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BAG. Journal of basic and applied genetics

versión On-line ISSN 1852-6233

BAG, J. basic appl. genet. vol.24  supl.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires oct. 2013

 

COMUNICACIONES LIBRES

Epigenética

 

EPG 1
DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS PROGENITORAS RETINALES MEDIANTE SEÑALES EPIGENÉTICAS EN BIOENSAYOS 3D

Fernández JP, AM Cruz Gaitán, NG Carri.

IMBICE, Instituto Multidisciplinario de Biología Celular- La Plata - Buenos Aires, Argentina.
e-mail: jfernandez@imbice.gov.ar

En la Zona Ciliar Marginal (ZCM) de la retina de aves y mamíferos se ha descubierto la presencia de células progenitoras, pero poco se conoce sobre los mecanismos de inducción de la proliferación y la diferenciación mediados por señales epigenéticas. Asimismo, el conocimiento de estos mecanismos es de suma importancia en el desarrollo de estrategias terapéuticas para lesiones retinales. Mediante bioensayos 3D se analizó el perfil morfológico e inmunológico de células de la ZCM de embriones de ave (pollo y codorniz), cultivadas en suspensión bajo condiciones basales con Stem Cells Media. A las 72 horas de cultivo primario, se realizó un pasaje de Neuroesferas (NS) disociadas manteniéndose las condiciones iniciales. Luego de la formación de NS de segunda generación (72 hs), se procedió a la estimulación con distintos factores tróficos (FGF9, GDNF, Noggin) sobre gel de colágeno I. Bajo la acción de estas señales epigenéticas se observó activación de la diferenciación celular, evidenciado por un aumento en la aparición y extensión de neuritas en todos los tratamientos respecto al control. La expresión de marcadores de proliferación (PCNA, KI67) y de progenitores (GFAP, Nestina, Vimentina, O4, A2B5, Pax6, S100, TubIII, NeuN, NSE) se analizó mediante inmunocitoquímica obteniéndose distintas marcas positivas de acuerdo al tratamiento. El cultivo 3D sobre colágeno I proporciona un excelente medio de crecimiento y sostén facilitando así el estudio de los procesos de diferenciación retinal producto de la activación del tándem génico de éstas células.

EPG 2
SEÑALES EPIGENÉTICAS QUE INDUCEN LA DIFERENCIACIÓN DE PROGENITORES NEURALES EN BIOENSAYOS 3D

Cruz Gaitan AM, JP Fernandez, NG Carri.

Instituto Multidisciplinario de Biología Celular.
e-mail: carla.gimenez@hospitalitaliano.org.ar

En la zona subventricular de los mamíferos se demostró la existencia de células progenitoras pero poco se conoce acerca de la activación génica que induce su proliferación y diferenciación mediante señales tróficas, asunto relevante en la investigación de la neuroregeneración. Mediante bioensayos 3D se analizó el perfil morfo-inmune de células de Cuerpo Estriado (CE) de embriones de rata E14 cultivadas en suspensión bajo condiciones basales con stem cells media (48 h), y luego de la formación de Neuroesferas (NS) éstas se estimularon con Factores tróficos (FT) tales como NGF, NTN, NT-3, FGF9 ó NOOGIN sobre gel de colágeno I. A las 72 horas del cultivo primario se realizó un repique de NS disociadas manteniendo las condiciones iniciales hasta la nueva formación de las mismas y repitiendo el proceso de siembra en colágeno y estimulación con FT. La expresión de marcadores de proliferación (PCNA, KI67) y de progenitores (GFAP, Nestina, Vimentina, O4, A2B5, Pax6, S100, TubIII, NeuN, NSE) se analizó mediante inmunocitoquímica obteniéndose marcas positivas, además se evidenció una óptima aparición y extensión de neuritas y células gliales en todos los cultivos cuyo nicho se encontraba influenciado con señales epigenéticas, especialmente aquellos estimulados con NT-3, FGF9 y NOGGIN. La activación del tándem génico de células progenitoras neurales obtenidas de CE y cultivadas en matrices 3D de gel de colágeno I, proporciona una excelente herramienta para estudiar su proliferación y en términos de neuritogénesis su diferenciación bajo la acción de señales epigenéticas-tróficas.

EPG 3
EPIGENÉTICA Y EXPRESIÓN GÉNICA EN FIBROBLASTOS DÉRMICOS CON CAPACIDAD DE DIFERENCIACIÓN PANCREÁTICA

Giménez CA, F Pereyra Bonnet, P Argibay.

Unidad de Reprogramación Celular, Instituto de Ciencia Básica y Medicina Experimental del Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina.
e-mail: carla.gimenez@hospitalitaliano.org.ar

La diferenciación celular in vitro abre nuevas posibilidades para las terapias de reemplazo celular en la clínica. Particularmente nuestro equipo ha trabajado sobre la plasticidad de los fibroblastos dérmicos de pacientes diabéticos diferenciándolos hasta células productoras de insulina (n= 2). Esta plasticidad celular podría estar relacionada con mecanismos epigenéticos y de expresión génica. En el presente trabajo se estudió el nivel de metilación en fibroblastos dérmicos sobre los sitios CpG en promotores del gen PDX1 (clave en el desarrollo pancreático) y de los genes asociados a la pluripotencialidad NANOG y OCT-4, mediante conversión del ADN con bisulfito sódico y posterior secuenciación directa. Los fibroblastos mostraron un perfil de metilación incompleta en PDX1 y genes pluripotenciales que varió entre 10-95 % dependiendo la CpG estudiada. Asimismo, en los controles usando células linaje pancreático específicas los promotores de PDX1 se encontraron completamente desmetilados (0 %), mientras que en los genes pluripotenciales estaban completamente metilados (100 %). Un estudio de la expresión génica se realizó mediante microarrays (n= 2) y observamos la expresión de genes marcadores de fibroblastos (CD34, Elastin, Filamin-B, COL12A1 and COL8A1) como la expresión de genes del desarrollo, variantes de histonas y genes asociados a la remodelación de la cromatina y nucleosomas (BMPs, SMADs, y otros). Futuros estudios deberán llevarse a cabo para determinar si el perfil epigenético y de expresión génica hallados en los fibroblastos dérmicos colabora con su capacidad plástica.  
EPG 4

ANÁLISIS DE LA IMPRONTA GENÓMICA DEL GEN PEG1/MEST EN MUESTRAS DE PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL

Rodriguez MB1, ML Pellegrini1, MA Redal2, C Vaccaro4, PF Argibay3.

1Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental, Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina,
2Unidad de Medicina Molecular y Genómica, Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental, Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina,
3Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental e Instituto Universitario, Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina,
4Servicio de Cirugía General, Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina.
e-mail: mariabetiana.rodriguez@gmail.com

El Cáncer Colorrectal (CCR) es una enfermedad que no solo involucra alteraciones genéticas sino también cambios epigenéticos. La impronta genómica (IG) es un mecanismo por el cual determinados genes se expresan de forma monoalélica de acuerdo al origen parental de los alelos. Se ha observado que las alteraciones en la IG están implicadas en el desarrollo de algunos tipos de cáncer. El gen humano PEG1/MEST presenta IG, exhibiendo una expresión preferencial por el alelo paterno. Con el objetivo de evaluar la presencia de cambios epigenéticos de PEG1/MEST en pacientes con CCR, y su asociación con la edad de los pacientes y el progreso de la carcinogénesis, se ha estudiado el estado de la IG en muestras de mucosa normal y tejido tumoral. De los 40 pacientes analizados, 26 fueron informativos para el polimorfismo de AflIII, dos de los cuales mostraron pérdida de la heterocigosidad en el tumor. Los productos de RT-PCR fueron analizados por digestión enzimática en las muestras que mantuvieron la heterocigosidad para determinar la expresión génica. Los resultados muestran pérdida de la impronta genómica (LOI) en el tejido tumoral del 58 % de los pacientes, de los cuales sólo el 14 % mantuvo la IG en la mucosa normal. El 42 % restante de los pacientes mantuvieron la IG en ambos tejidos. No se ha encontrado asociación de las alteraciones de la IG con la edad del paciente o el estadio de la carcinogénesis. El alto porcentaje de LOI en las muestras de los pacientes analizados sugiere que el gen PEG1/MEST estaría involucrado en el desarrollo y avance del CCR.

EPG 5
ACTIVACIÓN DE TRANSPOSONES COMO FUENTE DE VARIABILIDAD GENÉTICA EN HÍBRIDOS SINTÉTICOS DE Solanum SP.

Rendina AP12, RC Paz2, RW Masuelli2.

1Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales, UNaM. Felix de Azara 1552, (3300) Posadas, Misiones, Argentina,
2IBAM (Conicet-UNCuyo) Alte. Brown 500, (5507) Luján de Cuyo, Mendoza, Argentina.
e-mail: a.rendinagonzalez@gmail.com

La hibridación interespecífica en el género Solanum es un fenómeno común y representa una importante fuente de variabilidad crucial en la adaptación y especiación del género. En este sentido, el efecto de la hibridación interespecífica sobre las familias de retrotransposones presentes en los genomas y su consecuente efecto sobre la generación de variabilidad genética en especies silvestres de Solanum están poco caracterizados. El objetivo de este estudio fue analizar la variabilidad morfológica, genética y epigenética entre genotipos de S. kurtzianum y S. microdontum y con híbridos inter e intraespecíficos obtenidos mediante cruzamientos controlados. Para los análisis genéticos y epigenéticos se utilizaron las técnicas de S-SAP y TMD respectivamente, utilizando cebadores específicos para las familias de retrotransposones Tnt1 y Tto1 (Orden LTR, Superfamilia Copia). Los resultados obtenidos indican que a nivel morfológico, los híbridos interespecíficos se distinguen de las especies parentales, mientras que los intraespecíficos no. En ambos casos se observaron reducciones significativas en la viabilidad de los granos de polen, y esto fue dependiente del genotipo progenitor. A nivel genético, Tnt1 y Tto1 se movilizaron de una manera cruzamiento-específica, mientras que a nivel epigenético, se observaron patrones diferenciales de metilación en Tnt1 y no en Tto1. Estos resultados explican un posible mecanismo por el cual los eventos de hibridación generan variabilidad genética mediada por retrotransposones, repercutiendo sobre la biología y la evolución del género Solanum.

EPG 6
INESTABILIDAD GENÓMICA ASOCIADA A LA HIBRIDACIÓN INTERESPECÍFICA EN PAPA

Cara N1, CF Marfil1, RW Masuelli1,2.

1Instituto de Biología Agrícola de Mendoza (IBAM), Facultad de Ciencias Agrarias, U.N.Cuyo, Mendoza. CONICET,
2EEA La Consulta, INTA.
e-mail: ncara@fca.uncu.edu.ar

La hibridación interespecífica ha sido descripta como un fenómeno frecuente entre las especies silvestres de papa (género Solanum sección Petota). La combinación de genomas de distinto origen en un mismo núcleo produce cambios tanto a nivel genético como epigenético. Éstos se reflejan en variaciones fenotípicas que podrían contribuir a la amplia adaptabilidad ecológica de las poblaciones naturales de papa. Actualmente se considera que 27 de las 235 especies silvestres de papa (sección Petota) son híbridos naturales, aunque la taxonomía de la sección es imbricada y está en constante revisión. Solanum x rechei es el único taxón confirmado de haberse originado por hibridización entre Solanum kurtzianum (ktz) y Solanum microdontum (mcd), especies con las que convive en simpatría. En este estudio, mediante cruzamientos sexuales controlados ktz x mcd (y recíproco) se resintetizó el híbrido y a través de las técnicas AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) y MSAP (Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism) se estudió su variabilidad genética y epigenética, respectivamente. La comparación de patrones de amplificación de AFLP y MSAP entre los híbridos sintéticos y padres mostró rearreglos tanto genómicos como de patrones de metilación. Además comparando los híbridos sintéticos con el híbrido natural (S. x rechei), se encontraron patrones compartidos de metilación no observados en las especies parentales.

EPG 7
CAMBIOS EPIGENÉTICOS ESTOCÁSTICOS EN ALOPOLIPLOIDES DE PAPA

Duarte PF1, RW Masuelli1,2, C Marfil1.

1Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Biología Agrícola de Mendoza (IBAM), Facultad de Ciencias Agrarias, UNCuyo Mendoza, CONICET,
2EEA La Consulta, INTA.
e-mail: pduarte@mendoza-conicet.gob.ar

La hibridización y la poliploidización han tenido un rol importante en la evolución de las especies de papa (género Solanum, sección Petota). Estudios anteriores han demostrado que la hibridización en papa induce una serie de cambios genéticos y epigenéticos. Sin embargo, se desconoce en qué medida la alopoliploidización, fenómeno que implica la duplicación cromosómica tras un evento de hibridización, induciría restructuraciones genéticas y epigenéticas en este grupo de plantas. El objetivo del presente trabajo es evaluar si la duplicación cromosómica en alopoliploides de papa genera cambios genéticos y epigenéticos. El modelo experimental implica la comparación de un híbrido interespecífico diploide control (2n=2x=24) con dos tipos de líneas derivadas por tratamiento in vitro con colchicina: (i) líneas alotetraploides (2n=4x=48), y (ii) líneas diploides tratadas con colchicina pero que no duplicaron su genoma (2n=2x=24). Análisis con microsatélites (SSR) mostraron que ni el tratamiento con colchicina ni la duplicación cromosómica indujeron cambios genéticos. Por otra parte, el análisis de la metilación del ADN con MSAP (Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism), mostró cambios en los patrones de metilación en ambos tipos de líneas respecto al control diploide. Los cambios observados variaron entre un 7 % y un 42 % respecto al total de los fragmentos analizados. Los resultados indican una tendencia estocástica en los cambios epigenéticos observados ya que no fueron sistemáticamente atribuibles a las líneas alotetraploides en particular.

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