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BAG. Journal of basic and applied genetics

versión On-line ISSN 1852-6233

BAG, J. basic appl. genet. vol.24 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires dic. 2013

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Identificación de tricópteros de altura de Bolivia y Perú mediante el código de barras del ADN

 

Ninahuanca, A.1, Arteaga, D.1, Luna, R.1

1 Centro de Investigación Genética del Instituto de Investigaciones Técnico Científicas de la Universidad Policial, Policía Boliviana, La Paz, Bolivia.
aninahuancat@gmail; comcingen.ptc@gmail.com


RESUMEN

El Orden Trichoptera incluye algunos de los insectos bioindicadores más estudiados a nivel genético por su utilidad y distribución en sistemas de agua dulce. Al no contar con claves morfo-anatómicas de larvas para diferenciar especies altiplánicas, proponemos el uso de secuencias del gen CO-I (código de barras del ADN) para su identificación taxonómica molecular. Se estudiaron por primera vez secuencias CO-I en larvas de tricópteros de la Cordillera Oriental y Occidental de Bolivia, y de la Cordillera Blanca de Perú. Con el modelo de dos parámetros de Kimura, se identificaron los géneros Anomalocosmoecus, Antarctoecia y Cailloma. El análisis más detallado del código de barras del ADN secuenciado sugiere la existencia de un posible suborden y dos especies del género Antarctoecia en la Cordillera Occidental de Bolivia. Más estudios son necesarios para dar mayor sustento a esta hipótesis.

Palabras clave: CO-I; Taxonomía molecular; Trichoptera.

ABSTRACT

Order Trichoptera includes some of the biomarker insects most studied at the genetic level because of their usefulness and distribution in freshwater systems. In the absence of morpho-anatomical features to distinguish larvae of these species of highland Peru and Bolivia, here we propose the use of sequences of the CO-I gene (DNA Barcode) for molecular taxonomic identification. This is the first study of the CO-I sequences in Trichoptera larvae of Western and Eastern Cordillera of Bolivia and Cordillera Blanca of Peru. With Kimura's two-parameter model, we identified genera Anomalocosmoecus, Cailloma and Antarctoecia. More detailed analysis of the sequenced DNA Barcode suggests the existence of a suborder and two species of Antarctoecia in the Western Cordillera of Bolivia. More studies are needed to provide further support to this hypothesis.

Key words: CO-I; Molecular taxonomy; Trichoptera.


 

INTRODUCCIÓN

Entre los macroinvertebrados mejor estudiados y utilizados como bioindicadores de calidad de agua están las especies que pertenecen al orden Trichoptera (Bonada et al., 2006; Holzenthal et al., 2007; Molina et al., 2008). Los tricópteros son artrópodos holometábolos de estadios inmaduros acuáticos, con alrededor de 10.000 especies descritas y distribuidas entre 45 familias (Morse, 1997), de elevada diversidad de nichos tróficos (Mackay & Wiggins, 1979), y cuyo estudio resulta ser de gran importancia en la evaluación ambiental. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la identificación taxonómica, especialmente de larvas, no ha sido posible, debido a la falta de claves taxonómicas por región o a las similitudes morfológicas entre especímenes de este estadio. De esta manera, se han desarrollado estudios de la sistemática molecular de este orden en busca de patrones de coevolución con el fin de inferir su filogenia (Morse, 1997). El método conocido como "código de barras del ADN (CO-I)" se ha usado para estudiar la variabilidad a niveles taxonómico, filogenético e incluso filogeográfico, considerando al menos un segmento informativo (Crozier et al., 1989; Hwang & Kim, 1999; Muraji et al. 2000; Myeres et al., 2001; Cánovas, 2002; Pauls, 2004; Haro et al., 2005; Smith, 2005; Audisio et al., 2008; Lehrian et al., 2009; Bajpai & Tewari, 2010; Salinas, 2010). No obstante, pese a los evidentes efectos del cambio climático sobre la biodiversidad en el altiplano boliviano, no existen estudios del orden Trichoptera a nivel taxonómico molecular. En el presente trabajo, proponemos el uso de CO-I para la identificación taxonómica molecular de larvas de tricópteros en sitios de la Cordillera Oriental y Occidental de Bolivia y de la Cordillera Blanca de Perú, con el fin de caracterizar este marcador molecular para la identificación taxonómica de estos bioindicadores y aportar al conocimiento de las especies existentes.

MATERIAL Y MÉTODOS

Recolección e identificación taxonómica
Se recolectaron larvas de Tricópteros en ríos afluentes de los glaciares Mururata, Illimani (Cordillera Oriental de Bolivia), Larancagua (Cordillera Occidental de Bolivia), Huáraz y Paca (Cordillera Blanca de Perú). La identificación morfo-anatómica de dichas larvas se realizó en la Unidad de Limnología del Instituto de Ecología de la Universidad Mayor de San Andrés (La Paz, Bolivia).

Extracción y amplificación del ADN
Se extrajo material genético de las patas de las larvas optimizando el sistema comercial Wizard de Promega. Se empleó la pareja de cebadores universales LCO1490 (5'GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3') y HCO2198 (5'-TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA-3') descritos por Hebert et al. (2003). La concentración final de los cebadores fue de 0.355 µM y los fragmentos correspondientes fueron amplificados mediante el sistema comercial de GoTaq Colorless Master Mix (Promega). El programa empleado fue: 5 min a 94°C; 30 ciclos de: 1 min a 94°C, 110 s a 51°C, 110 s a 72°C; y extensión de 10 min a 72°C.

Obtención de secuencias de ADN
Luego de aplicar una purificación alcohólica a los productos amplificados, los productos se secuenciaron empleando el cebador LCO1490 y el sistema Big Dye Terminator v3.1. (Applied Biosystems), según el protocolo del fabricante. Tras una nueva purificación alcohólica, las secuencias se obtuvieron por electroforesis capilar en un Analizador Genético AB3130 (Applied Biosystems).

Análisis de secuencias
Los resultados se introdujeron en el programa informático "Sequence Analysis" y los electroferogramas se editaron manualmente con los programas BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) y SeqA 5.2. (Applied Biosystems). Asimismo, se introdujeron secuencias CO-I de los órdenes Mecóptera, Lepidóptera, Díptera y Trichoptera disponibles en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), y se alinearon empleando ClustalW del programa Mega 4 (Tamura, et al., versión 4). Finalmente, para establecer los patrones taxonómicos moleculares, se empleó el modelo de distancia genética de dos parámetros de Kimura (Kumur & Nei, 2000) más el método Neighbor-Joining (NJ) (Saitou & Nei, 1987) de construcción de filogramas con consistencia igual a 1.000 réplicas.

RESULTADOS

Entre los 45 especímenes de larvas de tricópteros estudiados, morfo-anatómicamente, se identificaron tres géneros (Antarctoecia, Anomalocosmoecus y Cailloma) en los glaciares bolivianos Mururata, Illimani y Larancagua, y un género (Anomalocosmoecus) en los glaciares Huáraz y Paca de Perú. En el estudio genético, se obtuvo un fragmento de ADN de 709 pb, flanqueado por las posiciones 1490 y 2198 pb (ADNmt) para todos los especímenes estudiados. Luego de la edición y el alineamiento de las secuencias, se comparó un sub-fragmento de 636 pb con 211 sitios polimórficos entre los haplotipos de especímenes bolivianos (Fig. 1). Se identificaron ocho haplotipos de tricópteros en los especímenes de Bolivia y uno en los de Perú.


Figura 1. Secuencia nucleotídica de CO-I (636 pb) de especímenes tricópteros bolivianos; HM = haplotipos del glaciar Mururata; HI = haplotipos del glaciar Illimani; HL = haplotipos del glaciar Larancagua

El mayor porcentaje de sustituciones de tipo transición (timinas y citosinas) observado es coherente con el patrón característico esperado del marcador mitocondrial CO-I. Dicho marcador CO-I permitió caracterizar dos clados entre las familias Limnephilidae y Lepidostomatidae (Fig. 2).


Figura 2. Árbol taxonómico molecular del orden Trichoptera en base al modelo de dos parámetros de Kimura (Kumur & Nei, 2000). Ilustra la capacidad del fragmento amplificado del gen CO-I (439pb) para la diferenciación taxonómica a nivel de género, familia, suborden y orden, así como la capacidad de diferenciación filogeográfica, donde HM01, HM02 = Mururata; HI03, HI04, HI05, HI06 = Illimani; HL07, HL08 = Larancagua; HP09 = Perú. Número de acceso del GenBank entre paréntesis.

DISCUSIÓN

En relación a la caracterización de dos clados entre las familias Limnephilidae y Lepidostomatidae, dentro de la primera se observaron tres subclados a nivel de género: 1) Anomalocosmoecus, 2) Antarctoecia, y 3) Limnephilus, Neophylax y otros que son propios de Apsinachus. Este último subclado contiene las familias limnefílidas Goeridae y Uenoidae las que al parecer, separan a los limnefílidos según su distribución, es decir entre el Norte y Sur de América. Goerita betteni (Goeridae) es del este y Neophylax acutus y Neophylax occidentis del oeste de Estados Unidos, aunque también existen otras especies en el Asia. Quizás estas especies fueron identificadas como miembros de otra familia por su distribución y algunas características morfo-anatómicas, pero pertenecen a la familia Limnephilidae, de acuerdo a la clasificación de Vineyard y Wiggins 1987. Nozaki et al. (2000) mencionan que la clasificación de las familias Uenoidae, Goeridae y Limnephilidae es muy incierta cuando la misma se basa en la anatomía de larvas, mientras que Zhou et al. (2011), mediante un estudio del CO-I, fortalecieron la existencia de las familias Uenoidae y Goeridae. Por tanto, se refuerza la necesidad de estudiar más a fondo el orden Trichoptera en Bolivia. El dendograma obtenido en el presente trabajo refleja no sólo la taxonomía tradicional sino también la distribución geográfica de tricópteros. Por la disponibilidad de la secuencia del espécimen peruano (HP09), únicamente se emplearon 439 pb para la construcción del dendograma. Pese a ello, las pruebas con dicho espécimen y sin él, ampliando el fragmento a 636 pb presentan el mismo árbol taxonómico, por tanto la misma información taxonómica molecular que se observa en la Fig. 1. Observando el polimorfismo de este marcador a nivel de especie, Lepidostoma contiene alrededor de 90 nts. diferentes entre una especie y otra. En Drusus, otra región del CO-I muestra que éste presenta una diferencia de 53 nts., y que la distancia genética entre especies oscila entre 0.030 - 1.000. En el presente estudio, Antarctoecia HI03 y HI04 presentan 35 nts. diferentes y una distancia igual a 0.0585. Por su parte, Smith (2005) identificó diferencias de un aminoácido entre dos especies cercanas de chicharras, en el presente estudio se identificaron diferencias aminoacídicas en las posiciones 92 y 161, donde se observan mutaciones de arginina a serina y de alanina a treonina. Sin embargo, las especies de Lepidostoma presentan cinco aminoácidos diferentes y Anomalocosmoecus ocho. Tanto el modelo de distancia genética como el valor de consistencia empleado revelan la utilidad del marcador CO-I en especies de tricópteros bolivianos. Esto permite postular posible presencia de especies o subespecies diferentes del género Antarctoecia, pero no asegura que efectivamente se trate de especies distintas, ya que el valor de divergencia no es tan alto como en otros individuos. Si bien Smith (2005) detectó sólo una diferencia aminoacídica, el comportamiento en este género y en este orden podría ser diferente, y por ello los resultados se deben contrastar con un estudio morfo-anatómico. Por otro lado, el patrón de los clados de Antarctoecia y Anomalocosmoecus es similar, y morfo-anatómicamente se identificó una especie distinta de Anomalocosmoecus en Perú, por lo que estos individuos podrían ser especies diferentes.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El presente trabajo es el primer estudio exploratorio de tricópteros bolivianos a nivel molecular. Se empleó una región del código de barras del ADN, que resultó ser efectivo para la clasificación de los especímenes estudiados a nivel de sub-orden, género y especie (Pauls, 2004; Smith, 2005; Haro et al., 2005; Bajpain & Tewari, 2010). Aunque esta región es conservada en su secuencia aminoacídica, presenta diferencias en las posiciones de sus aminoácidos de una especie a otra, lo que respalda su posible uso como marcador taxonómico a nivel de especie, y muestra una estructura que puede explicarse y cotejarse con la distribución geográfica de especímenes, por lo que se sugiere su uso también para estudios filogeográficos de estos insectos en el altiplano boliviano. Se recomienda realizar estudios morfo-anatómicos complementarios para verificar la presencia de las aparentes especies y subespecies caracterizadas genéticamente en el presente estudio para los géneros Antarctoecia, Anomalocosmoecus y Cailloma.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación se logró con el apoyo de la Unidad de Limnología del Instituto de Ecología de la Facultad de Cs. Puras y Naturales (UMSA), la Cooperación francesa IRD, el Centro de Investigaciones Genéticas de la Policía Nacional y la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés, La Paz, Bolivia.

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