ARTÍCULOS ORIGINALES

Desarrollo de germoplasma de soja sin lipoxigenasas y factores antinutricionales

Development of soya germplasm without lipoxigenases and antinutritional factors

 

Bologna S.B.¹, Rojas E.¹, Soldini D.O.², Gilli J.R.², Sequin L.², Martínez Alvarez D.L.¹

¹Universidad Nacional de San Luis, Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias Av. 25 de Mayo 384, Villa Mercedes (San Luis)
²Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, E. E. A. Marcos Juárez Ruta 12, Km 3, Marcos Juárez (Córdoba)
sbologna@hotmail.com.ar

Fecha de recepción: 13/10/2013
Fecha de aceptación de versión final: 28/03/2014

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RESUMEN

El principal objetivo de los programas de mejoramiento genético de soja ha sido el incremento del potencial productivo en tanto que se han dedicado menores esfuerzos al mejoramiento de las características que definen la calidad del grano. En el actual marco de globalización, los mercados comienzan a demandar alimentos con calidad diferencial para ofrecer productos con valor nutritivo y con características organolépticas aceptables. Con el objetivo de desarrollar germoplasma de soja con atributos de calidad, la E.E.A. INTA Marcos Juárez y la Universidad Nacional de San Luis (UNSL) llevan a cabo investigaciones que generan variabilidad para factores antinutricionales y lipoxigenasas, a fin de seleccionar genotipos nulos para dichos caracteres. En el año 2006, en la E.E.A. INTA Marcos Juárez se realizó un cruzamiento biparental entre un genotipo convencional -triple nulo para lipoxigenasas 1, 2 y 3- y una línea convencional nula para el inhibidor de la tripsina, portadora del gen Kti que previene la acumulación de los factores antinutricionales Kunitz. En el Departamento de Ciencias Agropecuarias de la UNSL, se desarrollaron poblaciones segregantes (F2-F6) y se estimaron parámetros genéticos. Se realizó selección asistida por marcadores moleculares (MAS) para detectar la ausencia de lipoxigenasas y factores antinutricionales. Por último se exploró la variabilidad en las líneas avanzadas seleccionadas y se las caracterizó agronómicamente. Los parámetros genéticos utilizados fueron eficientes herramientas para la selección de genotipos superiores en las poblaciones segregantes y la utilización de los marcadores moleculares diseñados facilitó la identificación rápida y eficiente de germoplasma sin lipoxigenasas y factores antinutricionales Kunitz.

Palabras clave: Mejoramiento genético; Calidad; Soja.

ABSTRACT

The main objective of soybean breeding programs has been to increase the productive potential of the crop, while less effort has been made for improvement of quality-related traits of the grain. In the current context of globalization, markets are beginning to demand foods with differential qualities to offer products with nutritional value and acceptable organoleptic characteristics. With the aim of developing soya germplasm with quality attributes, the E.E.A. INTA Marcos Juárez and the National University of San Luis (UNSL) are conducting investigations to generate variability for antinutritionals factors and lipoxygenases, in order to select null genotypes for these features. In 2006, in E.E.A. INTA Marcos Juárez, a biparental cross was carried out between two conventional genotypes, one triple null for lipoxygenases 1, 2 and 3 and, the other, null conventional for the trypsin inhibitor carrying the Kti gene that prevents accumulations of Kunitz antinutritionals factors. At the Department of Agricultural Sciences, UNSL, segregating populations (F2-F6) were developed and genetic parameters were estimated. Marker assisted selection (MAS) was performed to detect the absence of lipoxygenases and antinutritionals factors in the progenies. Lastly, variability was explored in the selected advanced lines, which were agronomically characterized. The used genetic parameters were efficient tools for the selection of superior genotypes in the segregating populations, and the designed molecular markers facilitated the fast and efficient identification of germplasm without lipoxygenases and Kunitz antinutritionals factors.

Key words: Breeding; Quality; Soybean.

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INTRODUCCIÓN

Hace más de un siglo que en la Argentina se desarrolla la agricultura para la producción de granos, como materia prima de uso directo o indirecto a través de sus derivados industriales. En las últimas décadas la evolución tecnológica relacionada con semillas, maquinarias y manejo del cultivo, sumada a las condiciones climáticas y edáficas, han promovido la intensificación y expansión de esta actividad.
El cultivo de la soja ha experimentado una expansión cuantitativa que, en términos de competitividad internacional demanda una expansión cualitativa basada en la producción de sojas especiales para nichos de mercados de materias primas con calidad diferencial (Soldini, 2004).
El consumo de alimentos de soja ha presentado un importante aumento en los últimos años, motivado fundamentalmente por la promoción de la calidad nutritiva del grano. Sin embargo, la mayoría de las variedades comerciales de soja no son adecuadas para la producción de alimentos porque presentan limitaciones en propiedades físicas, químicas o nutricionales. En consecuencia, la disponibilidad de variedades con atributos de calidad es prácticamente nula.
Los objetivos del mejoramiento genético se han ido redefiniendo para responder a las tendencias del mercado internacional, que marcan una creciente exigencia en la calidad nutricional en el sabor del grano y en el contenido de componentes nutracéuticos. Así se realiza selección para incrementar el contenido de proteínas, modificar el perfil de ácidos grasos, aumentar el contenido de isoflavonas, eliminar las lipoxigenasas, reducir los factores alergénicos, reducir el contenido de factores antinutricionales e incrementar el porcentaje de metionina, entre otros (Vicentini et al., 2009).
La soja cruda no puede ser utilizada como alimento para animales monogástricos debido a la presencia de factores antinutricionales (FAN). Uno de ellos es, el factor Kunitz (SKTI), el cual inhibe fuertemente la tripsina produciendo una disminución de la digestión y absorción de los alimentos (Armour et al., 1998). Otro efecto de este FAN es la inducción de una hipersecreción de enzimas pancreáticas y una rápida estimulación del crecimiento del páncreas, lo cual es conocido como hipertrofia e hiperplasia pancreática (Liener, 1995). El genoma de la soja contiene al menos diez genes diferentes para SKTI, los cuales son expresados diferencialmente durante el ciclo de la planta. El gen Kti3 codifica el SKTI predominante en semillas de soja. Se ha descubierto una mutación recesiva (kti) provocada por una sustitución y dos deleciones que alteran el proceso de traducción de la secuencia del alelo recesivo y evita la acumulación de SKTI en las semillas (Jofuku et al., 1989).
Por otro lado, la aceptación y palatabilidad del grano están condicionadas por el sabor amargo y astringente, producido en parte por compuestos que son el resultado de la acción enzimática de las lipoxigenasas. Estas enzimas catalizan la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados y constituyen cerca de 1 % del total de las proteínas presentes en el grano de soja (Siedow, 1991). Las semillas de soja contienen tres tipos de lipoxigenasas L-1, L-2 y L-3 controladas por tres genes Lx1, Lx2 y Lx3, y la ausencia de cada enzima está determinada por los alelos nulos lx1, lx2 y lx3 (Axelrodet al., 1981).
Con el objetivo de desarrollar germoplasma de soja con atributos de calidad, la EEA INTA Marcos Juárez y la UNSL, desarrollan investigaciones que generan variabilidad para factores antinutricionales y lipoxigenasas a fin deseleccionar genotipos nulos para dichos caracteres. En este marco se plantearon los siguientes objetivos específicos:
a. Estimar parámetros genéticos, coeficientes de correlación, y realizar el análisis de sendero en poblaciones segregantes;
b. Realizar selección asistida por marcadores moleculares para detectar la ausencia de lipoxigenasas y factores antinutricionales;
c. Explorar la variabilidad en las líneas avanzadas y caracterizarlas agronómicamente para seleccionar germoplasma de soja con atributos de calidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

En la campaña 2006/07, en la E.E.A. INTA Marcos Juárez se realizaron cruzamientos biparentales de germoplasma adaptado y exótico entre los genotipos BRM92-6600 y PI 542.044 (L81-4590).
BRM 92-6600 es un genotipo convencional, triple nulo para lipoxigenasas 1, 2 y 3, portador de los alelos lx1, lx2 y lx3 que regulan la ausencia de las lipoxigenasas y PI 542.044 (L81-4590) es una línea convencional, nula para el inhibidor de la tripsina, portador del gen Kti que previene la acumulación de los factores antinutricionales Kunitz.
En el invierno del 2007, la población F1 se avanzó en invernáculo con control de temperatura, foto período y humedad.
Por otro lado, en el Departamento de Ciencias Agropecuarias de la UNSL, en la ciudad de Villa Mercedes (San Luis), se desarrollaron las poblaciones segregantes (F2-F6) y se condujeron por el método de endocría "Single SeedDescent" (Descendencia de una Sola Semilla) en su versión modificada "Multiple Seed Descent" (Descendencia de Múltiples Semillas.
En la campaña 2007/08, se sembró la población F2 en un Diseño Completamente Aleatorizado (DCA) con dos repeticiones. Se registraron los estados fenológicos VE (emergencia) y R1 (inicio de floración) según la escala de Fehr et al.(1971) y se determinó el número de días a floración (NDF) y la altura de planta en cm. (AP). En el Laboratorio de Semillas y Granos de la UNSL, se obtuvo la productividad de granos ajustada a 13 % de humedad en gramos/planta (RTO), número de vainas/planta (NV) y el número de semillas/planta (NS).
Se estimó la varianza fenotípica (VF) y sus componentes a partir de la evaluación de la varianza ambiental (VE) incidente en la varianza fenotípica poblacional, mediante un análisis de la varianza (Tabla 1), en el cual k1 genotipos escogidos aleatoriamente de la población base se evaluaron en el DCA, de manera que cada genotipo estuvo repetido k2 veces. El modelo genético-estadístico fue el siguiente:

Yij = µ + Gi + Eij donde:
Yij= es la observación que corresponde al genotipo Gi en la j-ésima medición.
µ= es la media poblacional.
Gi = efecto del genotipo i.
Eij= el error de la observación.
(Steel y Torrie, 1985)

Tabla 1. Fuente de variación correspondiente al Análisis de la Varianza.

k1: número de genótipos, k2: número de repeticiones, V1: varianza 1, V2: varianza 2.

Se consideró que V2 es una estimación de la varianza ambiental promedio en la población. Entonces, la varianza genotípica poblacional (VG) puede estimarse a partir de la varianza observacional, consecuencia de la partición en el análisis de la varianza según: VG = V1 - V2 / k2
Se estimó el coeficiente de heredabilidad (h2) en sentido amplio según el modelo:
h2 = VG / VF, a partir del Método de Componentes de Varianza
h2 = (V1 - V2 / k2) / (V1 - V2 / k2) + V2
(Kempthorne, 1973)

Se calcularon los coeficientes de correlación simple de Pearson (r) y los Coeficientes de Sendero (Path Analysis) y se realizó la primera selección individual de plantas.
En la campaña 2008/09 se sembró la descendencia de cada planta F2 seleccionada (familias F3) y se evaluaron 81 progenies en un diseño en bloques al azar con dos repeticiones. Se registraron los estados fenológicos VE, R1 y R8 (madurez comercial) y se determinó NDF, NDM (número de días a madurez), AP, NV y RTO. Se realizó el análisis genético estimando VF, VG, VE y h2 y la selección entre y dentro de las familias.
En la campaña 2009/10 se avanzaron a campo las líneas F4 y se realizó la segunda selección entre y dentro de las familias.
Las semillas F5 de 128 líneas se sembraron en invernáculo para obtener material vegetal y realizar la extracción de ADN a partir de tejido foliar siguiendo el protocolo de Wining y Langridge (1991).
En el Laboratorio de Biotecnología de la E.E.A. INTA Marcos Juárez, se diseñaron marcadores moleculares funcionales codominantes para el gen Kti y los genes ligados Lx1/Lx2 (Sequin et al., 2008) y un marcador dominante que selecciona genotipos con al menos una copia del alelo lx3 (Sequin, 2009). Los marcadores moleculares para las características Lx1/Lx2, Lx3 y Kti fueron analizados siguiendo el protocolo previamente mencionado de Sequin et al.(2008) y de Sequin (2009).
En la campaña 2010/11 se realizó la selección asistida por los marcadores moleculares. Las familias F5 seleccionadas se sembraron en el campo con la finalidad de avanzar una generación y obtener un volumen suficiente de semilla para iniciar la evaluación agronómica de las líneas avanzadas.
Para caracterizar agronómicamente las líneas avanzadas, en la campaña 2011/12 se realizaron los ensayos preliminares y comparativos de rendimiento en un diseño experimental con bloques al azar con dos repeticiones. Se evaluaron 12 líneas F6 y tres testigos de los grupos de madurez (GM) III largo (SPS3900), IV corto (P94B73) y V medio (FN545) (Tabla 2).

Tabla 2. Líneas F6 y testigos.

lx2: alelo recesivo lipoxigenasa 2, lx3: alelo recesivo lipoxigenasa 3, kti: alelo recesivofactor antinutricional Kunitz, GM: grupo de madurez

A partir de las variables RTO, peso de 100 semillas (PS), AP, NDF y NDM, se realizaron análisis de la varianza con test de Tuckey y análisis de componentes principales para caracterizar las líneas agronómicamente y explorar la variabilidad para las mencionadas variables. A los efectos de clasificar los genotipos en base a las variables fenológicas, se realizó un análisis de conglomerados utilizando como medida de proximidad la distancia Euclidea.
Los valores de medias correspondientes a todos los caracteres evaluados se analizaron estadísticamente con el programa InfoGen/P Versión 2008 (Balzarini y Di Rienzo, 2008).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la población F2 el análisis de la varianza detectó diferencias altamente significativas (p<0,01) entre los genotipos para todas las variables, excepto para RTO que mostró diferencias significativas (p<0,05) (Tabla 3). Estas diferencias indican que existe un potencial de variabilidad que posibilitará una selección efectiva para los caracteres relacionados con la productividad como NV, NS y RTO.

Tabla 3. Cuadrados medios y valores de F de la población F2.

**p<0,01. * p<0,05. NDF: número de días a floración, AP: altura de planta, NV: número de vainas/planta, NS: número de semillas/vaina, RTO: rendimiento de grano.

Las varianzas fenotípicas, genotípicas y ambientales, y los coeficientes de heredabilidad de todos los caracteres evaluados se presentan en la Tabla 4. En general se obtuvieron valores de heredabilidad altos para los caracteres relacionados con la productividad. Otros autores (Morceli et al., 2006; Sarti et al., 2006) han reportado valores similares en poblaciones segregantes de soja, aduciendo que dichos resultados se deben a la alta varianza genotípica y a la superioridad de algunos genotipos en relación a la media de la población. Los resultados obtenidos también coinciden con los informados por Bologna et al. (2009b), quienes en una población F2 de soja con atributos de alto contenido de proteína, estimaron valores de heredabilidad en sentido amplio para RTO y NS superiores a 50 %.

Tabla 4. Parámetros genéticos de la población F2.Variables

NDF: número de días a floración, AP: altura de planta, NV: número de vainas/planta, NS: número de semillas/vaina, RTO: rendimiento de grano. VG: varianza genética, VE: varianza ambiental, VF: varianza fenotípica y h2 heredabilidad.

El coeficiente de correlación simple de Pearson fue significativo (p<0,05) entre RTO y las variables NV (r=0,52) y NS (r=0,42), lo que se observa en el análisis de sendero como r total (Tabla 5).

Tabla 5. Coeficientes de Sendero (Path Analysis) en la población F2.

RTO: rendimiento de grano, NDF: número de días a floración, AP: altura de planta, NV: número de vainas/planta, NS: número de semillas/vaina.

El coeficiente de sendero entre RTO y NV muestra que la correlación directa entre estas variables fue de 0,90, en tanto que las correlaciones indirectas vía las variables NDF y AP fueron negativas y de una magnitud de -0,25 y -0,13 respectivamente. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Valencia Ramírez y Ligarreto Moreno (2013) quienes, en variedades de soja, encontraron correlaciones positivas entre dichas variables, principalmente debidas a efectos directos.
La correlación entre RTO y NS fue debida, principalmente, a efectos indirectos positivos vía las variables NDF y NV, con valores de 0,24 y 0,13 respectivamente (Tabla 5). Estos resultados indican que la estrategia más apropiada de selección indirecta para RTO es vía NV.
Basándonos en los resultados obtenidos se realizó selección de planta individual y se sembró su descendencia.
En la población F3 el análisis de la varianza detectó diferencias significativas (p<0,05) entre las familias para todos los caracteres evaluados (Tabla 6).

Tabla 6. Cuadrados medios, significancia y valores de F para las familias F3

*significación p<0,05. NDF: número de días a floración, NDM: número de días a madurez, AP: altura de planta, NV: número de vainas/planta, RTO: rendimiento de grano.

Los valores de varianza genética fueron superiores a los de varianza ambiental, por lo que se obtuvieron coeficientes de h2 elevados (Tabla 7).

Tabla 7. Parámetros genéticos de las familias F3

NDF: número de días a floración, NDM: número de días a madurez, AP: altura de planta, NV: número de vainas/planta, RTO: rendimiento de grano. VG: varianza genética, VE: varianza ambiental, VF: varianza fenotípica y h2 heredabilidad.

Monteverde (1984) evaluando 3 poblaciones F3de soja, obtuvo valores de heredabilidad en sentido amplio más altos para NDM (82,7; 78,25; 62,35), pero más bajos para RTO (53,75; 33,90; 11,38) que los estimados en el presente trabajo. Los resultados de Costa et al. (2002) en poblaciones segregantes de soja son coincidentes en relación al coeficiente de heredabilidad para AP (0,25), pero difieren para NV, dado que estos autores informaron valores menores (0,31).
De 95 de las 128 líneas F5 seleccionadas se extrajo el ADN para realizar la selección asistida. Utilizando el marcador para Lx2 se seleccionaron 40 familias que resultaron nulas para las lipoxigenasas 1 y 2 (Figura 1).

Figura 1. Marcador para Lx2. Calles 1-13: individuos analizados, 14: progenitor mutante, 15: progenitor normal, 16: heterocigota.

Por medio del marcador para el alelo lx3 se pudieron seleccionar 56 familias que al menos llevan una copia de este alelo (Figura 2). Debido al avance de las generaciones analizadas, es posible afirmar que éstas serían nulas para la lipoxigenasa 3 debido al grado de homocigosis alcanzado.

Figura 2. Marcador para lx3. Calles 1-26: individuos analizados, 27: progenitor normal, 28: progenitor mutante.

La selección realizada por el marcador molecular para Kti permitió identificar 50 familias nulas para Kunitz (Figura 3).

Figura 3. Marcador para Kti. Calles 1-8: individuos analizados, 9: progenitor normal, 10: progenitor mutante, 11: Línea experimental.

Nueve familias resultaron nulas para ambas características, por lo que fueron seleccionadas para continuar con el proceso de mejoramiento. Se identificaron 14 familias que contienen doble copia de los tres alelos mutantes para lipoxigenasas y 51 familias que llevan doble copia del alelo mutante para Kunitz pero que son normales para las tres lipoxigenasas. Otras familias portan combinaciones de las características buscadas, 19 familias nulas para Kunitz y para lipoxigenasa 3, y 6 familias nulas para Kunitz y para lipoxigenasas 1 y 2. Moraes et al. (2002) por medio de retrocruzamientos asistidos por marcadores moleculares obtuvieron líneas de soja con ausencia de los inhibidores de tripsina Kunitz, a través de la selección de individuos que presentaban bandas (alelos recesivos). El fenotipo fue confirmado por electroforesis, dado que los patrones permitieron distinguir los individuos homocigotas recesivos de los heterocigotas.
Si bien se encontraron familias con doble copia de los alelos mutantes para las características deseadas, éstas deberían ser sometidas a nuevos programas de mejoramiento para introgresar otros genes importantes. Esto se debe a que los individuos de las familias seleccionadas aún mantienen actividad inhibitoria de tripsina, debido a la presencia de otros FAN como por ejemplo el Bowman Birk, y aún contendrían sabor rancio y amargo en sus aceites como consecuencia de la oxidación, aunque más lenta, de los ácidos grasos poliinsaturados.
En las líneas F6, el análisis de la varianza arrojó diferencias muy significativas (p<0,001) para las variables RTO y PS. Según el test de Tukey, el testigo SPS3900 superó en RTO al resto de los materiales evaluados y las líneas 1513.2; 1535.1; 1579.2 y el testigo FN545 fueron estadísticamente iguales, ocupando el segundo puesto. En cuanto a la variable PS la línea 1535,1 fue estadísticamente superior y en segundo lugar, estadísticamente iguales, se ubicaron las líneas 1527.1; 1560.2; 1524.2; 1528.1 y el testigo SPS3900.
El análisis de componentes principales explicó 78,5% del total de la variación entre las dos primeras CP. Según la CP1, las líneas 1554.2 y 1579.2 se asocian a las variables NDF, NDM y AP y se diferencian de la línea 1542.2. Las líneas 1528.1; 1534.2; 1560.2 y 1535.1 están asociadas a las variables RTO y PS. La CP2 separa al testigo FN545 (GM V medio) y la línea 1512,1 de los testigos SPS3900 (GM III largo) y P94B73 (GM IV corto), y las líneas 1534.2; 1528,1. En cuanto a la relación entre las variables se observa correlación positiva entre todas, excepto entre RTO y NDF, que no presentan correlación (Figura 4). En 2006, Gill-Langarica et al., caracterizando 108 genotipos de soja, también detectaron correlación positiva entre RTO y PS. En contraste, Bologna et al. (2009a), trabajando con líneas avanzadas de soja seleccionadas por contenido de aceite, no detectaron correlación entre dichas variables.

Figura 4. Biplot para las líneas F6. Los triángulos representan las líneas F6 y los círculos las variables: NDF: número de días a floración, NDM: número de días a madurez, AP: altura de planta, RTO: rendimiento de grano, PS: peso de semillas.

Los resultados del agrupamiento jerárquico se visualizaron en un dendrograma, en el que se determinaron tres conglomerados. En el grupo 1 se encuentran dos líneas que no se asocian a ningún testigo, en el grupo 2 se ubica el testigo del GM V medio (FN545) con una línea y en el grupo 3, los testigos de los GM IV corto y III largo (P94B73 y SPS3900) con las nueve líneas restantes (Figura 5). Bologna et al. (2012) evaluando líneas F6 de soja seleccionadas por contenido de proteína, también lograron determinar el grupo de madurez de dicho germoplasma a través de un análisis de conglomerados que permitió asociar el ciclo de las líneas con el de los testigos evaluados.

Figura 5. Dendrograma resultante del análisis de conglomerado aplicado sobre las líneas F6.
Los datos incluyen las variables de ciclo: NDF: número de días a floración, NDM: número de días a madurez.

Se destaca que las dos líneas que se separaron a nivel de la CP1 asociándose con las variables NDF y NDM coinciden con las que se agruparon sin testigos en el análisis de conglomerado; esto último sugiere que el ciclo de dichas líneas no se corresponde con el ciclo de ninguno de los testigos evaluados, ya que éstas presentan ciclos más largos.
Por otro lado, del mismo modo que en el ACP se visualizaba una fuerte asociación entre los testigos SPS3900 y P94B73 con las líneas 1534.2 y 1528.1, en la matriz de distancias Euclídeas, estos materiales presentaron los menores valores. Esto sugiere que dichas líneas no solo pertenecen a estos grupos de madurez sino que también se asemejan a los testigos en el resto de las variables.

CONCLUSIONES

Los parámetros genéticos utilizados fueron eficientes como herramientas para la selección de los genotipos superiores en las poblaciones segregantes.
Los coeficientes de heredabilidad en sentido amplio para los caracteres de productividad fueron en general superiores a 50 %, lo que indica una situación favorable para la selección por dichos caracteres.
La estrategia más apropiada de selección indirecta para RTO es vía NV.
La utilización de los marcadores moleculares diseñados facilitó la identificación rápida y eficiente de germoplasma con ausencia de lipoxigenasas y de factores antinutricionales Kunitz.
De las líneas que expresaron mayor RTO y PS, una presenta ciclo similar al del testigo del GM V medio y tres a los testigos de los GM III largo y IV corto.
La variabilidad generada para los caracteres de calidad permitió la obtención de germoplasma sin lipoxigenasas y factores antinutricionales Kunitz.

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