk/bugs/) es el más usado para aplicar métodos bayesianos. Escapa a esta reseña la mención de los programas específicos para los estudios a nivel molecular por su número y rápida evolución. La variedad de métodos disponibles en los programas estadísticos y la facilidad de su uso, en muchos casos lleva a un análisis impropio y a una interpretación equivocada de la información contenida en los datos (Appleton, 1995c). Para un uso eficiente es necesario reconocer la estructura subyacente en los mismos (Appleton, 1995a; 1995b), y elegir los programas estadísticos para cubrir las necesidades reales de análisis que enfrentamos a partir de un estudio integral de los mismos (Li et al., 2011).

Algunos problemas actuales

Algunos temas de la investigación en genética básica y aplicada y su correspondiente análisis estadístico han recibido un tratamiento intensivo en los últimos 25 años (Carbonell y Bramardi, 2001; Gianola, 2001). El primero de ellos, en un orden arbitrario, es la interacción genotipo x ambiente, que constituye un desafío constante para el desarrollo de nuevas variedades (Annichiarico, 2002). El análisis de series de experimentos a escala regional, nacional, e incluso mundial, en base a métodos uni y multivariados (Yue et al., 1997; Flores et al., 1998) ha dado lugar a un continuo avance en el mejoramiento genético y a establecer nuevos conceptos como el de mega-ambientes (Gauch y Zobel, 1997). Los estudios a nivel molecular (Speed y Zhou, 2009, y otros trabajos incluidos en ese número de Statistical Methods in Medical Research) han generado inmensas bases de datos cuyo análisis requiere desarrollar nuevos métodos (Terwilliger y Göring, 2009; Kahn, 2011; Ogutu et al., 2012). Un aspecto que no puede pasarse por alto es la dificultad en replicar los resultados de este tipo de estudios (Ioannidis et al 2008). La búsqueda de nuevas fuentes de germoplasma y la caracterización de las colecciones de poblaciones y razas implican un adecuado estudio de la diversidad usando distintas técnicas multivariadas (Hu et al., 2000; Carbonell y Bramardi, 2001; Balzarini et al., 2011). El mejoramiento animal también ha generado grandes masas de datos, cuyo análisis requirió el desarrollo de nuevos conceptos como el de BLUPs (predictores insesgados) y de métodos tales como los modelos mixtos, que luego se han generalizado (Pianola, 2001; Littell, 2011). Puede verse que la dirección actual es la integración de información de distintas fuentes y el tratamiento de grandes bases de datos.

Coda

El paso final de toda investigación es la presentación de los resultados y su interpretación en congresos o en trabajos publicados en revistas científicas y luego de divulgación, si cabe. El uso de tablas, gráficos y figuras (Wainer, 1992) permite una comprensión rápida, aunque en la práctica suele estar limitado al empleo de gráficos de barras o de dispersión sin medidas del error (Cooper et al., 2002) generados por hojas de cálculo, con sus limitaciones (Vidmar, 2007). Cada instancia de publicación tiene sus normas propias, pero hay buenas guías que pueden seguirse, sobre todo para la presentación gráfica (Yandell, 2007). La disponibilidad de herramientas y sobre todo de conceptos y guías sobre comunicación efectiva (Pocock et al., 2008) deberían permitirnos presentar claramente nuestros resultados y conclusiones.

CONCLUSIÓN

¿Significa todo esto que debemos conocer y/o emplear todos los métodos? En modo alguno. Después de todo, si entendemos qué implica hablar de media o mediana, desvío (y error estándar) o rango, e intervalo de confianza, y sabemos cuándo usar chi cuadrado, t de Student, regresión linear y ANOVA, podemos entender la mayor parte de los trabajos publicados (Reed et al., 2003; Al-Benna et al., 2010). Pero es necesario que los investigadores sean conscientes de las alternativas disponibles, y elijan la metodología de análisis con criterio amplio.
Citando un manual de 1992 de la Auditoría estadounidense (US General Accounting Office), para que una investigación sea fructífera se requiere (1) la comprensión de una amplia gama de métodos de análisis de datos, (2) la planificación temprana de la forma en que se analizarán los datos y la revisión de los métodos a medida que el trabajo avanza, (3) identificar cuáles métodos responden mejor a las preguntas formuladas en el estudio, dados los datos obtenidos, y (4) una vez que el análisis ha finalizado, reconocer cómo las debilidades presentes en los datos y/o en el análisis afectan las conclusiones que se han extraído (traducción libre del autor). Hoy es posible para cualquier investigador poner a prueba mediante simulación la metodología de análisis empleada y otras alternativas (MacArdle y Anderson 2004). Conviene tener presente que no todos los hallazgos y descubrimientos informados son luego confirmados, sea por una planificación indecuada, una técnica experimental imperfecta o un análisis incorrecto (cf. Begley y Ellis 2012).

AGRADECIMIENTOS

Mi interés en este tema proviene de sendos cursos dictados por María Inés Oyarzábal y Jorge Mariotti hace tiempo. Una versión previa fue leída y comentada por Valeria Borelli y Valeria Paccapelo, y Elsa Camadro me estimuló a concluirla. Los errores, omisiones y arbitrariedades son responsabilidad mía.
Varias ideas provenen de una presentación a una mesa redonda organizada por Martín Grondona en el seno del Grupo Argentino de Biometría en 2006.

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