COMUNICACIONES LIBRES

Genética de Microorganismos

 

GMI 1
CARACTERIZACIÓN DE UNA CEPA COMPETENTE NATURAL DE Escherichia coli AISLADA DE SUELO

Mucci S, M Nardelli, G Parmeciano Di Noto, MF Rapisardi, C Quiroga, D Centrón.

¹Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM)-CONICET-Universidad de Buenos Aires.
e-mail: sofia_mucci@hotmail.com

Diversas especies bacterianas son capaces de adquirir material exógeno mediante diferentes mecanismos de transformación natural. Poco se sabe sobre las condiciones necesarias para la expresión de la competencia natural en Escherichia coli. Al analizar cepas aisladas de suelo provenientes de sitios de bajo impacto antrópico del Parque Nacional Iguazú, se identificó un aislamiento de E. coli transformante natural. El objetivo de este trabajo es caracterizar los requerimientos de crecimiento y transformación de E. coli 4IgSN1. Para ello, se realizaron curvas de crecimiento comparando la velocidad de replicación del aislamiento 4IgSN1 con las de E. coli MG1655, BL21 y DH5a; y a diversas temperaturas (25° C, 30° C, 37° C, 40° C y 45° C). Nuestros resultados mostraron que E. coli 4IgSN1 tiene un rango óptimo de crecimiento entre 37° C y 40° C. Por otro lado, se observó que esta bacteria se replica más rápido que E. coli BL21 y DH5a, pero es más lenta que la cepa MG1655. En paralelo, se evaluó la capacidad de adquirir plásmidos mediante ensayos de transformación por competencia natural. Para ello, se expuso E. coli 4IgSN1 al ADN de un plásmido ColE1, llamado pCR-aadB, que confiere resistencia a gentamicina. Una vez introducido, se realizaron cultivos seriados durante 6 días, y se evaluó el mantenimiento del mismo por PCR. Nuestros resultados mostraron que E. coli 4IgSN1 es capaz no solo de captar plásmidos ColE1 de forma natural, sino que también puede mantenerlos al menos 6 días, sugiriendo que expresa la maquinaria para la captación de ADN exógeno.

GMI 2
VARIABILIDAD GENÉTICA EN AISLAMIENTOS DE Rhizoctonia solani EMPLEANDO MARCADORES ISSR Y URP

Taboada G^1,2, Y Spedaletti^1,3, M Aparicio^1,2, A Chocobar¹, M Chocobar¹, F Gasca⁵, D Benedettini⁵, O Vizgarra⁴, M Galván^1,3, G Mercado Cárdenas¹.

¹INTA-EEA Salta,
²CONICET,
³ANPCyT,
⁴EEAOC, Tucumán,
⁵Escuela de Agronomía, FCN, UNSa.
e-mail: gmercado@correo.inta.gov.ar

Una de las principales causas de disminución del rendimiento en los cultivos es el estrés biótico. Rhizoctonia solani (Kühn) es un hongo patógeno habitante del suelo que ocasiona numerosas enfermedades en diferentes cultivos del NOA, como ser poroto, tabaco y garbanzo. Una de las causas del éxito limitado en el manejo de las enfermedades es el escaso conocimiento de la variabilidad y de la estructura genética de las poblaciones del patógeno. El objetivo de este trabajo fue evaluar la variabilidad genética presente en 25 aislamientos de R. solani obtenidos a partir de diferentes cultivos del NOA (poroto, tabaco y garbanzo) utilizando marcadores moleculares. Los aislamientos fueron obtenidos a partir de semillas, hojas, raíces y suelo de lotes comerciales de los cultivos mencionados. La extracción de ADN se realizó a partir de micelio de 10 días de activo crecimiento en A.P.G. Para la amplificación mediante PCR se emplearon 4 primers ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) y 4 primers URP (Universal Rice Primers), los cuales han sido ampliamente utilizados en el análisis molecular de diversos hongos. Para el análisis de los datos se aplicaron técnicas de análisis multivariado (Coordenadas Principales y análisis de agrupamiento). Los resultados revelaron la existencia de gran variabilidad genética en los aislamientos estudiados y demostraron que los marcadores utilizados son una herramienta de utilidad para el análisis de la variabilidad entre los aislamientos de R. solani analizados.

GMI 3
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DE Rhizoctonia spp. DE POROTO EN EL NOA

Spedaletti Y^1,4, G Taboada^1,3, A Chocobar¹, G Aparicio^1,3, O Vizcarra², M Galván^1,3, G Mercado Cárdenas¹.

¹INTA-EEA Salta,
²EEAOC, Tucumán,
³CONICET,
⁴ANPCyT.
e-mail: gmercado@correo.inta.gov.ar

El damping off, la podredumbre radicular y mustia hilachosa, son enfermedades causadas por Rhizoctonia solani Khün que suelen presentarse con mayor prevalencia y severidad en el cultivo de poroto en el NOA. El diagnóstico molecular mediante ITS (internal transcribed spacer) del genero Rhizoctonia, es la herramienta actual más empleada para la identificación correcta del fitopatógeno. El objetivo del trabajo fue realizar la identificación de 20 aislamientos de Rhizoctonia spp. obtenidos de semillas de poroto de las provincias de Salta y Tucumán, empleando secuencias ITS. Para ello se realizó la extracción de ADN a partir de micelio. Posteriormente se realizaron reacciones de amplificación mediante PCR utilizando los primers ITS1 e ITS4. Los fragmentos amplificados fueron de 700 pb. El ADN amplificado se secuenció y posteriormente se realizó el alineamiento y análisis de las secuencias con ClustalW. Se adicionaron al análisis secuencias de diferentes especies de Rhizoctonia y diversos grupos de anastomosis de R. solani disponibles en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) y secuencias de aislamientos obtenidos a partir de otros hospedantes, como garbanzo y tabaco. Se generó un árbol de Neighbor-Joining en el cual se pudo identificar a la mayoría de los aislamientos de poroto como Rhizoctonia solani AG4. Las secuencias obtenidas para cada aislamiento fueron publicadas en el GenBank. La información generada representa una herramienta para el manejo integrado de estas patologías.

GMI 4
ANÁLISIS MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DE Fusarium spp. ASOCIADOS AL MARCHITAMIENTO VASCULAR EN TABACO

Berruezo L^1,2, G Mercado Cardenas¹, Y Spedaletti^1,3, A Chocobar¹, M Galvan^1,2, S Stenglein^2,4

1INTA EEA-Salta,
2CONICET,
3ANPCyT,
4Facultad de Agronomía de Azul, UNCPBA.
e-mail: gmercado@correo.inta.gov.ar

El marchitamiento vascular producido por Fusarium spp. se manifestó en diversos lotes tabacaleros de las provincias de Salta y Jujuy, generando la necesidad del manejo de la enfermedad. La caracterización del fitopatógeno es uno de los pilares fundamentales para desarrollar nuevas estrategias de manejo. El objetivo del presente trabajo fue analizar la variabilidad genética en aislamientos de Fusarium spp. recolectados en distintas localidades de las provincias de Salta y Jujuy empleando la secuencia EF1alpha (elongation factor). Se realizó la extracción de ADN de micelio de 10 días de activo crecimiento de 9 aislamientos monospóricos del patógeno. A partir del ADN extraído se amplificaron la región EF1alpha mediante PCR utilizando los primers EF1 y EF2. Los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en geles de agarosa 1,5 % teñidos con GelRedTM y se purificaron para su posterior secuenciación. La identificación de las secuencias se obtuvo realizando una comparación con secuencias de la base de datos del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) utilizando el algoritmo Blastn. El alineamiento de las secuencias y su comparación se realizó con ClustalW en el programa BioEdit. A partir del análisis de las secuencias se pudo identificar las variaciones presentes en las mismas y se generó un árbol de Neighbor-joining incluyendo secuencias control en el cual se agrupó a los aislamientos por especie revelando la existencia de variabilidad entre los aislamientos estudiados.

GMI 5
IDENTIFICACIÓN DE SIMBIONTES INTESTINALES EN Anastrepha fraterculus (DIPTERA: TEPHRITIDAE)

Maldonado L¹, C Conte¹, J Silberman^2,3, M Mannino¹, L Pimper¹, J Cladera1, D Segura^1,3, S Lanzavecchia¹.

¹Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica. IGEAF. INTA-Castelar.,
²Laboratorio de Microbiología. Instituto de Suelos. CIRN. INTA-Castelar,
³Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y técnicas (CONICET).
e-mail: cconte@cnia.inta.gov.ar

La mosca sudamericana de la fruta, Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae), es una de las plagas de frutales más importantes en Argentina y el continente americano. Actualmente para su control se encuentra en desarrollo una estrategia de bajo impacto ambiental, la Técnica del Insecto Estéril (TIE). Está descripto que en moscas de la fruta, la competitividad sexual de los machos esta estrechamente relacionada con el estado nutricional de los insectos adultos y a su vez con los microorganismos simbiontes del intestino, que permiten la incorporación de nutrientes esenciales. Estudios sobre el desempeño de los machos estériles durante el apareamiento permitirían aportar conocimientos para el desarrollo de la TIE en esta especie. Con el objetivo de iniciar la descripción y caracterización de la diversidad bacteriana intestinal de A. fraterculus, se obtuvo ADN de intestinos de insectos adultos de la línea del IGEAF y se amplificó por PCR una región del 16SrADN. Luego del clonado se secuenciaron los productos obtenidos. Paralelamente se realizó electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron comparadas con Blastn y se identificaron exitosamente bacterias de los géneros Klebsiella y Citrobacter; entre otras. Asimismo, con DGGE se observaron perfiles diferenciales. Se continúa el análisis para la identificación de bacterias en la línea del IGEAF e insectos silvestres. Las técnicas aplicadas demostraron ser eficientes para la identificación molecular de especies bacterianas intestinales en A. fraterculus.

GMI 6
IDENTIFICACIÓN POR ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE HONGOS DE PUDRICIÓN BLANCA NATIVOS DE MISIONES

Gonzalez EA, CN Martinez, ML Castrillo, MI Fonseca, PD Zapata, LL Villalba.

Laboratorio de Biotecnología Molecular. Instituto de Biotecnología InBioMis. Universidad Nacional de Misiones. Ruta 12 km 71/2. Posadas, Misiones, Argentina.
e-mail: esteban078@gmail.com

En Argentina, se han descrito varias especies de hongos de pudrición blanca (WRF) secretores de enzimas con características interesantes para su uso en aplicaciones biotecnológicas. Es por ello que resulta fundamental la identificación correcta del hongo. Antiguamente las clasificaciones sistemáticas típicas se realizaban únicamente por caracteres morfológicos, en la actualidad son complementados mediante la utilización de herramientas moleculares. El objetivo del presente trabajo fue identificar por análisis filogenético dos cepas de WRF nativos de la provincia de Misiones. Para ello se amplificó y secuenció la región transcripta interna mediante la utilización de cebadores universales ITS 1 e ITS 4. Con el programa Geneius 3.6.1 se obtuvo el contigo consenso a partir del cual se realizó un análisis de similitud mediante la herramienta Pairwise seguence alignment de la base de datos secundaria"curada" Fungal barcouding (http://www.fungalbarcoding.org). Se seleccionaron aquellas secuencias con mayor porcentaje de similitud, y se analizaron filogenéticamente tanto por el programa Geneius 3.6.1 así como por Mega 5.1 por el método estadístico de Neighbor-Joining utilizando el test de bootstrap con 1000 replicaciones y el modelo Tamura-Nei para el cálculo de distancia genética. Fue posible identificar mediante la formación de clados monofiléticos, a los basidiomicetes nativos de Misiones con una identidad máxima del 99 % con Trametes villosa y del 99,8 % con Pycnoporus sanguineus.

GMI 7
IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE UNA CEPA FÚNGICA NATIVA DE LA PROVINCIA DE MISIONES
Martinez CN, EA Gonzalez, ML Castrillo, MI Fonseca, PD Zapata, LL Villalva.

Laboratorio de Biotecnología Molecular. Instituto de Biotecnología Misiones-InBioMis. Ruta 12 km 7 1/2. Campus Universitario. Posadas, Misiones, Argentina.
e-mail: biotecmol2010@gmail.com

La utilización de caracteres morfológicos para la identificación de cepas fúngicas es una herramienta sumamente importante, pero escasa para llegar a la identificación de especies de manera certera. Por tal motivo nuestro objetivo fue identificar una cepa perteneciente al Phyllum Basidiomicetes a través de herramientas bioinformáticas para complementar su identificación morfológica. A partir del material genético extraído de una cepa nativa, previamente clasificada morfológicamente como perteneciente al Phyllum Basidiomicetes, se logró amplificar y secuenciar la región ITS1-5,8S-ITS2 mediante la utilización de cebadores universales ITS 1 e ITS 4. Una vez obtenida la región de interés y su secuencia consenso por medio del programa CAP3, se procedió a contrastar la información obtenida con la existente en las bases de datos, mediante la herramienta Blast (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (National Center for Biotechnology Information) y la herramienta Pairwise sequence alignment del Fungal barcoding disponibles on line. Fueron seleccionadas 33 secuencias, evaluadas de acuerdo al porcentaje de similitud, se alinearon y editaron mediante el software MEGA 5.1 y posteriormente se analizaron filogenéticamente por medio de los algoritmos Neighbor-joining, Máximum Parsimonia, Mínimum Evolution, UPGMA y un test de bootstrap con 1000 replicaciones. Mediante la construcción de clados monofiléticos, fue posible identificar a la cepa nativa de Misiones con un 98 % de identidad como Trametes versicolor.