COMUNICACIONES LIBRES

Genómica y Bioinformática

 

GBIO 1
DISEÑO DE CEBADORES DEGENERADOS PARA AMPLIFICAR UN FRAGMENTO DEL GEN ENDO-1,4-B-XILANASA

Díaz GV, EM Giorgio, MI Fonseca, PD Zapata, LL Villalba.

Instituto de Biotecnología Misiones"Dra. María Ebe Reca". Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones.
e-mail: gabrielavdiaz@live.com

La utilización de endo-1,4-β-xilanasas ha surgido como una tecnología alternativa en el blanqueo de pastas lignocelulósicas, reduciendo de esta manera el uso de compuestos clorados en la industria celulósico-papelera. Nuestro grupo está interesado en el estudio molecular de las enzimas xilanolíticas producidas y secretadas por el hongo de pudrición blanca G. applanatum cepa F, nativo de Misiones y el objetivo particular de este trabajo fue amplificar un fragmento génico codificante para la enzima endo-1,4-β-xilanasa de la familia 11. Para ello, se diseñaron cebadores degenerados que permitan la amplificación de dicho fragmento. Primeramente, se realizó un alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas de endoxilanasas pertenecientes a basidiomicetes, disponibles en la base de datos del NCBI con el programa T-Coffee. Se identificaron dos regiones consenso para el diseño de los cebadores sentido y antisentido, la hipótesis de tambaleo fue utilizada para minimizar el índice de degeneración. A su vez, a cada cebador se le adicionó la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción PstI, en caso de que fuera necesario clonar. Los cebadores diseñados fueron testeados in silico con el programa Fast PCR y ensayados en el laboratorio pudiéndose amplificar un fragmento génico putativo de tamaño similar al esperado de 400 pb, que deberá ser corroborado y validado mediante clonación y secuenciación.

GBIO 2
DISEÑO DE CEBADORES PARA UN GEN RESPONSABLE DE LA ACTIVIDAD BIOCONTROLADORA DE Beauveria sp.

Bich GA, ML Castrillo, GV Díaz, EL Recalde, MG Medvedeff.

Laboratorio de Microbiología e Inmunología - UNaM - Mariano Moreno 1375 - Posadas, Misiones.
e-mail: gustavobich@yahoo.com.ar

El hongo entomopatógeno Beauveria es un patógeno natural de insectos y ha sido empleado y desarrollado como agente activo en insecticidas microbianos contra numerosas plagas importantes en agricultura. La virulencia fúngica está mayormente relacionada hacia los primeros pasos de la infección que involucra la acción de enzimas degradadoras de cutícula. Numerosos estudios están dirigidos a lograr cepas fúngicas modificadas biotecnológicamente que produzcan una sobreexpresión de factores de virulencia. Una de las enzimas encargadas de la degradación de la cutícula de los insectos son las proteasas tipo subtilisina Pr1. Estas enzimas son importantes para la degradación de la cutícula de insectos y crecimiento saprofítico del hongo. El objetivo del presente estudio fue diseñar iniciadores para la amplificación del gen de proteasas tipo subtilisina Pr1 para Beauveria sp. para ello se seleccionaron secuencias aminoacídicas del banco de datos del NCBI y se alinearon empleando la herramienta ClustalW del software Mega 5.2. En base a los patrones de alineamiento logrados se identificaron solo 2 regiones conservadas y se usaron para el diseño de los iniciadores. La eficiencia de estos iniciadores fue probada virtualmente empleando FastPCR para verificar sus cualidades, como el contenido de G-C, temperatura de hibridación (Tm) o formación de homo o heterodímeros, obteniéndose los cebadores sentido y antisentido con características dentro de las esperadas. Finalmente estos cebadores restan por ser evaluados empíricamente en el laboratorio.

GBIO 3
ANÁLISIS Y TRADUCCIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN CBHI DE UNA CEPA DE Trichoderma sp. NATIVA DE MISIONES

Castrillo ML, NS Amerio, MI Fonseca, PD Zapata, LL Villalba.

Laboratorio de Biotecnología Molecular. Instituto de Biotecnología InBioMis. Universidad Nacional de Misiones. Ruta 12 km 71/2. Posadas (3300), Misiones.
e-mail: mlc_827@hotmail.com

Debido a su abundancia como componente principal de las plantas, la celulosa posee un enorme potencial como fuente de energía renovable. Una propuesta prometedora es su bioconversión a través de enzimas celulasas para la obtención de bioetanol. Sin embargo, el alto costo de producción de estas enzimas ha obstaculizado su aplicación industrial. Por ello resulta esencial profundizar los conocimientos sobre las características moleculares de los sistemas celulolíticos iniciando la búsqueda de las secuencias génicas de estas enzimas. El objetivo del presente trabajo fue analizar"in silico" la secuencia obtenida de un fragmento génico de 372 pb de la cepa NAN13 de Trichoderma, aislada de la provincia de Misiones y llevar a cabo su traducción mediante herramientas bioinformáticas disponibles online. Para el análisis de identidad se utilizó la herramienta BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool for nucleotide) del NCBI (National Center of Biotechnology Information), proporcionando una identidad máxima del 95 % con el gen que codifica para celobiohidrolasas (cbh1) de Trichoderma harzianum. La traducción de la secuencia nucleotídica a su correspondiente secuencia aminoacídica fue realizada con la herramienta Expasy Translate, para elegir el marco de lectura correcto, las seis posibles secuencias aminoacídicas fueron analizadas mediante las herramientas BLASTp (Basic Local Alignment Search Tool for protein) del NCBI, y de esta manera, se obtuvo la secuencia proteíca para el fragmento génico analizado.

GBIO 4
DISEÑO DE CEBADORES DEGENERADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DE ENDOGLUCANASAS EN CEPAS DEL GÉNERO Aspergillus

Zini PL, ML Castrillo, EA Gonzalez, GA Bich, MI Fonseca, PD Zapata, LL Villalba.

Laboratorio de Biotecnología Molecular. Instituto de Biotecnología Misiones - InBioMis. Universidad Nacional de Misiones. Ruta 12 Km 7 1/2. Posadas.
e-mail: zinipablo@yahoo.com.ar

Las endoglucanasas (EGs) son parte del complejo de enzimas celulolíticas que hidrolizan enlaces beta-1,4-glucosídicos, usando como sustrato la celulosa, siendo ampliamente requeridas en la obtención de bioetanol. Tomamos como modelo biológico hongos del género Aspergillus por varias razones: son fácilmente aislados de muchos sustratos en descomposición, requieren condiciones mínimas de manejo y son normalmente citados como grandes secretores de estas enzimas. Con el fin de amplificar un fragmento del gen que codifica para EGs en cepas del género Aspergillus, diseñamos cebadores degenerados que permitan lograr esto. El diseño fue llevado a cabo mediante la búsqueda de secuencias aminoacídicas correspondientes a EGs registradas en la base de datos del NCBI (National Center of Biotechnology Information), con la ayuda de la herramienta BLASTp (Basic Local Aligment Search Tool for protein). Se seleccionaron 14 secuencias de Aspergillus que presentaron mayor porcentaje de identidad. Se alinearon mediante el programa ClustalW2 y en base a las secuencias consenso encontradas se diseñaron cebadores degenerados, teniendo en cuenta la nomenclatura IUPAC y la hipótesis del tambaleo para reducir su índice de degeneración. La factibilidad de los cebadores se evaluó con el programa Fast PCR observando que el porcentaje de GC oscilara entre 40 y 60 %, las temperaturas de fusión no se encontraran separadas por más de 5° C y no presentaran formación de dímeros. Estos cebadores serán evaluados en el laboratorio para lograr la amplificación del fragmento de interés de aproximadamente 330pb.

GBIO 5
DISEÑO DE CEBADORES DEGENERADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA B-1,4-GLUCOSIDA

Castrillo ML, EA Gonzalez, MP Barengo, GA Bich, GV Diaz, PD Zapata, LL Villalba.

Instituto de Biotecnología Misiones, InBioMis. Universidad Nacional de Misiones. Ruta 12 km 7 1/2. Posadas, Misiones, Argentina.
e-mail: march_bar@hotmail.com

En el proceso de producción de bioetanol, se requieren enzimas del complejo celulasas, como las β-1,4-glucosidasas. La bioconversión de celulosa a etanol surgió como una alternativa para reducir el uso de combustibles fósiles, pero su alto costo ha obstaculizado su aplicación industrial. Una forma de favorecer su empleo es identificar y caracterizar los sistemas génicos secretores de β-1,4-glucosidasas. El objetivo del presente trabajo fue diseñar cebadores degenerados que permitan la amplificación de un fragmento génico que codifica para la enzima β-1,4-glucosidasa en hongos del genero Trichoderma nativos de Misiones. Mediante el recurso bioinformático BLASTp (Basic Local Aligment Search Tool for protein) del NCBI (National Center of Biotechnology Information) se realizó un análisis de similitud utilizando como referencia la secuencia aminoacídica de beta-1,4-glucosidasa de T. reesei (BA74959.1) y se eligieron 21 secuencias por mayor porcentaje de identidad. Se realizó un alineamiento múltiple mediante el programa ClustalW2 y fueron seleccionadas dos regiones conservadas (A y B) para el diseño manual del cebador sentido y una región para el cebador antisentido, basándose en el código genético. Los mismos fueron analizados"in silico" mediante el programa Fast PCR 6.2, pudiéndose concluir que la combinación cebador sentido B y cebador antisentido proporcionan el contenido CG y la Tm recomendadas para su óptima amplificación. De este modo, mediante la puesta a punto de la PCR sería posible obtener un fragmento génico de aproximadamente de 350pb.
GBIO 6

DISEÑO DE CEBADORES PARA AMPLIFICAR EL GEN QUE CODIFICA PARA B-1,3-GLUCANASAS EN Trichoderma

Sioli GA, ML Castrillo, MB Otegui, PD Zapata, LL Villalba.

Instituto de Biotecnología Misiones"María Ebe Reca" (InBioMis). Universidad Nacional de Misiones. Ruta 12 km 71/2. Posadas, Misiones, Argentina.
e-mail: gastonsioli@gmail.com

La capacidad de Trichoderma sp. de secretar β-1,3-glucanasas extracelulares se ha correlacionado con el biocontrol de hongos fitopatógenos. Para favorecer su empleo industrial como controlador biológico es importante identificar y caracterizar los sistemas génicos secretores de β-1,3-glucanasas. Nuestro objetivo fue diseñar cebadores degenerados que permitan la amplificación de un fragmento génico que codifique para la enzima β-1,3-glucanasa en hongos del género Trichoderma nativos de Misiones. Mediante el recurso bioinformático BLASTp (Basic Local Aligment Search Tool for protein) del NCBI (National Center of Biotechnology Information) se realizó un análisis de similitud utilizando como referencia la secuencia de β-1,3-glucanasa de Trichoderma viride (ABM55269.1) siendo elegidas 14 secuencias con mayor porcentaje de identidad. Se alinearon mediante el programa ClustalW2 y fueron seleccionadas una región consenso (A) para el diseño manual del cebador sentido y dos regiones para el cebador antisentido (B y C). Los mismos se analizaron"in silico" mediante el programa Fast PCR 6.4, pudiéndose concluir que la combinación cebador sentido A y los cebadores antisentido B y C proporcionan el contenido CG y la Tm recomendadas para su óptima amplificación. Aun así, el fragmento considerado entre los cebadores A y C es grande y podría dificultar su amplificación correcta; por lo cual, la combinación de cebadores A y B resulta más adecuada para su utilización, esperándose obtener un fragmento génico aproximado de 930pb, mediante la puesta a punto de la PCR.

GBIO 7
ANÁLISIS DE VARIANZA MOLECULAR CON INTERACCIÓN ENTRE FACTORES DE CLASIFICACIÓN DE LAS POBLACIONES

Bruno C, M Balzarini.

CONICET-Estadística y Biometría. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.
e-mail: cebruno@agro.unc.edu.ar

En estudios genotípicos de poblaciones, la diversidad genómica total de los haplotipos moleculares puede ser expresada como la suma de componentes de varianza molecular entre y dentro de grupos de individuos conformados por uno o más factores de clasificación. Debido a la alta dimensionalidad de los datos moleculares, las sumas de cuadrados (SC) para el análisis de varianza molecular se obtienen a partir de distancias multivariadas entre pares de haplotipos. La SC asociada a cualquier término de un modelo lineal puede ser calculada a partir de una matriz de distancia por su relación matemática con la suma de distancias al cuadrado. Para las SC asociadas a marcadores booleanos (expresados como presencia/ausencia), la distancia Euclídea es frecuentemente usada. Estas SC han sido utilizadas para contrastar hipótesis sobre variabilidad entre y dentro de grupos en estructuras jerárquicas o ‘anidadas’ de factores (AMOVA). Sin embargo, cuando los factores de clasificación exhiben una estructura ‘cruzada’, es de interés probar la significancia de la interacción entre ellos. En este trabajo se postula y evalúa una nueva prueba estadística para medir la significancia de la interacción entre factores de clasificación a partir de perfiles moleculares. La prueba es de naturaleza no-paramétrica, no demanda la elección de un método de permutación para hallar la significancia y goza de las propiedades del test no-paramétrico de Kruskal-Wallis ya que se basa en la aplicación del mismo sobre el valor absoluto de residuos de distancias entre y dentro de los grupos formados por ambos factores.