SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.23 issue2Taxonomy and phylogenetic analysis of Aspergillus section nigri isolated from yerba mate in Misiones (Argentina)La aptitud combinatoria específica en el maíz (Zea mays L. ssp. mays) para doble propósito en Río Cuarto, Córdoba, Argentina author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

Indicators

  • Have no cited articlesCited by SciELO

Related links

Share


BAG. Journal of basic and applied genetics

On-line version ISSN 1852-6233

BAG, J. basic appl. genet. vol.23 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires Dec. 2012

 

RESEARCH

Poliformismo en los genes estearoil-coenzima A desaturasa y Acil-CoA: diacilglicerol aciltransferasa 1 en el ganado Siboney de Cuba

 

Acosta A. 1*, Uffo O. 1, Ronda R. 1, Fernandes Z. 2, Lopes F. 3, Gomes-Filho M.A. 2, Barbosa S.B.P. 3

1Laboratorio de Genética Molecular (GenMol), Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) PO Box 10, San José de las Lajas, CP 32700, Mayabeque, Cuba.
2Laboratório Fisiologia Animal Molecular Aplicada (FAMA), Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), CEP 55292-901, Recife, Pernambuco, Brasil.
3Programa de Gerenciamento de Rebanhos Leiteiros do Nordeste (PROGENE), Departamento de Zootecnia, UFRPE, CEP 55292-901, Recife, Pernambuco, Brasil.
* acabad80@gmail.com

 


RESUMEN

La composición de ácidos grasos en la leche es de gran importancia para evaluar la calidad nutricional de los productos lácteos. Se estudiaron los polimorfismos A293V del locus estearoil-coenzima A desaturasa (SCD) y K232A del locus Acil-CoA: diacilglicerol aciltransferasa 1 (DGAT1). Ambas enzimas tienen una importante función en el metabolismo lipídico. El objetivo fue determinar las frecuencias génicas en la raza Siboney de Cuba (N=165). La metodología empleada para ambos loci fue la amplificación creando el sitio de restricción (ACRS). Se observó que los alelos SCDA y DGAT1A fueron los más frecuentes en la población estudiada. Se identificaron los tres genotipos en ambos loci, con frecuencias en el locus SCD de 0,821; 0,172 y 0,007 para los genotipos AA, AS y SS respectivamente, mientras que las frecuencias de los genotipos AA, AK y KK fueron de 0,686; 0,212 y 0,102 en el locus DGAT1. El locus SCD se encuentra en equilibrio Hardy-Weinberg, no siendo así para el locus DGAT1 (p<0,001).

Palabras clave: Bovino; SCD; DGAT1; Frecuencia alélica.

ABSTRACT

Milk fat composition is one of the factors influencing the nutritional quality of dairy products. We studied the A293V polymorphisms in the Stearoyl-Coenzyme A Desaturase locus (SCD) and the K232A polymorphisms in the Acyl CoA: Diacylglycerol Acyltransferase 1 locus (DGAT1). Both enzymes have an important role in lipid metabolism. The aims of the present study was to determine gene frequencies for both loci in the breed Siboney de Cuba (N=165). The methodology for both loci was amplification created restriction sites (ACRS). We observed that the SCDA allele and the DGAT1A allele were the most frequent in the studied population. Three genotypes were identified at each locus, with the following frequencies: 0.821, 0.172 and 0.007 for genotypes AA, AS and SS, respectively, at the SCD locus and 0.686, 0.212 and 0.102 for genotypes AA, AK and KK, respectively, at the DGAT1 locus. The SCD locus was in Hardy-Weinberg equilibrium, whereas a deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium (p <0,001) was found at the DGAT1 locus.

Key words: Cattle; SCD; DGAT1; Allele frequency.


 

INTRODUCCIÓN

Es creciente el interés en la composición de ácidos grasos en la leche como parámetro de gran importancia para evaluar la calidad nutricional de la misma (Morris et al., 2007; Schennink et al., 2008; Schennink et al., 2009a; Schennink et al. 2009b). Se conoce que la concentración de ácidos grasos en la leche está influenciada en gran medida por la alimentación que reciben los animales (Jenkins y McGuire, 2006), pero la bibliografía sugiere que el estudio de genes candidatos asociados a este carácter pudiese contribuir a obtener producciones lácteas de mayor valor nutricional (Schennink et al., 2008; Signorelli et al., 2009; Conte et al., 2010; Wang et al., 2011).
En diferentes investigaciones se propone el estudio como genes candidatos a estearoil-coenzima A desaturasa (Stearoyl-Coenzyme A Desaturase SCD) y a Acil-CoA: diacilglicerol aciltransferasa 1 (Acyl CoA: Diacylglycerol Acyltransferase 1 DGAT1) (Mele et al., 2007; Näslund et al., 2008; Schennink et al., 2008; Maharani et al., 2012). En el locus SCD se describe un polimorfismo de nucleótido simple (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) en el exón 5 que causa la sustitución del aminoácido alanina (alelo A) por valina (alelo V) en la posición 293 de la cadena aminoacídica (Taniguchi et al., 2004). Se ha descrito una relación significativa entre el polimorfismo A293V del locus SCD con producción de leche, contenido de grasa y la composición de la fracción lipídica de la leche (Mele et al., 2007; Macciotta et al., 2008; Kgwatalala et al., 2009a Mao et al., 2012). En el locus DGAT1 la sustitución aminoacídica de lisina (alelo K) por alanina (alelo A) en la posición 232 se asocia a variaciones en la composición de ácidos grasos en la leche (Kaupe et al., 2007; Schennink et al., 2007), así como al contenido de grasa y proteína en la misma (Signorelli et al., 2009).
Siboney de Cuba es una raza sintética obtenida a partir del cruzamiento 5⁄8 Holstein - 3⁄8 Cebú Cubano, la cual juega un papel preponderante en la producción láctea en el país. El objetivo del presente trabajo fue determinar las frecuencias génicas de los polimorfismos A293V del locus SCD y K232A del locus DGAT1 en la raza Siboney de Cuba.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales y obtención del material genético

Cumpliendo las normas establecidas del comité de ética y bienestar animal, se tomaron muestras de sangre periférica de 165 vacas de la raza Siboney de Cuba. Se emplearon 0.5 ml de 0.5 M EDTA como anticoagulante y se procedió a la extracción y purificación del ADN mediante el método de precipitación salina descrito por Miller et al. (1988).

Genotipado de los loci SCD y DGAT1

Los polimorfismos de interés en estos dos loci, fueron estudiados a partir del desarrollo de la metodología de ACRS combinada con el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR) en ambos casos. Los oligonucleótidos empleados en la PCR fueron diseñados con el empleo del programa Vector NTI AdvanceTM 11.0 (Invitrogen Corporation 2008) (Tabla 1). El volumen final de la reacción fue de 25 µL constituida por buffer de reacción 10X (conteniendo 10mM TrisHCl, pH 9; 50mM KCl y 0,1 % Triton X-100), 50mM MgCl2, 1,25mM dNTPs, 20nmol/µL de oligonucleótido correspondiente y 5U/µL de polimerasa ADN comercial (Fermentas), completándose el volumen final con agua. Los programas de amplificación empleados para ambos loci fueron similares, variando sólo en la temperatura de alineamiento. Dichos programas constaron de 94oC por 5min en la etapa de desnaturalización, seguido por 32 ciclos de 94oC por 1min, 1min de alineamiento y 72oC por 1min; el tiempo final de extensión fue de 5min a 72oC.

Tabla 1. Oligonucleótidos y enzimas de restricción empleadas en la amplificación de los fragmentos SCD y
DGAT1.

aTemperatura de alineamiento.

A partir de 10µL del producto amplificado se procedió a la digestión con las enzimas específicas para cada uno de los fragmentos (Tabla 1). La temperatura de incubación fue de 37oC durante 3 hs. La visualización del producto digerido se realizó en gel de agarosa al 2%, TBE 0,5X, con tinción de Blue Green Loading Dye I (LGC Biotecnologia), empleando 0,3µL por cada 5µL de producto digerido.

Procesamiento estadístico

El programa GENEPOP versión 3,4 (Raymond y Rousset, 1995; Rousset, 2008) se empleó para realizar el cálculo de las frecuencias alélicas y genotípicas, y la prueba exacta de la desviación de los loci del estado de equilibrio Hardy-Weinberg. El cálculo de la heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) por locus se realizó usando el programa ARLEQUIN (Excoffier et al., 2005).

RESULTADOS

A partir de los oligonucleótidos diseñados se obtuvieron fragmentos amplificados de 257pb para el locus SCD y de 210pb para el locus DGAT1. El empleo de la metodología de creación de sitio de restricción permitió visualizar los tres genotipos para ambos loci (Figuras 1 y 2).


Figura 1. Amplificación y digestión de SCD, Línea M: MPM 50pb, Línea 1: producto amplificado, Línea 2: genotipos AA, Línea 3: genotipos AV, Línea 4: genotipos VV, Línea 5: control negativo.


Figura 2. Amplificación y digestión de DGAT1 Línea M: MPM 50pb, Línea 1: producto amplificado, Línea 2: genotipos AA, Línea 3: genotipos KK, Línea 4: genotipos AK, Línea 5: control negativo.

Las frecuencias alélicas y genotípicas para cada locus se muestran en la Tabla 2. En el locus SCD el alelo más frecuente fue SCDA, siendo la heterocigocidad observada mayor que la esperada, y se comprobó que este locus se muestra en estado de equilibrio Hardy-Weinberg. El locus DGAT1 presentó el alelo DGAT1A más frecuentemente, observándose una desviación del estado de equilibrio Hardy-Weinberg (p<0,001), con una disminución de la heterocigocidad observada con respecto a la esperada.

Tabla 2. Frecuencias alélicas y genotípicas, heterocigocidad observada (Ho) y esperada (He) y prueba exacta
de equilibrio Hardy-Weinberg.

***p<0.001

DISCUSIÓN

El comportamiento de las frecuencias alélicas del locus SCD en la raza Siboney de Cuba es similar a lo descrito en otras investigaciones, con predominio del alelo SCDA. En el caso de estudios en animales de la raza Holstein la frecuencia del alelo SCDA se encuentra entre 0,57 y 0,796 (Mele et al., 2007; Komisarek y Dorynek, 2009; Signorelli et al., 2009; Wang et al., 2011; Mao et al., 2012). Razas como la Jersey presentan valores de la frecuencia de SCDA superiores a los antes mencionados, en el rango de 0,808 a 0,94 (Moioli et al., 2007; Demeter et al., 2009; Kgwatalala et al., 2009b; Signorelli et al., 2009). La mayor parte de las otras razas estudiadas presentan mayor frecuencia del alelo SCDA (Taniguchi et al., 2004; Schennink et al., 2008; Matsuhashi et al., 2010). Se describen las poblaciones de ganado Carmelita Italiano (Conte et al., 2010) y ganado coreano Hanwoo (Maharani et al., 2012) con valores en la frecuencia del alelo SCDA inferior a 0,5.
La heterocigocidad observada en la raza Siboney fue ligeramente superior a la esperada en el locus SCD y tras la prueba exacta de equilibrio Hardy-Weinberg se observó que mantenía la condición de equilibrio. En la mayoría de los estudios consultados, el locus SCD se mantiene bajo la condición de equilibrio Hardy-Weinberg (Schennink et al., 2008; Demeter et al., 2009; Conte et al., 2010; Maharani et al., 2012; Mao et al., 2012). Por otra parte, las poblaciones de ganado Negro Japonés (Taniguchi et al., 2004) y Holstein Friesian Italiano (Mele et al., 2007) se describen como fuera de esta condición de equilibrio, observándose en ambos casos un exceso de heterocigotos.
En el locus DGAT1, el alelo con mayor frecuencia es el DGAT1A, lo cual era de esperar debido a la alta proporción de Holstein (5/8) por la que está formada la raza Siboney. El Girolando brasileño, que es otra raza híbrida, mostró a DGAT1A como el alelo de mayor frecuencia (Cardoso et al., 2011). En tal sentido los estudios realizados por Winter et al. (2002) y Lacorte et al. (2006) muestran que en las razas de Bos taurus el alelo DGAT1A tiene las mayores frecuencias. Igualmente en los estudios de Kaupe et al. (2004), en los que se evaluó el polimorfismo K232A en 38 razas, se observó que en 31 de ellas la frecuencia del alelo DGAT1A es superior a 0,5; en las siete razas restantes en las que predomina el alelo DGAT1K se agrupan las tres poblaciones de Bos indicus y cuatro de las poblaciones con alto contenido de grasa en la leche, a partir de la clasificación realizada por Jensen (1995). Los estudios realizados en Holstein Friesian Alemán (Schennink et al., 2008; Demeter et al., 2009), ganado Carmelita Italiano (Conte et al., 2010), Holstein Chino (Mao et al., 2012), las tres razas estudiadas por Gautier et al. (2007) y las dos estudiadas por Näslund et al. (2008) mostraron que el alelo DGAT1A tiene frecuencia predominante. En cambio, dos de las tres poblaciones de ganado neozelandés estudiadas por Spelman et al. (2002) y el Holstein Alemán (Kaupe et al., 2007) mostraron a DGAT1K como el alelo predominante.
Se aprecia una desviación del estado de equilibrio Hardy-Weinberg en la raza Siboney de Cuba (p<0,001) debido a un aumento del genotipo DGAT1AA, lo que evidencia una disminución considerable de la heterocigocidad observada con respeto a la esperada. La condición de desequilibrio en el locus DGAT1 fue descrita en dos de las seis poblaciones estudiadas por Lacorte et al. (2006), mientras que en razas como el Holstein Friesian Alemán (Schennink et al., 2008; Demeter et al., 2009), el ganado Carmelita Italiano (Conte et al., 2010), el Girolando (Cardoso et al., 2011) y el Holstein Chino (Mao et al., 2012) se observa este locus bajo la condición de equilibrio Hardy-Weinberg.

CONCLUSIONES

Se identificaron las dos variantes alélicas en los loci estudiados. Los alelos SCDA y DGAT1A fueron los de mayor frecuencia en la población Siboney de Cuba. Se observó que el locus SCD se encuentra bajo la condición de equilibrio Hardy-Weinberg, no siendo así la condición para el locus DGAT1 (p<0,001).

AGRADECIMIENTOS

Los autores quieren agradecer el soporte financiero brindado por el proyecto CAPES-MES 085-09, Brasil-Cuba para la realización de esta investigación. También agradecemos las facilidades brindadas por la Dirección Nacional de Genética y la Empresa Valle de Perú para la obtención de muestras del rebaño Siboney de Cuba.

BIBLIOGRAFÍA

1. Cardoso S.R., Queiroz L.B., Goulart V.A., Mourão G.B., Benedetti E., Goulart L.R. (2011) Productive performance of the dairy cattle Girolando breed mediated by the fat-related genes DGAT1 and LEP and their polymorphisms. Research in Veterinary Science 91: 107-112.         [ Links ]

2. Conte G., Mele M., Chessa S., Castiglioni B., Serra A., Pagnacco G., Secchiari P. (2010) Diacylglycerol acyltransferase 1, stearoyl-CoA desaturase 1, and sterol regulatory element binding protein 1 gene polymorphisms and milk fatty acid composition in Italian Brown cattle. Journal of Dairy Science 93: 753-763.         [ Links ]

3. Demeter R.M., Schopen G.C.B., Oude Lansink A.G.J.M., Meuwissen M.P.M., Van Arendonk J.A.M. (2009) Effects of milk fat composition, DGAT1, and SCD1 on fertility traits in Dutch Holstein cattle. Journal of Dairy Science 92: 5720-5729.         [ Links ]

4. Excoffier L., Laval G., Schneider S. (2005) Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: 47-50.         [ Links ]

5. Gautier M., Capitan A., Fritz S., Eggen A., Boichard D., Druet T. (2007) Characterization of the DGAT1 K232A and Variable Number of Tandem Repeat Polymorphisms in French Dairy Cattle. Journal of Dairy Science 90: 2980-2988.         [ Links ]

6. Jenkins T.C., McGuire M.A. (2006) Major advances in nutrition: Impact on milk composition. Journal Dairy Science 89: 1302-1310.         [ Links ]

7. Jensen R.G. (1995) Handbook of Milk Composition. Academic Press, San Diego, USA.         [ Links ]

8. Kaupe B., Brandt H., Prinzenberg E., Erhardt G. (2007) Joint analysis of the influence of CYP11B1 and DGAT1 genetic variation on milk production, somatic cell score, conformation, reproduction, and productive lifespan in German Holstein cattle. Journal of Animal Science 85: 11-21.         [ Links ]

9. Kaupe B., Winter A., Fries R., Erhardt G. (2004) DGAT1 polymorphism in Bos indicus and Bostaurus cattle breeds. Journal of Dairy Research 71: 182-187.         [ Links ]

10. Kgwatalala P.M., Ibeagha-Awemu E.M., Mustafa A.F., Zhao X. (2009a) Stearoyl-CoA desaturase 1 genotype and stage of lactation influences milk fatty acid composition of Canadian Holstein cows. Animal Genetics 40: 609-615.         [ Links ]

11. Kgwatalala P.M., Ibeagha-Awemu E.M., Mustafa A.F., Zhao X. (2009b) Influence of stearoyl-coenzyme A desaturase 1 genotype and stage of lactation on fatty acid composition of Canadian Jersey cows. Journal of Dairy Science 92: 1220-1228.         [ Links ]

12. Komisarek J., Dorynek Z. (2009) Effect ofABCG2, PPARGC1A, OLR1 andSCD1 gene polymorphism on estimated breeding values for functional and production traits in Polish Holstein-Friesian bulls. Journal of Applied Genetics 50: 125-132.         [ Links ]

13. Lacorte G., Machado M., Martinez M., Campos A., Maciel R., Verneque R., Teodoro R., Peixoto M., Carvalho M., Fonseca C. (2006) DGAT1 K232A polymorphism in Brazilian cattle breeds. Genet. Mol. Res. 5: 475-482.         [ Links ]

14. Macciotta N.P.P., Mele M., Conte G., Serra A., Cassandro M., Dal Zotto R., Cappio Borlino A., Pagnacco G., Secchiari P. (2008) Association Between a Polymorphism at the Stearoyl CoA Desaturase locus and Milk Production Traits in Italian Holsteins. Journal of Dairy Science 91: 3184-3189.         [ Links ]

15. Maharani D., Jung Y., Jung W., Jo C., Ryoo S., Lee S., Yeon S., Lee J. (2012) Association of five candidate genes with fatty acid composition in Korean cattle. Molecular Biology Reports. doi:10.1007/s11033-011-1426-6        [ Links ]

16. Mao Y.J., Chen R.J., Chang L.L., Chen Y., Ji D.J., Wu X.X., Shi X.K., Wu H.T., Zhang M.R., Yang Z.P., König S., Yang L.G. (2012) Effects of SCD1- and DGAT1-genes on production traits of Chinese Holstein cows located in the Delta Region of Yangtze River. Livestock Science. doi:10.1016/j.livsci.2011.12.019        [ Links ]

17. Matsuhashi T., Maruyama S., Uemoto Y., Kobayashi N., Mannen H., Abe T., Sakaguchi S., Kobayashi E. (2010) Effects of FASN, SCD, SREBP1 and GH gene polymorphisms on fatty acid composition and carcass traits in Japanese Black cattle. Journal of Animal Science. doi: 10.2527/jas.2010-3121        [ Links ]

18. Mele M., Conte G., Castiglioni B., Chessa S., Macciotta N.P.P., Serra A., Buccioni A., Pagnacco G., Secchiari P. (2007) Stearoyl-Coenzyme A Desaturase Gene Polymorphism and Milk Fatty Acid Composition in Italian Holsteins. Journal of Dairy Science 90: 4458-4465.         [ Links ]

19. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Research 16: 12-15.         [ Links ]

20. Moioli B., Contarini G., Avalli A., Catillo G., Orrù L., De Matteis G., Masoero G., Napolitano F. (2007) Short Communication: Effect of Stearoyl-Coenzyme A Desaturase Polymorphism on Fatty Acid Composition of Milk. Journal of Dairy Science 90: 3553-3558.         [ Links ]

21. Morris C.A., Cullen N.G., Glass B.C., Hyndman D.L., Manley T.R., Hickey S.M., McEwan J.C., Pitchford W.S., Bottema C.D.K., Lee M.A.H. (2007) Fatty acid synthase effects on bovine adipose fat and milk fat. Mammalian Genome 18: 64-74.         [ Links ]

22. Näslund J., Fikse W.F., Pielberg G.R., Lundén A. (2008) Frequency and Effect of the Bovine Acyl-CoA:Diacylglycerol Acyltransferase 1 (DGAT1) K232A Polymorphism in Swedish Dairy Cattle. Journal of Dairy Science 91: 2127-2134.         [ Links ]

23. Raymond M., Rousset F. (1995) Genepop (Version-1.2) - Population-Genetics Software for Exact Tests and Ecumenicism. Journal of Heredity 86: 248-249.         [ Links ]

24. Rousset F. (2008) Genepop'007: a complete reimplementation of the Genepop software for Windows and Linux. Mol. Ecol. Resources 8: 103-106.         [ Links ]

25. Schennink A., Bovenhuis H., Léon-Kloosterziel K.M., Van Arendonk J.A.M., Visker M.H.P.W. (2009a) Effect of polymorphisms in the FASN, OLR1, PPARGC1A, PRL and STAT5A genes on bovine milk-fat composition. Animal Genetics 40: 909-916.         [ Links ]

26. Schennink A., Stoop W.M., Visker M.H.P.W., Van der Poel J.J., Bovenhuis H., Van Arendonk J.A.M. (2009b) Short communication: Genome-wide scan for bovine milk-fat composition. II. Quantitative trait loci for long-chain fatty acids. Journal of Dairy Science 92: 4676-4682.         [ Links ]

27. Schennink A., Heck J., Bovenhuis H., Visker M., Van Valenberg H., Van Arendonk J. (2008) Milk fatty acid unsaturation: genetic parameters and effects of stearoyl-CoA desaturase (SCD1) and acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1). Journal of Dairy Science 91: 2135-2143.         [ Links ]

28. Schennink A., Stoop W.M., Visker M.H.P.W., Heck J.M.L., Bovenhuis H., Van Der Poel J.J., Van Valenberg H.J.F., Van Arendonk J.A.M. (2007) DGAT1 underlies large genetic variation in milk-fat composition of dairy cows. Animal Genetics 38: 467-473.         [ Links ]

29. Signorelli F., Orrù L., Napolitano F., De Matteis G., Scatà M.C., Catillo G., Marchitelli C., Moioli B. (2009) Exploring polymorphisms and effects on milk traits of the DGAT1, SCD1 and GHR genes in four cattle breeds. Livestock Science 125: 74-79.         [ Links ]

30. Spelman R.J., Ford C.A., McElhinney P., Gregory G.C., Snell R.G. (2002) Characterization of the DGAT1 Gene in the New Zealand Dairy Population. Journal of Dairy Science 85: 3514-3517.         [ Links ]

31. Taniguchi M., Utsugi T., Oyama K., Mannen H., Kobayashi M., Tanabe Y., Ogino A., Tsuji S. (2004) Genotype of stearoyl-CoA desaturase is associated with fatty acid composition in Japanese Black cattle. Mammalian Genome 14: 142-148.         [ Links ]

32. Wang X., Chen R., Yang Z., Mao Y., Ji D., Chen Y., Chang L., Li Y., Li R. (2011) Genetic Polymorphism of the SCD1 Gene and Its Associations with Milking Traits in Chinese Holstein. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences. doi: CNKI:SUN:XMSY.0.2011-07-019        [ Links ]

33. Winter A., Krämer W., Werner F.A.O., Kollers S., Kata S., Durstewitz G., Buitkamp J., Womack J.E., Thaller G., Fries R. (2002) Association of a lysine-232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content. Proceedings of the National Academy of Sciences 99: 9300-9305.         [ Links ]